間充質(zhì)干細胞體外修復DCD供肝的研究

尹明麗，史源，楊洋，鄭衛(wèi)萍，沈中陽，宋紅麗（.天津醫(yī)科大學一中心臨床學院，天津 3009；.天津市第一中心醫(yī)院器官移植科，天津市器官移植重點實驗室，天津3009）

隨著肝移植技術(shù)的發(fā)展成熟和抗排斥藥物的不斷更新，肝移植已經(jīng)成為各種終末期肝病患者最有效的治療方法［1］。由于需要接受肝移植患者的不斷增加，供肝的短缺問題日漸顯著［2］。為了解決供肝短缺問題，心臟死亡器官捐獻（donation after cardiac death，DCD）肝臟已成為我國肝移植的重要來源［3］。DCD供體可以擴大供體池［4］，同時邊緣性供肝作為擴大供肝來源的辦法已越來越受到重視［5］。

DCD供肝存在熱缺血時間長、移植物損傷嚴重和術(shù)后受體生存時間短等問題。缺血/再灌注是導致DCD供肝功能損傷的重要原因，目前尚缺乏有效的治療手段［6］。研究發(fā)現(xiàn)，使用機械灌注的方法保存供肝能夠減少供肝的缺血/再灌注損傷（ishemia reperfusion injury，IRI），從而改善肝移植的效果［7］，而常溫機械灌注（normothermic mechanical perfusion，NMP）能夠提供更多的氧和營養(yǎng)物質(zhì)，從而改善邊緣供肝移植術(shù)后的效果［8］。肝竇內(nèi)皮細胞在缺血/再灌注的早期即可出現(xiàn)結(jié)構(gòu)及功能的損害［9］，但NMP并不能修復肝竇內(nèi)皮細胞等的損傷，因此，還需要增加一種方法在進行NMP的同時對肝臟進行修復。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）對IRI的肝臟具有明確的保護和修復的作用［10］。本研究在NMP系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，引進BMMSCs，研究其在NMP下對DCD肝臟的影響結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 BMMSCs的獲?。簾o菌提取BMMSCs，培養(yǎng)到第3代，進行檢測［11］。

1.2 實驗動物及分組：2～3周體重為40～60 g的健康雄性Wistar大鼠用于提取BMMSCs，5～8周體重為180～200 g健康的雄性Wistar大鼠用于DCD模型的建立。所有動物均由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，標準鼠食喂養(yǎng)。所有實驗動物操作均遵循實驗動物倫理條例，并由天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會批準進行。實驗分組：隨機分成3組，A組為冷保存組（n＝5）、B組為單純NMP組（n＝5）、C組為NMP＋BMMSCs組（n＝5）。

1.3 動物模型的建立：取Wistar大鼠，單籠飼養(yǎng)，禁食12小時以上。腹腔麻醉后，充分暴露肝臟，下腔靜脈注射0.4 ml（400 U）的肝素生理鹽水［12］，除去肝周圍不用的組織，分離出門靜脈、下腔靜脈及膽總管，夾閉胸主動脈，計時45分鐘。結(jié)束時快速進行門靜脈、下腔靜脈以及膽總管的插管。B組采用UW液進行冷保存，另兩組進行機械灌注，C組在進行NMP前在器官室內(nèi)從門靜脈注射 BMMSCs 1ml（5×106個 /ml）。門靜脈連接到膜肺的動脈出口，下腔靜脈連接到膜肺的靜脈入口。門脈壓力灌注壓力一般控制在5～8 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）［8］，本實驗灌注壓力控制在5.5 mmHg監(jiān)護儀持續(xù)監(jiān)控，灌注速度為4 ml/min。灌注液是含有10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液、1%雙抗混合液以及5%的自體全血。

1.4 血生化儀檢測血清肝功能酶的變化情況：出口閥抽取灌注液進行肝功能酶丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspertate aminotransferase，AST）的分析，同時抽取A組肝下下腔靜脈的保存液進行分析。

1.5 血氣分析儀檢測灌注液血氣的變化情況：灌注過程中每小時從入口閥和出口閥抽取灌注液進行血氣分析，觀察各項指標。通過分析血氣檢測結(jié)果，計算灌注過程中肝臟的耗氧量。

1.6 組織形態(tài)學觀察肝臟的情況：觀察各組肝臟的外觀情況。每組樣本取自左外側(cè)葉，浸在4%的甲醛溶液中，制成組織切片進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色，光學顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMMSCs的檢測情況：培養(yǎng)BMMSCs到原代（圖1a）和3代（圖1b）分別拍照觀察細胞狀態(tài)，流式細胞術(shù)測得細胞表面標記表達率，檢測顯示第 3代 Wistar大 鼠 BMMSCs CD29、CD90、RT1A表達的陽性率分別為96.7%、95.5%和95.0%；而CD34、CD45、RT1B均為陰性，陰性率均＞95%（圖1），體外獲得的細胞是BMMSCs。

圖1 BMMSCs細胞生長狀態(tài)（a、b）和流式檢測結(jié)果（c、d、e）

2.2 各組ALT和AST的情況（圖2）：三組在機械灌注/冷保存前處于相同的狀態(tài)，ALT和AST之間無明顯的差異。實驗后4小時發(fā)現(xiàn)B組ALT和AST水平明顯低于A組（均P＜0.05；）；C組ALT和AST水平明顯低于B組（均P＜0.05）；C組明顯低于A組（均P＜0.05）。NMP聯(lián)合BMMSCs的修復作用明顯優(yōu)于單純NMP和冷保存的作用。

圖2 各組丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶

2.3 B組和C組在灌注過程中耗氧量的變化情況比較（圖3）：兩組開始灌注時耗氧量快速增加，灌注0小時和1小時兩組之間沒有差異（均P＞0.05）；灌注的第2小時C組明顯高于B組（P＜0.05）；在灌注3小時和4小時耗氧量增加減慢，但C組仍明顯明高于B組（均P＜0.05）。NMP聯(lián)合BMMSCs能夠更好地修復DCD肝臟，使更多的肝細胞恢復活性。

圖3 灌注組耗氧量的變化情況

圖4 各組肝臟匯管區(qū)組織學的情況（HE染色 低倍放大）

2.4 肝臟組織學（圖4）：肝臟熱缺血45分鐘后肝臟出現(xiàn)嚴重的損傷，肝竇淤血擴張、小葉間動靜脈和小葉間膽管有明顯的擴張，部分肝細胞有空泡樣改變、點狀壞死和灶狀壞死（圖4b）。A組熱缺血4小時肝臟損傷加重，肝竇縮窄、小葉間動靜脈和小葉間膽管官腔明顯縮窄變形，匯管區(qū)塌陷，肝細胞空泡樣變性加重（圖4c）。B組熱缺血4小時較A組肝竇、小葉間靜脈明顯擴張，匯管區(qū)明顯改善（圖4d）；且肝細胞腫脹程度較熱缺血45分鐘的肝臟明顯降低。C組熱缺血4小時肝竇、小葉間動靜脈和小葉間膽管輕微擴張，匯管區(qū)已基本恢復正常，肝臟實質(zhì)細胞仍有輕微的空泡樣變（圖4 e）；肝臟得到了明顯的改善，且效果明顯優(yōu)于冷保存組和NMP組。

2.5 形態(tài)學的情況：正常大鼠肝臟色澤紅潤，呈鮮紅色（圖5a）。熱缺血45分鐘的肝臟出現(xiàn)嚴重的淤血（圖5b），肝臟呈現(xiàn)暗紅色，這也是缺血損傷的標志。灌注過程中肝臟色澤發(fā)生明顯改變，C組4小時肝臟紅潤（圖5e），B組4小時肝臟色澤變白（圖5d）。C組肝臟的形態(tài)明顯好于B組。而A組4小時肝臟色澤暗淡，表面出現(xiàn)花斑，明顯次于灌注組的肝臟（圖5c）。這提示NMP聯(lián)合BMMSCs能更好修復DCD肝臟組織結(jié)構(gòu)。

圖5 各組肝臟形態(tài)學的情況

3 討 論

肝移植是終末期肝病最有效的治療方案［13］，由于供肝短缺，阻礙了肝移植事業(yè)的發(fā)展。隨著臨床DCD供肝的使用，使得供肝匱乏的問題在一定程度上得以解決，并且擴大了可移植器官的范圍，使供體數(shù)量增加了10%～20%［14］，但DCD供肝存在IRI問題，致使發(fā)生原發(fā)性移植肝無功能及移植肝功能障礙的風險增加。IRI是由缺血的組織或器官重新恢復血流灌注而導致的組織結(jié)構(gòu)、功能及代謝的變化，這些變化造成組織水腫、出血和壞死等。因此，減少DCD供肝的IRI至關(guān)重要，臨床工作中應(yīng)運用多種方式最大限度地降低DCD供肝IRI的發(fā)生，可以通過改善DCD供肝的獲取途徑、保存方式、微循環(huán)和減少DCD供肝的炎癥反應(yīng)等。目前，臨床上常用的減少IRI損傷的方法主要有缺血預(yù)處理，藥物治療及器官保存方法的改進。缺血預(yù)處理和藥物治療只能在一定程度上緩解DCD供肝的IRI，并不能從根本上解決問題［15］。因此，找到一種新的器官保存方法進而改善DCD供肝的IRI是急需要解決的問題。BMMSCs是一類具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞［16］。BMMSCs可通過旁分泌或趨化富集于IRI受損器官，抗凋亡、促進血管生成、促進干細胞及祖細胞增殖分化、介導免疫調(diào)節(jié)、趨化到受損部位修復受損組織，從而發(fā)揮治療作用［17］。本研究在NMP的同時加入BMMSCs，BMMSCs（從門靜脈直接進入肝臟） 直接作用于肝臟，進而修復DCD供肝。

有研究顯示，大鼠熱缺血時間超過45分鐘時，術(shù)后受體雖獲得了短期的存活時間但生存時間很短，而熱缺血60分鐘時，供肝已發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷［18］。冷保存對DCD供肝的損傷嚴重，Mathur等［19］研究發(fā)現(xiàn)冷缺血時間每延長1小時，移植物功能障礙的發(fā)生率將增加6%，Mathur等［20］認為冷保存時間應(yīng)＜4小時。NMP能夠明顯改善DCD供肝的微循環(huán)［20-21］，對于供肝細胞的復蘇非常重要［22］。Xu等［7］的研究結(jié)果顯示，經(jīng)過4小時機械灌注肝臟得到了很大的修復，功能得到很好的改善。因此，我們通過預(yù)實驗驗證，最終選取熱缺血45分鐘做為本實驗的DCD模型，灌注/冷保存4小時做為本實驗的觀察時間點，含有5%血清的細胞培養(yǎng)液做為循環(huán)液，進行實驗觀察實驗效果。

冷保存4小時肝臟外觀淤血呈暗紅色、病理表現(xiàn)肝細胞水腫并嚴重壞死、ALT和AST含量持續(xù)增高，說明肝臟的損傷程度嚴重；采用單純的NMP，4小時肝臟的淤血情況得到很好的改善，色澤變白，肝臟病理顯示肝細胞水腫程度降低，ALT和AST水平降低；而NMP聯(lián)合BMMSCs修復，4小時肝臟的外觀色澤更紅潤光亮，病理表現(xiàn)中央靜脈區(qū)和匯管區(qū)輕微異常，ALT和AST含量明顯降低且顯著低于NMP 4小時，說明NMP聯(lián)合BMMSCs能夠改善肝竇微循環(huán)和修復肝臟功能。 機械灌注兩組耗氧量的比較也證實了這一點，NMP+BMMSCs組的耗氧量在1小時后均明顯的高于NMP組，說明在同一灌注時間下，NMP聯(lián)合BMMSCs能夠使更多的肝臟細胞得到修復，使更多的肝臟細胞恢復活性。

含氧血液做為灌注液進行NMP可以顯著改善DCD供肝的功能［23］。為了更好地修復DCD供肝，循環(huán)液的成分需要進一步的改進。同時修復時間也有待進一步延長和優(yōu)化。DCD供肝后的IRI目前缺乏有效的針對性治療手段，BMMSCs在其中的應(yīng)用拓展了細胞治療的應(yīng)用范圍，并為更多的DCD供肝應(yīng)用于臨床提供了可能的治療手段。

總之，本研究顯示常溫機械灌注能夠修復DCD熱缺血45分鐘的肝臟，常溫機械灌注聯(lián)合BMMSCs能夠更好地修復受損的肝臟，這將為如何更好地修復DCD供肝并應(yīng)用于臨床提供新的重要思路。