乳腺癌組織中miR-210表達(dá)與分子分型的相關(guān)性分析

李 云，吳 琍，陳慶峰，胡海燕

（1.山東青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院乳腺外科，山東 青島 266003；2.山東青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山東 青島 266003）

乳腺癌組織中miR-210表達(dá)與分子分型的相關(guān)性分析

李 云1，吳 琍1，陳慶峰2，胡海燕2

（1.山東青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院乳腺外科，山東 青島 266003；2.山東青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山東 青島 266003）

目的觀察乳腺癌組織中miRNA-210的表達(dá)水平，分析其與乳腺癌臨床病理中腫瘤分子亞型的關(guān)系。方法收集本院確診的50例浸潤(rùn)性乳腺癌患者經(jīng)手術(shù)切除的乳腺癌組織標(biāo)本及正常乳腺組織（距癌腫邊緣＞5cm），采用實(shí)時(shí)定量RT-RCR（qRT-PCR）法檢測(cè)miRNA-210表達(dá)水平，收集對(duì)應(yīng)乳腺癌患者的臨床病理資料，分析乳腺癌組織中miRNA-210與腫瘤分子分型的關(guān)系。結(jié)果浸潤(rùn)性乳腺癌組織中miRNA-210在HER-2高表達(dá)型乳腺癌組織中表達(dá)最高，其次是三陰型乳腺癌，在LuminalB型的兩個(gè)分型中表達(dá)相似，在LuminalA型中表達(dá)最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。浸潤(rùn)性乳腺癌組中miRNA-210表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、組織分級(jí)及病理分期等方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此與其他臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)。結(jié)論miRNA-210在乳腺癌組織不同分子分型中表達(dá)水平不同，且與乳腺癌分子分型相關(guān)，可以作為乳腺癌分子分型診斷的參考及三陰型乳腺癌治療的新突破。

浸潤(rùn)性乳腺癌；miR-210；分子亞型

同階段的乳腺癌患者對(duì)疾病的治療反應(yīng)和總體結(jié)果明顯不同，根據(jù)乳腺惡性腫瘤的臨床表現(xiàn)不能最準(zhǔn)確的進(jìn)行對(duì)乳腺癌的分類(lèi)及轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)[1]。近年來(lái)，乳腺癌個(gè)體化治療已逐漸取代了常規(guī)的乳腺癌手術(shù)治療方式，針對(duì)不同分子分型的乳腺癌個(gè)體化治療研究也隨之開(kāi)展。參照1996年美國(guó)乳腺癌協(xié)會(huì)制定的《乳腺癌診療指南》，將其分子分型分為：①LuminalB（B1型）：ki67≥20%，ER+和/或PR＜20%，HER2-，滿(mǎn)足ki67≥14%或PR-低表達(dá)中任意一項(xiàng)時(shí)，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高；②HER2+（B2型）：ER+和/或PR+、HER2高表達(dá)；③LuminalA型：HER2-，ER＋或PR+，ki67＜14%，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低；④HER2+型：ER-和PR-，HER2+；⑤基底樣型/三陰性型：ER-、PR-和HER2-；⑥其他特殊類(lèi)型乳腺癌[2]。miRNA是21–25個(gè)核苷酸長(zhǎng)的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)結(jié)合非編碼區(qū)（3utrs）或開(kāi)放閱讀靶基因的框架，導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制mRNA的翻譯[3]。miR-210是Fockens JA等發(fā)現(xiàn)的與乳腺癌相關(guān)的miRNA，乳腺癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)也與之密切相關(guān)，也是非轉(zhuǎn)移性乳腺癌預(yù)后較差的標(biāo)志之一[4]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的miRNA表達(dá)情況，應(yīng)用RT-RCR（qRT-PCR）法對(duì)50例浸潤(rùn)性乳腺癌及其癌胖正常乳腺組織的miRNA-210進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步探究其與臨床病理中癌組織病理分子分型的關(guān)系。以期在臨床工作中進(jìn)行更加精準(zhǔn)的進(jìn)行乳腺癌個(gè)體化治療并對(duì)治療效果與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的概率進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

留取50例自2015年10月～2016年7月于我院行乳腺切除手術(shù)的病人乳癌組織標(biāo)本，經(jīng)病理證實(shí)均為浸潤(rùn)性乳腺癌。術(shù)中同時(shí)留取相應(yīng)癌旁正常乳腺組織（距癌腫邊緣＞5 cm）作為對(duì)照?；颊呔鶠榕?，年齡24～69歲。所有患者術(shù)前均未行放化療及內(nèi)分泌治療。符合以上條件者方可入組。標(biāo)本均于-80℃低溫冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。收集入組乳腺癌患者臨床病理報(bào)告中相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2 試劑

mircute mRNA第一鏈cDNA合成盒、miRcute miRNA 提取試劑盒、mircute miRNA的檢測(cè)盒（SYBR Green）均購(gòu)自天根生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

Real Time PCR檢測(cè)目的基因引物。

1.3.2 提取樣本總RNA

a.樣品處理：在液氮環(huán)境下磨碎組織，每30～50 mg組織加1 ml 裂解液MZ，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理，樣品體積＜裂解液MZ體積的十分之一。

b.將上述樣品在室溫下放置5 min，待蛋白核酸復(fù)合物分離完全。C.緩緩注入200 μl四氯化碳，密封，搖晃15 sec后常溫靜置5 min。d.4℃ 12，000 rpm （～13，400×g） 離心15 min，把水相轉(zhuǎn)移到新管中。e.量取轉(zhuǎn)移液的體積，加入0.43倍轉(zhuǎn)移液體積的無(wú)水酒精，混勻（此時(shí)溶液可能出現(xiàn)渾濁）。將制得的混合物轉(zhuǎn)入吸附柱中，室溫12，000 rpm（～13，400×g）進(jìn)行30 sec的離心后棄掉吸附柱miRspin，取剩余液體。f.量取剩余液體的體積，注入其0.75倍體積的無(wú)水酒精，混勻（此時(shí)溶液可能出現(xiàn)渾濁）。將得到混合物加進(jìn)吸附柱miRelute中，離心條件如上，離心后棄掉流出液，保留吸附柱miRelute。

1.3.3 RNA電泳

在電泳凝膠中，取5 μlRNA進(jìn)行電泳，檢測(cè)RNA完整程度。

1.3.4 反轉(zhuǎn)錄

①miRNA 3' 末端進(jìn)行加Poly （A）處理

②預(yù)先冷處理的RNase Free water反應(yīng)管內(nèi)加入總體積為20 μl 的以下物品（ E.coli Poly（A） Polymerase最后加）。見(jiàn)表1。

表1 反轉(zhuǎn)錄底物的配制

③移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心后在37℃反應(yīng)1 h。

④Poly （A）修飾的miRNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

⑤按照表2組分進(jìn)行反應(yīng)液的配制。

表2 反應(yīng)液的配制

⑥以上反應(yīng)液配置好之后使用移液器吹打，6000 rpm離心20 s，離心后在37℃下反應(yīng)1 h，cDNA反應(yīng)液保存于-20℃條件下。

1.3.5 RealTime-PCR

（1）分析方法及相關(guān)儀器

使用2-△△CT法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析，儀器采用熒光定量PCR儀，

（2）操作流程

①反應(yīng)體系的設(shè)置：實(shí)驗(yàn)操作流程均嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。見(jiàn)表3。

表3 反應(yīng)體系

②樣品RealTimePCR檢測(cè)

在上述條件下擴(kuò)增目的基因引物及內(nèi)參基因引物。同時(shí)在60-95℃進(jìn)行溶解曲線分析。見(jiàn)表4。

表4 樣品RealTimePCR檢測(cè)設(shè)計(jì)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本次實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，行t檢驗(yàn)，多組變量間比較采用單因素方差分析，結(jié)果為P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-210在乳腺癌組織中的表達(dá)水平

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，檢測(cè)50例浸潤(rùn)性乳腺癌患者癌組織與正常乳腺組織（距癌腫邊緣＞5cm）中miRNA-210的表達(dá)情況，結(jié)果顯示患者兩組標(biāo)本組織中目的基因均能檢測(cè)到，且擴(kuò)增曲線良好，擴(kuò)增率較高，見(jiàn)圖1、圖2。其中兩組miRNA-210的表達(dá)量分別為（4.39±2.86）、（1.94±1.52）μg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.017，P＜0.01）

圖1 乳腺癌組織擴(kuò)增曲線

圖2 正常組織擴(kuò)增曲線

2.2 乳腺癌組織中miRNA-210的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

根據(jù)收集所得入組乳腺癌患者臨床病理因素與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較，得出其與年齡、腫瘤大小、組織分級(jí)及病理分期等方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表5。

表5 miRNA-210乳腺癌組織表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系（±s）

表5 miRNA-210乳腺癌組織表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系（±s）

臨床病理資料例數(shù)（n） miRNA-210相對(duì)表達(dá)量 P腫瘤大?。? cm 103.90±3.02 0.117≤2 cm 403.84±2.39年齡≤46歲 163.59±2.35 0.475＞46歲 344.49±2.93組織學(xué)分級(jí)Ⅰ-Ⅱ級(jí) 283.45±2.57 0.905Ⅲ級(jí) 224.65±2.34腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)283.49±2.35 0.122有224.19±2.69病理分期I 163.36±2.04 0.134 II 264.34±2.70 III 86.56±3.37

2.3 乳腺癌組織中miRNA-210的表達(dá)與分子亞型的關(guān)系

miRNA-210在HER-2高表達(dá)型乳腺癌組織中表達(dá)最高，其次是三陰型乳腺癌，在LuminalB型的兩個(gè)分型中表達(dá)相似，在LuminalA型中表達(dá)最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表6。

表6 乳腺癌組織中miRNA-210的表達(dá)與分子亞型的關(guān)系（±s）

表6 乳腺癌組織中miRNA-210的表達(dá)與分子亞型的關(guān)系（±s）

分子亞型例數(shù)（n） miRNA-210相對(duì)表達(dá)量 F值 P Luminal A型 61.66±0.38 5.30 ＜0.01 Luminal B1型 263.38±0.56 Luminal B2型 63.38±0.32 HER-2高表達(dá)型 48.32±0.83三陰性型 85.77±0.41 ?

3 討 論

在大多數(shù)亞洲國(guó)家，乳腺癌發(fā)病率正在迅速增長(zhǎng)，與西方女性相比亞洲女性在發(fā)病年齡和發(fā)病形式上有明顯不同。并且在未來(lái)20年乳腺癌發(fā)病率仍將繼續(xù)增長(zhǎng)。[5]按照乳腺癌基因表達(dá)譜和其分子生物學(xué)行為，可將乳腺癌分為官腔型、正常乳腺樣型、HER-2高表達(dá)型和基底細(xì)胞樣型。[6]這種分型在中國(guó)人中同樣適合。[7]不同分子亞型的乳腺癌患者治療方案及預(yù)后和復(fù)發(fā)概率存在明顯差異。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乳腺癌手術(shù)后經(jīng)臨床病理證實(shí)ER和PR陽(yáng)性的患者采用內(nèi)分泌治療的有效率高達(dá)70%～80%，而ER和PR陰性的患者內(nèi)分泌治療有效率低于10%，已不接受激素調(diào)控[8]。所以臨床病理分期較好的LuminalA型乳腺癌患者甚至可以不需接受術(shù)后化療，僅行內(nèi)分泌治療就可達(dá)到治療目的。而激素受體陰性的分型中HER-2過(guò)表達(dá)型乳腺癌可接受靶向治療來(lái)對(duì)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)行防控。三陰型乳腺癌的惡性程度在所有分子分型中最高，在手術(shù)切除和化療后仍不能明顯降低復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)后最差。

微小RNA在乳腺癌發(fā)生發(fā)展及腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為中均起一定作用。部分miRNA作為原癌基因，也有部分作為抑癌基因。據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-210的啟動(dòng)子可攜帶乏氧應(yīng)答原件（HRE），其為缺氧誘導(dǎo)型RNA，HRE由乏氧誘導(dǎo)因子進(jìn)行識(shí)別[9]。癌細(xì)胞增殖產(chǎn)生的缺氧條件下，內(nèi)皮細(xì)胞的miRNA-210相關(guān)蛋白可被激活，可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)形成及遷移[10]。由此可見(jiàn)，miRNA-210高表達(dá)與乳腺癌侵襲、增殖和臨床不良預(yù)后有關(guān)[11]。

本研究結(jié)果得出miRNA-210在乳腺癌組織中的表達(dá)具有一定的規(guī)律性，在HER-2高表達(dá)型乳腺癌中表達(dá)最高，三陰型其次，LumialA型最低。而且與患者的年齡、腫瘤大小、癌組織分級(jí)、有無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床病理分期無(wú)關(guān)。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，乳腺癌組織的miRNA-210的表達(dá)與其分子分型相關(guān)，有作為乳腺癌分型的參考指標(biāo)的潛力。而miRNA-210在三陰性乳腺癌中相對(duì)高表達(dá)，三陰型乳腺癌又是臨床治療上預(yù)后最差的分子分型?，F(xiàn)有文獻(xiàn)表明，人類(lèi)檢測(cè)到大量miRNA-210靶點(diǎn)，靶點(diǎn)受體參與乳腺組織的DNA修復(fù)、血管結(jié)構(gòu)生成、細(xì)胞生存等[12]。因此，miRNA-210在不久的將來(lái)可作為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)，改善三陰型乳腺癌患者的預(yù)后，在臨床治療工作中獲得較大突破。

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本文編輯：吳 衛(wèi)

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ISSN.2095-8242.2017.026.4968.03