免疫親和凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中玉米赤霉烯酮類真菌毒素

邵瑞婷，張麗華*，史 娜，姜 潔

免疫親和凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中玉米赤霉烯酮類真菌毒素

邵瑞婷，張麗華*，史 娜，姜 潔

（北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估中心，北京 100041）

建立食品中6 種玉米赤霉烯酮類（α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮）真菌毒素的免疫親和凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測的實驗方法。樣品經(jīng)80%乙腈溶液提取，通過免疫親和柱凈化富集，用2 mL乙腈洗脫，氮吹至近干，0.5 mL 50%乙腈溶液復(fù)溶，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行測定。在ACQUITY UPLC HSS T3反相柱上分離，梯度洗脫，流動相為乙腈和水，質(zhì)譜采集模式為電噴霧負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式。6 種目標(biāo)物的線性范圍為0.1～100 μg/L，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.992，檢出限為0.05 μg/kg，定量限為0.2 μg/kg，3 個不同水平的加標(biāo)平均回收率為73.0%～119.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于10%。該方法具有操作簡單、重復(fù)性好、靈敏度高、雜質(zhì)干擾小等特點，可以用于食品中玉米赤霉烯酮類真菌毒素的檢測。

免疫親和；玉米赤霉烯酮；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；食品中真菌毒素

玉米赤霉烯酮又稱F-2菌素，是由鐮刀菌產(chǎn)生的一種非甾體霉菌毒素，具有類雌激素作用[1]。玉米赤霉烯酮在世界范圍內(nèi)的污染廣泛存在，主要污染玉米、小麥、大麥、高粱等谷物類農(nóng)產(chǎn)品及其制品，并通過飼料進入畜禽體內(nèi)。研究表明，玉米赤霉烯酮具有生殖毒性，可引起動物雌激素水平的提高，導(dǎo)致動物流產(chǎn)、死胎、畸形等生殖異常。還具有免疫毒性、肝毒性及細(xì)胞毒性，也對腫瘤的發(fā)生有一定的影響[2-4]。人一旦食用被污染的谷物，或由被污染飼料喂養(yǎng)的畜禽生產(chǎn)出的肉、蛋、奶等動物源性食品，玉米赤霉烯酮就可通過食物鏈富集，對人類的健康造成極大的影響。玉米赤霉烯酮有多種結(jié)構(gòu)類似的衍生物，包括：α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮等，其對生物體的影響與玉米赤霉烯酮相似。國內(nèi)外對谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的最高殘留進行了限制：我國的國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了小麥、玉米等谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的最高限量為60 μg/kg[5]；歐盟對谷物及其制品進行了詳細(xì)的區(qū)分：嬰幼兒谷物食品中玉米赤霉烯酮最高限量為20 μg/kg，其他谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的最高限量為50～400 μg/kg不等[6]。對于其他動物源性食品，我國除將玉米赤霉醇列為動物性食品中禁止使用的藥物[7]外，尚未對其他玉米赤霉烯酮類真菌毒素的殘留進行限定。目前，國內(nèi)外檢測食品中玉米赤霉烯酮類真菌毒素的方法主要有：酶聯(lián)免疫吸附法[8]、液相色譜法[9-13]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-19]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20-21]等。

近年來，液相色譜及液相色譜-質(zhì)譜在玉米赤霉烯酮類真菌毒素的檢測上應(yīng)用較為廣泛，相關(guān)研究多集中于谷物及其制品[9-11,13]。在動物源性食品方面，現(xiàn)有研究主要涉及到肉、蛋、乳、水產(chǎn)中的單一食品類別[22-23]，且需用空白基質(zhì)提取液配制曲線進行定量。本方法前處理過程簡便，運用免疫親和柱凈化，液標(biāo)法定量，可實現(xiàn)6 種玉米赤霉烯酮類真菌毒素的同時定量測定。除谷物及其制品外，同樣適用于肉、蛋、乳、水產(chǎn)及其制品多個食品類別。與現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)[24-25]相比較，本方法適用的食品類別更廣泛，前處理更為簡便且能達(dá)到更低的檢出限。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用大米、麥片、牛肉、豬肉脯、雞蛋、牛奶、鯉魚等樣品均為市售。其中大米、麥片用研磨儀制成粉末狀；牛肉、豬肉脯、鯉魚用組織搗碎機搗碎；雞蛋、牛奶充分混勻后直接取用。

α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈（色譜純）美國Thermo Fisher公司；乙酸鈉（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶 法國默克公司；玉米赤霉烯酮類免疫親和柱 美國Vicam公司。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：精確稱取玉米赤霉烯酮類標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg分別置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，避光、-18 ℃條件下保存；混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密量取玉米赤霉烯酮類標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各100 μL，用乙腈定容至10 mL，配制成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光、-18 ℃條件下保存?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液系列：用體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶液逐級稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITYTM超高效液相色譜-TQS質(zhì)譜儀 美國Waters公司；GM200型刀式研磨儀 德國Retsch公司；8010ES型組織搗碎機 美國Waring Blende公司；T18均質(zhì)器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 谷物及其制品

稱取25 g粉碎試樣（精確到0.01 g）置于組織搗碎機中，加入5 g氯化鈉，100 mL體積分?jǐn)?shù)80%的乙腈溶液，高速攪拌提取2 min，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，以4 000 r/min離心5 min，吸取上層提取液10 mL，加入40 mL水，混勻，以10 000 r/min離心5 min。取上清液20 mL，以1～2滴/s流速通過免疫親和柱，依次用10 mL水淋洗免疫親和柱2 次，直至空氣進入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱。準(zhǔn)確加入2.0 mL乙腈洗脫，收集全部洗脫液于干凈的玻璃試管中，在40 ℃以下氮氣吹至近干。殘留物用0.5 mL體積分?jǐn)?shù)50%的乙腈溶液復(fù)溶，渦旋混勻后，過0.22 μm微孔濾膜，供儀器檢測。

1.3.1.2 肉及肉制品、蛋、乳、水產(chǎn)品

稱取5 g（準(zhǔn)確至0.01 g）經(jīng)搗碎的樣品于50 mL的具塞離心管中，加入5 mL濃度為0.2 mol/L乙酸鈉緩沖液和0.025 mL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，于37 ℃水浴中振蕩12 h。水解后分別加入2 g氯化鈉和20 mL乙腈高速均質(zhì)1 min后，超聲提取20 min，以10 000 r/min冷凍離心5 min，吸取上層提取液10 mL，加入40 mL水，混勻，以10 000 r/min離心5 min。取上清液20 mL，以1～2 滴/s流速通過免疫親和柱，依次用10 mL水淋洗免疫親和柱2 次，直至空氣進入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱。準(zhǔn)確加入2.0 mL乙腈洗脫，收集全部洗脫液于干凈的玻璃試管中，在40 ℃以下氮氣吹至近干。殘留物用0.5 mL體積分?jǐn)?shù)50%的乙腈溶液復(fù)溶，渦旋混勻后，過0.22 μm微孔濾膜，供儀器檢測。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：WATERS ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：15 ℃；進樣體積：10 μL；流速：0.3 mL/min；流動相：A為乙腈、B為水，梯度洗脫程序：0～5 min，A由25%線性升到70%，5～6 min，A相保持70%，6～9 min，A由70%線性降到25%，9～10 min，A相保持25%。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓：2.50 kV，錐孔電壓：20 V，離子源溫度：150℃，脫溶劑氣溫度：500 ℃，脫溶劑氣流速：800 L/h，錐孔氣流速：150 L/h，碰撞氣流速：0.22 mL/min，其他質(zhì)譜條件參數(shù)見表 1。

表1 6 種真菌毒素多反應(yīng)監(jiān)測模式參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for detection of the six mycotoxins

1.3.4 目標(biāo)物的確證

本實驗使用的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜屬于低分辨質(zhì)譜，根據(jù)歐盟指令2002/657/EC規(guī)定低分辨率質(zhì)譜需滿足4 分，即選取1個母離子（1 分）和2個子離子（各1.5 分）用來確證化合物。在本實驗方法條件下6 種化合物的檢測結(jié)果都能夠滿足此要求，符合對目標(biāo)化合物的確證準(zhǔn)則。

本實驗按照儀器條件測定樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品的質(zhì)量色譜峰保留時間與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液一致且定性離子對的相對豐度與質(zhì)量濃度相當(dāng)?shù)幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的相對豐度一致，則判斷樣品中存在相應(yīng)的被測物。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑選擇

分別用甲醇、乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲基醚4 種有機溶劑對糧谷、肉制品、蛋、乳等樣品中6 種化合物進行提取條件實驗。結(jié)果表明，對于乳、蛋樣品中的6 種化合物的提取，乙腈作為提取溶劑，其回收率為74%～105%；乙酸乙酯及叔丁基甲基醚雖有一定的提取效果，但回收率較低，均不足40%；甲醇作為提取試劑，乳化現(xiàn)象明顯，無法達(dá)到提取效果。對于肉類樣品，4 種有機溶劑的提取回收率見圖1。結(jié)果表明，在同時提取肉類樣品中6 種化合物時，乙腈具有顯著的優(yōu)勢。故在本研究中，選取乙腈作為提取溶劑。

圖1 不同溶劑提取牛肉中6 種真菌毒素的回收率（n=6）Fig. 1 Recoveries of the mycotoxins from beef with different extraction solvents (n = 6)

2.2 樣品凈化方法的選擇

目前用于玉米赤霉烯酮類真菌毒素的分離純化的柱子主要有固相萃取小柱[26]、多功能凈化柱[27-28]及免疫親和柱[29-30]。比較了3 種凈化柱對凈化效果和回收率的影響，凈化效果見圖2。結(jié)果表明，使用多功能凈化柱及固相萃取柱凈化時，除在6 種目標(biāo)化合物的保留時間（3.60～5.0 min）外，其他保留時間存在明顯的雜質(zhì)譜峰。固相萃取柱雖價格便宜，但凈化效果一般，外標(biāo)法回收率很低，需要購買內(nèi)標(biāo)；多功能凈化柱可以一定程度上的吸附脂肪、蛋白質(zhì)及色素等干擾物質(zhì)，凈化效果比固相萃取柱稍強，但同樣存在外標(biāo)法回收率低的問題。故本實驗選用特異性強、靈敏度高、回收率好的免疫親和柱。

圖2 不同凈化方式下玉米赤霉烯酮類物質(zhì)的總離子流圖Fig. 2 Total ion current (TIC) chromatograms of zearalenones purified with different columns

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 液相色譜條件優(yōu)化

實驗比較了Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱和Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，在相同參數(shù)條件下，6 種化合物的總離子流圖如圖3所示。結(jié)果表明，BEH C18色譜柱拖尾現(xiàn)象明顯，且無法實現(xiàn)化合物3與4、5與6的基線分離；而HSS T3色譜柱的峰形尖銳，且分離效果明顯優(yōu)于BEH C18色譜柱。故在本實驗中，選擇HSS T3色譜柱。

圖3 不同色譜柱組成條件下玉米赤霉烯酮類物質(zhì)的總離子流圖Fig. 3 TIC chromatograms of zearalenones separated with different columns

2.3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用電噴霧離子源，不接色譜柱，標(biāo)準(zhǔn)品直接注射狀態(tài)下，分別將100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子和負(fù)離子模式下進行全掃描以選擇適當(dāng)?shù)碾婋x方式，結(jié)果表明，6 種玉米赤霉烯酮類（α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮）真菌毒素均在負(fù)離子模式下離子化效率較高。故本實驗選取負(fù)離子模式。

2.4 方法學(xué)實驗結(jié)果

2.4.1 檢出限、定量限與線性范圍

分別配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的6 種玉米赤霉醇類真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，自動進樣10 μL，進行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。目標(biāo)物以多反應(yīng)監(jiān)測模式下的峰面積為Y坐標(biāo)，與其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液質(zhì)量濃度為X坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法檢出限以加標(biāo)樣品檢測色譜峰信噪比不小于3確定，方法定量限以加標(biāo)樣品檢測色譜峰信噪比不小于10確定，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，6 種化合物在0.1～100.0 μg/L的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性系數(shù)R2均大于0.99，能滿足定量分析的要求。方法對于6 種玉米赤霉烯酮類真菌毒素的檢出限均為0.05 μg/kg，定量限均為0.2 μg/kg。

表2 6 種真菌毒素的線性范圍、回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear ranges, linear equations and correlation coefficients of the six mycotoxins

2.4.2 樣品的加標(biāo)回收率

表3 6 種目標(biāo)化合物在不同加標(biāo)水平下的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n= 6）Table 3 Recoveries and RSDs of the mycotoxins spiked at three levels (n= 6)

續(xù)表3

分別在25.0 g谷物及其制品，5.0 g肉及肉制品、蛋、乳、水產(chǎn)樣品中加入含有6 種玉米赤霉烯酮類真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，最終添加量分別為0.2、1.0、60.0 μg/kg，應(yīng)用優(yōu)化好的方法進行提取、凈化分離和確證，每個添加水平測定6 份樣品，得到6 種化合物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差如表3所示，回收率范圍為73.0%～119.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。結(jié)果表明，各化合物在不同的添加水平均得到了滿意的回收率和較好的方法重復(fù)性。

2.5 樣品分析結(jié)果

運用該方法對市售的265 個谷物及肉、蛋、奶及水產(chǎn)等動物源性食品樣本進行了檢測，其中部分樣品中檢出玉米赤霉烯酮，檢出含量為1.0～21.6 μg/kg，其結(jié)果與國內(nèi)外已有研究基本一致。圖4分別為陰性樣品和檢出含玉米赤霉烯酮樣品的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖。

圖4 實際樣品的多反應(yīng)監(jiān)測模式色譜圖Fig. 4 MRM chromatograms of mycotoxins detected in real food samples

3 結(jié) 論

建立了食品中玉米赤霉烯酮類6 種真菌毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。通過免疫親和柱的凈化，可實現(xiàn)在大米、麥片等谷物制品以及肉、蛋、奶、水產(chǎn)等動物源性樣品中均具有較高的回收率。該方法具有操作簡單、重復(fù)性好、靈敏度高、雜質(zhì)干擾小等特點，可以用于食品中玉米赤霉烯酮類真菌毒素的檢測。

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[28] 莊倩, 曲寶涵, 李彥, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定飼料中9 種霉菌毒素及其代謝物[J]. 分析科學(xué)學(xué)報, 2016, 32(1): 37-42. DOI:10.13526/j.issn.1006-6144.2016.01.007.

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Determination of Zeranols in Food by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Immunoaffinity Column Clean-up

SHAO Ruiting, ZHANG Lihua*, SHI Na, JIANG Jie
(Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring and Risk Assessment, Beijing 100041, China)

A method was established for the determination of 6 zeranols (α-zearalanol, β-zearalanol, α-zearalenol, β-zearalenol, zearalanone, and zearalenon) in foods by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) with immunoaffinity column clean-up. Sample extraction was carried out with 80% (V/V) acetonitrilewater mixture followed by purification on an immunoaffinity column, which was eluted with 2 mL of acetonitrile, and the eluate was blown to dryness by nitrogen and redissolved with 0.5 mL of 50% (V/V) acetonitrile-water mixture. The target compounds were assayed by UPLC-MS/MS. The chromatographic separation was performed on an ACQUITY UPLC HSS T3 column by gradient elution using acetonitrile and water as mobile phase. The mass spectrometric acquisitions were carried out by means of multiple reaction monitoring (MRM) in the electrospray negative ionization mode. Good linearities (R2＞ 0.992) were achieved for these 6 compounds over the concentration range of 0.1–100 μg/L. The limit of detection (LOD) of the method was 0.05 μg/kg, and the limit of quantification (LOQ) was 0.2 μg/kg. The mean recoveries of the 6 target compounds (spiked at three concentration levels) ranged from 73.0% to 119.1%, with relative standard deviations (RSDs) of not more than 10%. This method is suitable for the simultaneous determination of multiple zearalenonic mycotoxins in foods with simple pretreatment, high sensitivity, and good recovery.

immunoaffinity; zearalenon; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); mycotoxins in foods

10.7506/spkx1002-6630-201716044

TS207.3

A

1002-6630（2017）16-0274-06

邵瑞婷, 張麗華, 史娜, 等. 免疫親和凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中玉米赤霉烯酮類真菌毒素[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 274-279. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716044. http://www.spkx.net.cn

2016-08-25

北京市科技計劃項目（Z161100000616007）

邵瑞婷（1984—），女，工程師，學(xué)士，研究方向為食品檢測。E-mail：rtshao@126.com

*通信作者：張麗華（1988—），女，工程師，碩士，研究方向為食品檢測。E-mail：zlh_bibi@126.com

SHAO Ruiting, ZHANG Lihua, SHI Na, et al. Determination of zeranols in food by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with immunoaffinity column clean-up[J]. Food Science, 2017, 38(16): 274-279. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716044. http://www.spkx.net.cn