從化合物—靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)的角度證實(shí)羌活抗炎鎮(zhèn)痛的作用

鄭春松+嚴(yán)培晶+付長(zhǎng)龍+葉蕻芝+吳廣文+李西海+劉獻(xiàn)祥

【摘 要】目的：從化合物-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)的角度，探討羌活在治療骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)疼痛中的作用，從而揭示其抗炎鎮(zhèn)痛作用。方法：從北京大學(xué)天然產(chǎn)物庫(kù)中搜索羌活的化學(xué)成分，建立羌活化合物的分子數(shù)據(jù)集；以白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶為骨關(guān)節(jié)炎疼痛的治療靶點(diǎn)，利用分子對(duì)接和生物網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，構(gòu)建羌活化合物-抗炎鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)，分析羌活抗炎鎮(zhèn)痛的作用特點(diǎn)。結(jié)果：羌活抗炎鎮(zhèn)痛的活性成分有32個(gè)化合物，主要為香豆素苷類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)；約59.38%的化合物能作用于1個(gè)靶點(diǎn)，僅有9.38%的化合物能作用≥3個(gè)靶點(diǎn)，其作用關(guān)系曲線遵循冪函數(shù)p（k）=

k-1.96233規(guī)律，反映了羌活抗炎鎮(zhèn)痛存在“一對(duì)多，多對(duì)一”的非線性特點(diǎn)。結(jié)論：化合物-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)直觀顯示了羌活的抗炎鎮(zhèn)痛作用，并且，網(wǎng)絡(luò)中的化合物為今后進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)疼痛治療新藥研發(fā)提供參考。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；羌活；抗炎鎮(zhèn)痛；化合物-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)；痹證

Verifying the Anti-inflammatory and Analgesic Effects of Qianghuo from the Compound-target

Network Perspective

ZHENG Chun-song，YAN Pei-jing，F(xiàn)U Chang-long，YE Hong-zhi，WU Guang-wen，LI Xi-hai，LIU Xian-xiang

【ABSTRACT】Objective：To explore the role of qianghuo（Notopterygium inchum Ting ex H，T.Chang）in the treatment of osteoarthritis from the compound-target network perspective so as to reveal its anti-inflammatory and analgesic effects.Methods：The chemical constituents of qianghuo were searched from the natural product library of Peking University to establish the molecular data sets of qianghuo compounds.Taking interleukin-1β，interleukin-6，tumor necrosis factor-α and inducible nitric oxide synthase as therapeutic targets for pain in osteoarthritis and using molecular docking and biological network technology，a qianghuo compound-anti-inflammatory and analgesic target network was established to analyze the anti-inflammatory and analgesic effects of qianghuo.Results：There were 32 compounds in qianghuo as the active ingredients with anti-inflammatory and analgesic effects，which were mainly coumarin glycosides and organic acids.Approximately 59.38% of the compounds could act on one target and only 9.38% of the compounds could act on more than 3 targets.The correlation curves followed the power function p（k） = k-1.96233，which reflected that the analgesic and anti-inflammatory effects of qianghuo had the nonlinear characteristics of "one to many，many to one".Conclusion：Compound-target network intuitively shows the anti-inflammatory and analgesic effects of qianghuo，and compounds in the network provide reference for further experimental verification and drug development for the treatment of osteoarthritic pain.

【Keywords】 osteoarthritis；qianghuo；

anti-inflammatory and analgesic effects；

compound target network；bi syndrome

痹證是風(fēng)寒濕等外邪侵襲人體，致使閉阻經(jīng)絡(luò)、氣血運(yùn)行不暢的一類(lèi)疾病，臨床表現(xiàn)為肌肉、筋骨、關(guān)節(jié)發(fā)生酸痛、麻木、重著、屈伸不利，甚至關(guān)節(jié)腫大灼熱等[1]。其中，疼痛和腫脹為最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[2]。由此，鎮(zhèn)痛、抗炎消腫作用已成為評(píng)價(jià)藥物治療痹證療效的重要指標(biāo)，也成為治療痹證的良好開(kāi)端[1，3]。黃仰模等[4]通過(guò)《金匱要略》中對(duì)關(guān)節(jié)疼痛的論述，揭示了祛除風(fēng)寒濕邪是關(guān)節(jié)痛的主要治法。因此，以具有祛風(fēng)寒濕功效的中藥為研究對(duì)象，從藥效物質(zhì)基礎(chǔ)（活性成分）和靶點(diǎn)的角度，研究其抗炎鎮(zhèn)痛的作用，將有助于中醫(yī)藥防治痹證的現(xiàn)代闡釋。

羌活在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，是蠲痹湯、羌活地黃湯等名方的重要組成藥物，其辛散祛風(fēng)、味苦燥濕、性溫散寒，具有祛風(fēng)勝濕止痛的功效，主治風(fēng)寒濕痹肢節(jié)疼痛[5-7]?，F(xiàn)代研究表明，羌活水煎液具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用[8]，但是，其具體的活性成分和作用靶點(diǎn)未見(jiàn)報(bào)道。骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）作為痹證的代表性疾病之一，臨床治療的主要目的之一即緩解關(guān)節(jié)疼痛[9]。因

此，本文以O(shè)A為痹證研究對(duì)象，基于計(jì)算機(jī)模擬方法[10-11]，從化合物-靶點(diǎn)相互作用的角度，研究羌活化合物-抗炎鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)的作用網(wǎng)絡(luò)，以期進(jìn)一步明確羌活抗炎鎮(zhèn)痛的作用，為其治療OA關(guān)節(jié)疼痛提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 羌活分子數(shù)據(jù)集，OA抗炎鎮(zhèn)痛相關(guān)的蛋白數(shù)據(jù)集。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 本文是基于Windows系統(tǒng)的計(jì)算模擬與數(shù)據(jù)建模平臺(tái)Discovery Studio ?（簡(jiǎn)稱(chēng)DS）完成的。計(jì)算過(guò)程中除非特別說(shuō)明，所選用的參數(shù)均為缺省值。所有計(jì)算工作皆在北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 方 法

1.3.1 羌活和蛋白分子數(shù)據(jù)集建立 從北京大學(xué)天然產(chǎn)物庫(kù)中下載羌活的化學(xué)成分[12]，共計(jì)96個(gè)。在DS模擬平臺(tái)上，建立羌活分子數(shù)據(jù)集。根據(jù)治療靶數(shù)據(jù)庫(kù)（Therapeutic Target Database）[13]和文獻(xiàn)[14-21]，確定與OA抗炎鎮(zhèn)痛相關(guān)的白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）為研究靶點(diǎn)。在RCSB Protein Data Bank上[22]，分別下載其蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，其代碼分別為3O4O、1ALU、2AZ5和3HR4。在DS模擬平臺(tái)上，建立蛋白分子數(shù)據(jù)集。

1.3.2 羌活化合物-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 羌活分子集配體與抗炎鎮(zhèn)痛相關(guān)靶點(diǎn)在DS軟件的LigandFit模塊中進(jìn)行分子對(duì)接[23]。具體如下：蛋白結(jié)構(gòu)去溶劑、去配體、加氫處理后，以其所含的活性原配體來(lái)確定活性位點(diǎn)；在“Input Ligands”模塊中輸入羌活分子集的sd文件。使用蒙特卡羅方法對(duì)配體進(jìn)行構(gòu)象采樣、Dreiding力場(chǎng)下進(jìn)行打分，保留得分最高的構(gòu)象，對(duì)對(duì)接成功的配體DOCK-SCORE進(jìn)行排序。大于原配體DOCK-SCORE的配體，視為羌活抗炎鎮(zhèn)痛的活性成分[24]。將上述化合物與靶點(diǎn)當(dāng)作節(jié)點(diǎn)，兩者相互作用用邊表示。采用Cytoscape軟件構(gòu)建羌活化合物-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)[25]。通過(guò)該軟件的Plugins面板下Network Analysis分析羌活中化合物與靶點(diǎn)的作用情況。此外，定義度分布p（k）為網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值為k的概率[26]，由此得到網(wǎng)絡(luò)度的分布情況，來(lái)揭示羌活抗炎鎮(zhèn)痛的作用特點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 羌活抗炎鎮(zhèn)痛的化合物 本文以IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS為抗炎鎮(zhèn)痛的虛擬藥理篩選模型，以各自蛋白結(jié)構(gòu)上的配體抑制劑DOCK-SCORE為閾值，從羌活中篩選出與IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS結(jié)合較好的化合物分別為27，12，8，2個(gè)，見(jiàn)表1。結(jié)果顯示了羌活抗炎鎮(zhèn)痛的活性成分主要為香豆素苷和有機(jī)酸類(lèi)化合物。

2.2 羌活活性成分和炎性靶點(diǎn)關(guān)系 構(gòu)建了羌活的化合物-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中有36個(gè)節(jié)點(diǎn)（包括4個(gè)靶蛋白節(jié)點(diǎn)和32個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)），大部分化合物節(jié)點(diǎn)位于網(wǎng)絡(luò)的周邊，僅能與一個(gè)靶蛋白節(jié)點(diǎn)連接，而僅有少數(shù)的化合物節(jié)點(diǎn)位于中心，可以與多個(gè)靶蛋白節(jié)點(diǎn)連接。由此通過(guò)Network Analysis模塊分析了化合物-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)中重要節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)特征，見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，羌活作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)為IL-1β、IL-6和TNF-α，其關(guān)鍵的活性成分為UNPD126568、UNPD191127、UNPD70991、UNPD79883等，均為香豆素類(lèi)成分。

2.3 羌活活性成分抗炎鎮(zhèn)痛的作用特點(diǎn) 為了進(jìn)一步分析羌活的化合物-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)，本文計(jì)算了該網(wǎng)絡(luò)化合物節(jié)點(diǎn)度的分布，見(jiàn)圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)約59.38%的化合物能作用于1個(gè)靶點(diǎn)，僅有9.38%的化合物能作用≥3個(gè)靶點(diǎn)，其化合物-靶點(diǎn)的作用關(guān)系曲線遵循冪函數(shù)p（k）=k-1.96233規(guī)律，反映了羌活中化合物與靶點(diǎn)的作用具有“一對(duì)多，多對(duì)一”的非線性特點(diǎn)。

3 討 論

OA的主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛，即炎性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛。前者主要是炎癥細(xì)胞因子引起的炎癥所致，后者是炎癥細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間刺激骨關(guān)節(jié)周?chē)哪┥疑窠?jīng)所致。由此目前學(xué)者普遍認(rèn)為，OA關(guān)節(jié)疼痛原因是炎癥細(xì)胞因子通過(guò)直接或間接的途徑誘導(dǎo)痛覺(jué)過(guò)敏引起[14]。有研究顯示，IL-1β可以直接作用于周?chē)从X(jué)感受器，產(chǎn)生痛敏，而且，阻斷IL-1β的產(chǎn)生可以起到抗炎鎮(zhèn)痛的作用[16-17]。IL-6在OA的疼痛傳遞中起到關(guān)鍵的作用，可增加TNF-α受體的表達(dá)[18]。TNF-α在軟骨細(xì)胞或滑膜細(xì)胞中能誘導(dǎo)脊髓和背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)IL-6的上調(diào)和神經(jīng)病理性疼痛[19]。此外，iNOS特異性抑制劑可以產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，其表達(dá)與炎性疼痛的維持階段有關(guān)[20-21]。因此，本文以IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS為OA抗炎鎮(zhèn)痛的虛擬藥理篩選模型。

由于中藥有效成分多為小分子物質(zhì)，是通過(guò)與體內(nèi)的生物靶點(diǎn)相互作用產(chǎn)生藥效的，這種作用可以通過(guò)分子模擬來(lái)計(jì)算[27]。近年來(lái)，基于分子模擬的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已經(jīng)成為從中藥中發(fā)現(xiàn)活性化合物以及探討其作用機(jī)制的重要手段[28-29]。由此本文構(gòu)建了羌活抗炎鎮(zhèn)痛的化合物-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)，其網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的度和介數(shù)被用于評(píng)價(jià)化合物和靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性[29]。從化合物的網(wǎng)絡(luò)特征看，羌活中大部分化合物只能作用1個(gè)靶點(diǎn)，僅有少數(shù)可以作用多個(gè)靶點(diǎn)，最大數(shù)目達(dá)到4個(gè)。表2顯示了度和介數(shù)值前3位的化合物節(jié)點(diǎn)為UNPD126568、UNPD191127和UNPD70991，屬于香豆素苷。提示羌活抗炎鎮(zhèn)痛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為活性成分群，起到關(guān)鍵作用的是香豆素苷類(lèi)化合物，可溶于水，與文獻(xiàn)報(bào)道羌活水煎液具有抗炎鎮(zhèn)痛作用相互印

證[8]，是未來(lái)從羌活中開(kāi)發(fā)治療OA關(guān)節(jié)疼痛的“混雜藥物（promiscuous drugs）”的重要來(lái)源[30]，也是未來(lái)提取分離活性實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)關(guān)注的部位。從靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)特征看，表2顯示了度和介數(shù)值前3位的靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)為IL-1β、IL-6和TNF-α，提示羌活的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)為IL-1β、IL-6和TNF-α，其抗炎鎮(zhèn)痛作用機(jī)制可能與抑制炎癥細(xì)胞因子直接或間接誘導(dǎo)痛覺(jué)過(guò)敏有關(guān)。在一定層面上反映了羌活在OA關(guān)節(jié)疼痛治療中的應(yīng)用價(jià)值。

總之，本文以化合物-靶點(diǎn)相互作用為切入點(diǎn)，直觀顯示了羌活化合物與抗炎鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)的非線性作用特點(diǎn)，既預(yù)測(cè)了羌活治療OA關(guān)節(jié)疼痛的活性成分，又明確了其作用靶點(diǎn)。未來(lái)將提取羌活的香豆素苷類(lèi)成分，以大鼠膝OA和IL-1β誘導(dǎo)的退變關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為模型[31-32]，開(kāi)展“中藥-有效部位-有效成分-臨床表型”的系統(tǒng)層次研究，進(jìn)一步驗(yàn)證羌活的抗炎鎮(zhèn)痛作用，為從羌活中開(kāi)發(fā)OA關(guān)節(jié)疼痛的治療新藥提供新依據(jù)。

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收稿日期：2017-01-05；修回日期：2017-04-10