一種金針菇水提液多糖含量的檢測方法

張 劍，弓志青，王文亮，賈鳳娟，崔文甲，王月明

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟南250100；2.山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室，山東濟南250100）

一種金針菇水提液多糖含量的檢測方法

張 劍1，2，弓志青1，2，王文亮1，2，賈鳳娟1，2，崔文甲1，2，*王月明1，2

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟南250100；2.山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室，山東濟南250100）

以金針菇子實體為原料，運用熱水浸提的方法提取金針菇多糖，采用苯酚硫酸法及3,5-二硝基水楊酸法分別測定水提液中的總糖及還原糖含量，以總糖和還原糖之差表示多糖含量，并進行方法學(xué)考查。結(jié)果表明，該方法樣品處理簡單，具有良好的適應(yīng)性，其精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率均符合要求，可用于金針菇水提液多糖含量的測定。

苯酚硫酸法；3,5-二硝基水楊酸法；金針菇多糖

金針菇（Flammulina velutipes）又名冬菇、樸菇、構(gòu)菌、青杠菌、毛柄金錢菌，隸屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）金錢菌屬（Flammulina），在自然界分布廣泛，中國、日本、俄羅斯和澳大利亞等國均有分布，目前已經(jīng)發(fā)展成為僅次于白蘑菇和香菇的第三大食用菌[1]。金針菇菌蓋滑嫩，菌柄細長脆嫩，形美，味鮮，富含蛋白質(zhì)、多種維生素及鈣、鐵、磷等礦物質(zhì)，是世界上著名的食藥兩用菌和觀賞菌。其中，精氨酸和賴氨酸含量豐富，對兒童智力發(fā)育有重要作用，因此享有“增智菇”的美稱[2]。

金針菇多糖是金針菇主要的活性物質(zhì)之一，具有抗腫瘤、保肝臟、抗氧化、抗衰老、提高機體免疫力等多種生理功效。目前，國內(nèi)外學(xué)者對金針菇多糖的研究主要集中在分離純化、結(jié)構(gòu)及其修飾、生物活性功能、產(chǎn)品開發(fā)等方面[3]，金針菇多糖方便快速準(zhǔn)確的測定是上述研究工作的基礎(chǔ)。目前，常用的多糖含量測定方法有苯酚硫酸法[4-6]、蒽酮硫酸法[7]以及3,5-二硝基水楊酸法（DNS法）[8]。由于前2種方法無法排除單糖等還原糖的影響，導(dǎo)致測量結(jié)果偏高；而DNS法測定多糖時需要水解，很難量化水解是否完全，且操作比較繁雜[9]。將二者相結(jié)合則可準(zhǔn)確快速地測定多糖含量[10-12]，但用于金針菇多糖的檢測尚未見相關(guān)報道。試驗以金針菇為原料，采用苯酚硫酸法和DNS法分別測定金針菇水提液中的總糖和還原糖含量，二者之差即為多糖含量，并對2種方法進行了方法學(xué)考查，旨在建立一種簡便、可精確測定金針菇水提液多糖含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金針菇，購于濟南華聯(lián)超市；葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；重蒸酚，北京索萊寶科技有限公司提供；硫酸，萊陽經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)精細化工廠提供；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV-160型紫外分光光度計，日本島津公司產(chǎn)品；UV6000型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；AR423CN型電子天平，奧豪斯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；LXJ-IIB型高速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；DK-8D型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；ZN-20L型小型粉碎機，北京興時利和科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.2 溶液配制

1.2.1 苯酚溶液配制

配制80%的苯酚母液，于4℃冰箱中保存，用于配制6%苯酚溶液。

1.2.2 DNS試劑配制

A液：溶解6.9 g重蒸酚于15.2 mL 10%氫氧化鈉中，并稀釋至69 mL，在此溶液中加6.9 g亞硫酸氫鈉。B液：稱取255 g酒石酸鉀鈉，加到300 mL 10%氫氧化鈉中，再加入880 mL 1%DNS溶液。將A液與B液相混合即得黃色試劑，貯藏于棕色試劑瓶中，在室溫下放置7 d后過濾使用[13]。

1.3 試驗方法

1.3.1 金針菇水提液的制備

將金針菇子實體于60℃烘箱中烘干，粉碎過80目篩。準(zhǔn)確稱取1.000 g金針菇粉末，按1∶30的料液比加入蒸餾水，于90℃下水浴浸提4 h，取出后以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心20 min去沉淀，取上清液備用。將上清液稀釋一定倍數(shù)用于總糖含量檢測，原液用于還原糖含量檢測。

1.3.2 苯酚硫酸法測定總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精確稱取烘干至恒質(zhì)量的葡萄糖粉末0.500 g，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，得到5 mg/mL的溶液，取1 mL上述溶液并稀釋定容至50 mL，得到0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1，2，3，4，5，6 mL至10 mL容量瓶中定容，依次得到質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06 mg/mL的溶液，分別向每個反應(yīng)試管中加入2 mL上述質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液，空白對照管為2 mL蒸餾水，再加入1 mL 6%苯酚，振蕩混勻，快速加入5 mL濃硫酸，振蕩搖勻，放入沸水浴中15 min，反應(yīng)完畢后迅速用冷水降溫，穩(wěn)定至室溫后于波長490 nm處測吸光度[14]。

1.3.3 DNS法測定還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精確稱取烘干至恒質(zhì)量的葡萄糖粉末0.100 g，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，得到1.0 mg/mL的溶液，準(zhǔn)確吸取1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2， 0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL分別置于25 mL比色管中，用蒸餾水補充至2.0 mL，空白對照為2.0 mL蒸餾水，各加入2.0 mL DNS試劑，迅速振蕩搖勻，沸水浴5 min，冷水冷卻至室溫，定容至25 mL，靜置30 min后于波長520 nm處檢測。

1.3.4 多糖含量測定

分別運用苯酚硫酸法、DNS法檢測總糖和還原糖的含量，二者之差即為多糖含量，即多糖含量=總糖含量-還原糖含量。

1.3.5 精密度試驗

精密吸取總糖及還原糖供試品溶液各6份，分別按1.3.2和1.3.3項中方法操作，測定吸光度，考查苯酚硫酸法、DNS法的精密度。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取總糖和還原糖供試品溶液各6份，分別按1.3.2和1.3.3項中方法操作，在0，10，20，30，40，50，60，90 min測定吸光度，考查苯酚硫酸法及DNS法的穩(wěn)定性。

1.3.7 加樣回收率試驗

精確吸取總糖含量已知的提取液6份各1 mL，精確加入1 mL 0.04 mg/mL的葡萄糖溶液，按1.3.2項下方法操作，測定吸光度，并計算苯酚硫酸法的加樣回收率；精密吸取還原糖含量已知的提取液6份各1 mL，精確加入1 mL 0.5 mg/mL的葡萄糖溶液，按1.3.3項下方法操作，測定吸光度，并計算DNS法的加樣回收率。

1.3.8 金針菇水提液多糖含量測定

取6份金針菇水提液，按1.3.2和1.3.3項下方法操作，測定的吸光度帶入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計算出總糖及還原糖含量，二者之差為多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚硫酸法測定總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，線性回歸方程為Y=0.0156X+0.00329，R2=0.999 8，在0.01～0.06 mg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.2 DNS法測定還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

由圖2可知，線性回歸方程為Y=1.671 6X-0.049，R2=0.999 9，在0.1～0.7 mg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.3 精密度試驗

苯酚硫酸法測定總糖精密度試驗見表1，DNS法測定還原糖精密度試驗見表2。

圖2 DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 苯酚硫酸法測定總糖精密度試驗

表2 DNS法測定還原糖精密度試驗

由表1和表2可知，苯酚硫酸法測定總糖和DNS法測定還原糖精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

苯酚硫酸法測定總糖穩(wěn)定性試驗見表3，DNS法測定還原糖穩(wěn)定性試驗見表4。

表3 苯酚硫酸法測定總糖穩(wěn)定性試驗

表4 DNS法測定還原糖穩(wěn)定性試驗

由表3和表4可知，苯酚硫酸法測定總糖顯色在90 min內(nèi)較穩(wěn)定，DNS法測定還原糖顯色在90 min內(nèi)較穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率試驗

苯酚硫酸法測定總糖加樣回收率試驗見表5，DNS法測定還原糖加樣回收率試驗見表6。

由表5和表6可知，苯酚硫酸法測定總糖和DNS法測定還原糖加樣回收率較好。

表5 苯酚硫酸法測定總糖加樣回收率試驗

表6 DNS法測定還原糖加樣回收率試驗

2.6 金針菇水提液多糖含量測定

金針菇水提液多糖含量測定見表7。

表7 金針菇水提液多糖含量測定

由表7可知，苯酚硫酸法聯(lián)合DNS法測定金針菇水提液中多糖結(jié)果穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論

金針菇多糖含量測定，是多糖研發(fā)以及相關(guān)產(chǎn)品品質(zhì)控制的前提。許多研究者采用苯酚硫酸法或者蒽酮硫酸法來測定金針菇多糖含量，而這2種方法測定的含量均高于多糖的實際含量，因為測定的是包括還原糖在內(nèi)的總糖含量[15]。要精確測定多糖的含量，必須首先去掉還原糖，可以采用透析或者醇沉的方法，這樣就增加了試驗操作。若直接對水提液進行多糖含量測定可簡化試驗流程，試驗采用苯酚硫酸法聯(lián)合DNS法檢測金針菇水提液中的總糖及還原糖含量，多糖含量為總糖和還原糖含量差值，排除了單糖等還原糖的干擾，測得準(zhǔn)確的多糖含量。經(jīng)過方法學(xué)驗證，該法比較準(zhǔn)確、穩(wěn)定，適合金針菇水提液多糖含量測定，同時也為其他材料水提液多糖含量的測定提供參考。

[1]劉孝勇，陳蕾蕾，裘紀(jì)瑩，等.金針菇多糖研究進展[J].中國食物與營養(yǎng)，2012，18（5）：63-67.

[2]王文亮，徐同成，劉麗娜，等.金針菇的保健功能及其開發(fā)前景[J].中國食物與營養(yǎng)，2011，17（7）：18-19.

[3]王衛(wèi)國，張仟偉，李瑞靜，等.金針菇多糖的生理功能及其應(yīng)用研究進展[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016，37（1）：120-128.

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[9]張志君，孫偉，李永亮，等.3,5-二硝基水楊酸法聯(lián)合苯酚-硫酸法測定不同產(chǎn)地黃精中多糖含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（6）：106-109.

[10]毛淑敏，許家珍，周帥飛，等.苯酚-硫酸法聯(lián)合DNS法測定金銀花不同花期多糖的含量[J].中南藥學(xué)，2015，13（1）：65-67.

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[15]方積年，丁侃.多糖的研究開發(fā)中值得注意的一些問題[J].食品與藥品，2007，9（12）：1-4.◇

Method for Detecting Polysaccharide in Water Extraction from Flammulina Velutipes

ZHANG Jian1，2，GONG Zhiqing1，2，WANG Wenliang1，2，JIA Fengjuan1，2，CUI Wenjia1，2，*WANG Yueming1，2
（1.Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，SAAS，Ji'nan，Shandong 250100，China；2.Shandong Provincial Key Laboratory of Agro-Products Processing Technology，Ji'nan，Shandong 250100，China）

Using Flammulina velutipes fruiting body as raw material，the Flammulina velutipes polysaccharide is extracted by hot water.The contents of total sugar and reducing sugar in water extracts are determined by phenol sulfuric acid and 3,5-dinitrosalicylic acid（DNS）method.The concentration of polysaccharide depended on their concentration difference.The methodology is also investigated.The results show above methods are convenient and have good adaptability.The precision，stability and recovery rate of the sample are all in accordance with the requirements.The method can be used for the determination of polysaccharide in water extraction from Flammulina velutipes.

phenol-sulfuric acid method；3,5-dinitrosalicylic acid method；Flammulina velutipes polysaccharide

TS219

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.08.010

1671-9646（2017）08a-0031-04

2017-06-07

山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項目“食用菌副產(chǎn)物綜合利用技術(shù)研究與示范”（20170406）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用菌產(chǎn)后加工崗位專家項目（SDAIT-07-08）。

張劍（1984—），女，碩士，研究方向為果蔬加工。

*通訊作者：王月明（1968—），男，碩士，研究員，研究方向為新食品資源加工、植物營養(yǎng)和資源無害化綜合利用技術(shù)。