Pdx1和Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)對iPSCs及其分化為胰島素分泌細胞的調(diào)控機制

李夢夢

（第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院風濕免疫科，上海 200003）

Pdx1和Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)對iPSCs及其分化為胰島素分泌細胞的調(diào)控機制

李夢夢

（第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院風濕免疫科，上海 200003）

目的通過檢測Pdx1表達或者缺失的胰島細胞分化發(fā)育的情況，探討Pdx1基因?qū)σ葝u素分泌細胞分化的調(diào)控機制。方法通過Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)，在胰腺組織特異性敲除Foxa2基因，對該基因型小鼠的血糖、胰島素含量、胰高血糖素含量進行測定，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。檢測該基因型小鼠胚胎發(fā)育和干細胞誘導(dǎo)分化后，胰島β細胞和胰島α細胞的含量。結(jié)果胰腺特異性敲除Foxa2基因的小鼠表現(xiàn)出血糖低、胰島素高、胰高血糖素低、胰島β細胞多。對胚胎和干細胞的發(fā)育監(jiān)測結(jié)果顯示，敲除Foxa2基因，胰島細胞傾向于發(fā)育成胰島β細胞，而胰島α細胞數(shù)量減少。將Foxa2敲除的干細胞移植到糖尿病小鼠胰腺中，可以有效降低糖尿病小鼠的血糖。結(jié)論Pdx1抑制基因Foxa2敲除后，對胰島素分泌細胞的分化發(fā)育具有促進作用。這對胰島干細胞和胰島移植的研究具有重要的指導(dǎo)作用。

胰島細胞；胰島素；Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)；細胞分化

糖尿病的主要致病原因為其胰島β細胞的損害，導(dǎo)致胰島素分泌不足，或者因為胰島素抵抗致使胰島細胞超負荷運轉(zhuǎn)造成功能的損傷[1]。胰島移植被認為是目前最有希望治愈糖尿病的方法之一[2]。Cre-Loxp系統(tǒng)通過Cre重組酶對LoxP序列的識別，可以高效的實現(xiàn)對基因的重組改造作用，使其能在適當?shù)奈恢蒙蠈蜻M行操作。

1 材料與方法:

1.1 實驗動物:

Mesp1-Cre（C57BL/6）小鼠，F(xiàn)oxa2loxp/loxp（C57BL/6）小鼠，ROSA26-EYFP（C57BL/6）小鼠均購自美國The Jackson Laboratory，雌雄各一只。

1.2 方法

1.2.1 胰腺特異敲除Foxa2小鼠（MCFFA）模型的建立和研究對象的分組

將Mesp1-Cre小鼠與Foxa2loxp/loxp小鼠進行雜交，對后代進行基因型檢測。選取后代基因型為Mesp1Cre/+Foxa2loxp/+的雌鼠以及基因型為Mesp1+/+Foxa2loxp/loxp的雄鼠進行雜交，對后代基因型進行檢測。其中基因型為Mesp1Cre/+Foxa2loxp/loxp的小鼠為胰腺特異敲除Foxa2的小鼠。

用基因型為Mesp1Cre/+Foxa2loxp/+的雄性小鼠和基因型為Foxa2loxp/loxpROSA26-EYFP-/-的雌性小鼠進行雜交，后代中基因型為Mesp1Cre/+Foxa2loxp/loxpROSA26-EYFP-/-的為純合子組（homo組），基因型為Mesp1Cre/+Foxa2loxp/+ROSAEYFP-/-的作為雜合子組（het組）。以基因型為Mesp1Cre/+的雄性小鼠和基因型為ROSA26-EYFP-/-的雌性小鼠的雜交后代作為對照組。

1.2.2 MMR干細胞的培養(yǎng)及擬胚體形成

按照lineage tracing中的方法進行小鼠雜交，取13.5天的胚胎，按照1:4進行傳代培養(yǎng)。Plate-E細胞復(fù)蘇后隔天換液，細胞融合度達到70%-80%后，更換無血清的新鮮培養(yǎng)基，次日轉(zhuǎn)染。用LipofectaminTM 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對Plate-E細胞進行轉(zhuǎn)染和病毒包裝，培養(yǎng)3周后，挑去克隆接種到飼養(yǎng)層細胞上培養(yǎng)，繼而擬胚體形成并向胰腺前體分化。

1.2.3 糖尿病小鼠模型構(gòu)建的干預(yù)

將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5天，然后禁食12 h，并且連續(xù)3天腹腔注射2%的STZ溶液（150 mg/kg），同時采用高糖、高脂飼料進行喂養(yǎng)。監(jiān)測血糖，當出現(xiàn)高血糖的表形式，糖尿病小鼠模型構(gòu)建完成。

1.2.4 小鼠胰島素和胰高血糖素水平的測定

對小鼠進行尾靜脈采血，將得到的血置于1.5 ml離心管中，室溫放置2小時后，4℃冰箱內(nèi)放置3小時或者過夜。待血液凝固成血塊后，4000 rpm離心10分鐘，取上清于干凈的離心管中，血清樣品可于-20 ℃保存。按照小鼠胰島素ELISA試劑盒和胰高血糖素ELISA試劑盒說明中步驟，對小鼠血清樣品中胰島素和胰高血糖素水平進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 MCFFA小鼠血糖、胰島素和胰高血糖素的測定

測定野生型、雜合子和純合子小鼠各5只，先饑餓2小時，然后測定血清中胰島素和胰高血糖素的含量，與其他兩種基因型比較，發(fā)現(xiàn)純合子小鼠血清中胰島素的含量明顯偏高，而血清中以高血糖素的含量明顯偏低，該結(jié)果提示Mesp1子代小鼠中敲除foxa2可引起高胰島素血癥性低血糖。見表1，表2。

表1 MCFFA小鼠喂食和禁食16 h情況下小鼠血糖

表2 MCFFA小鼠血清中胰島素和胰高血糖素含量

2.2 胰島細胞分化變化

在對照組小鼠中和實驗組中的雜合子小鼠的胰腺組織中，GFP與胰島α細胞和胰島β細胞均有共染，而在實驗組中的純合子后代的胰腺組織中，GFP只與胰島β細胞有共染，該結(jié)果說明在Mesp1子代小鼠中將Foxa2敲除后，會導(dǎo)致胰島細胞分化發(fā)育方向的改變，更多的向胰島β細胞發(fā)育。見表3。

表3 胰島β細胞和胰島α細胞與GFP細胞共染情況

2.3 MMR細胞對糖尿病小鼠的改善作用

用低劑量的STZ誘導(dǎo)誘導(dǎo)小鼠建立糖尿病小鼠模型，在誘導(dǎo)的第4天，監(jiān)測血糖，發(fā)現(xiàn)小鼠的血糖高達到17 mmol/L遠高于正常小鼠的血糖。見表4。

表4 胰島素小鼠模型注射MMR細胞后血糖變化

3 討 論

2 型糖尿病發(fā)病機制主要是胰島素抵抗和胰島素分泌不足[3]。胰島素抵抗使胰島細胞代償性的增加胰島素分泌，導(dǎo)致胰島細胞超負荷運轉(zhuǎn)，最終造成胰島衰竭，功能喪失和胰島細胞凋亡[4]。胰島干細胞治療可有效解決供體細胞來源問題。Pdx1又稱胰島素啟動子1，是決定胰腺分化發(fā)育和胰島功能的主要調(diào)節(jié)基因。在胚胎發(fā)育過程中，內(nèi)胚層Pdx1的表達將分化為胰腺，將該基因敲除后，小鼠由于缺乏胰腺而在胚胎期死亡；出生后特異敲除β細胞Pdx1的小鼠可發(fā)生糖尿病[5]，在人類Pdx1基因的突變也可導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。Pdx1對胰島素的治療的研究中表明，將Pdx1基因?qū)爰毎麅?nèi)，可以誘導(dǎo)非胰島β細胞中內(nèi)源性胰島素的表達[6]。在體外對非胰島β細胞進行Pdx1的記憶的修飾，可使其轉(zhuǎn)化為胰島素分泌細胞[7]。因此，Pdx1對胰島細胞的分化具有重要的調(diào)控作用，但其具體調(diào)控機制尚不明確。本研究中，采用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)，在小鼠體內(nèi)胰腺組織特異性的敲除Pdx1的抑制基因Foxa2，使Pdx1表達量增加。對胰腺特異性敲除Foxa2的小鼠的研究中，發(fā)現(xiàn)當敲除Foxa2后，小鼠表現(xiàn)為胰島素高，胰高血糖素低，導(dǎo)致血糖偏低。對組織細胞的進一步分析表明，敲除Foxa2后小鼠表現(xiàn)為胰島β細胞的異常增多。對胰島細胞分化的研究進一步表明，在Foxa2敲除的小鼠體內(nèi)，胰島細胞發(fā)育過程中傾向于向胰島β細胞的發(fā)育。將Foxa2敲除的干細胞移植到糖尿病小鼠體內(nèi)，可以促進糖尿病小鼠體內(nèi)胰島β細胞的增生，有效降低糖尿病小鼠的血糖。

綜上所述，Pdx1在胰島細胞發(fā)育過程中主要機制是，促進胰島細胞向具有胰島素分泌功能的胰島β細胞發(fā)育。

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本文編輯：李新剛

Regulatory mechanism of Pdx1 and Cre-LoxP recombinase system on mouse iPSCs and its differentiation into insulin secreting cells

LI Meng-meng
(Department of Rheumatology and Immunology, Changzheng Hospital Affiliated to Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)

ObjectiveTo observe the differentiation of Pdx1 expressing or Pdx1 deficient cells, we discussed the regulatory mechanism of Pdx1 gene on the differentiation of insulin secreting cells.MethodsWe bulid pancreatic tissue specific Foxa2 gene knockout mice by Cre-LoxP recombinase system, and measure the mice’s blood glucose, insulin and glucagon levels.Detected the number of pancreatic islet beta cells and islet alpha cells during mice embryonic development and induced differentiation of stem cells.ResultsThe pancreatic specific knock out Foxa2 gene showed low blood glucose, high insulin, low glucagon and increased number of islet beta cells.The development of embryonic and stem cells showed that, in addition to knocking down the Foxa2 gene, the islet cells tended to develop into pancreatic beta cells, while the number of islet alpha cells decreased.Transplantation of Foxa2 knockdown stem cells into the pancreas of diabetic mice can effectively reduce its blood glucose.Conclusionknockdown of Pdx1 suppressor gene Foxa2 can promote the differentiation and development of insulin secreting cells.It has an important guiding role in the study of islet stem cells and islet transplantation.

Islet cells; insulin; Cre-LoxP recombinase system; Cell differentiation

R-332

A

ISSN.2095-8242.2017.026.4953.03