豬尿液中7種β-受體激動(dòng)劑殘留的一步法酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的評價(jià)

蔡文金，應(yīng)永飛，陸春波，陳慧華，周煒，林仙軍，屈健，陳勇

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 311101)

豬尿液中7種β-受體激動(dòng)劑殘留的一步法酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的評價(jià)

蔡文金，應(yīng)永飛，陸春波，陳慧華，周煒，林仙軍，屈健，陳勇

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 311101)

對新研發(fā)的可同時(shí)快速檢測豬尿液中克倫特羅、沙丁胺醇、特布他林、馬布特羅、溴布特羅、妥布特羅和西布特羅7種β-受體激動(dòng)劑殘留的一步法酶聯(lián)免疫檢測試劑盒進(jìn)行評價(jià)，評價(jià)項(xiàng)目為檢測限、靈敏度、多交叉反應(yīng)率、準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果表明,研制的試劑盒各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均能滿足相關(guān)要求。

β-受體激動(dòng)劑；多交叉；酶聯(lián)免疫

β-受體激動(dòng)劑是一類具有腎上腺素功能的苯乙醇胺類人工合成化合物,在結(jié)構(gòu)上均具有苯乙醇胺的母核[1]。β-受體激動(dòng)劑作為藥物添加劑促進(jìn)動(dòng)物生長和改善動(dòng)物肉品質(zhì)，但高劑量的β-受體激動(dòng)劑類藥物在體內(nèi)代謝緩慢，易在可食性動(dòng)物組織中殘留，當(dāng)人類大量或長期食用后會(huì)對健康造成極大的危害。臨床表現(xiàn)為頭暈、惡心、手腳震顫、心率加快和肌肉衰弱等癥狀，嚴(yán)重的會(huì)出現(xiàn)心臟驟停、昏迷甚至是死亡[2]。最早被用于提高動(dòng)物瘦肉品質(zhì)的β-受體激動(dòng)劑是克倫特羅，但是，隨著國際范圍內(nèi)對其的禁用和檢測方法的不斷進(jìn)步，萊克多巴胺和沙丁胺醇開始成為其替代品。近年來，溴布特羅、西布特羅等開始用于促進(jìn)動(dòng)物的生長[3]。浙江省地處東部沿海地區(qū)，中小化工企業(yè)眾多，從業(yè)人員知識更新快，新型“瘦肉精”等非法添加物生產(chǎn)、使用異?；钴S，給農(nóng)業(yè)執(zhí)法和監(jiān)管帶來很大難度。目前檢測畜產(chǎn)品中β-受體激動(dòng)劑的主要方法為GC-MS和LC-MS/MS，但是，這兩種方法前處理較繁瑣，需要對樣品進(jìn)行酶解或衍生化、提取、凈化等[4]。酶聯(lián)免疫試劑盒采用直接競爭酶聯(lián)免疫法建立了同步快速檢測豬尿液中克倫特羅和沙丁胺醇等7種β-受體激動(dòng)劑殘留方法量，有效解決了檢測技術(shù)難題，本實(shí)驗(yàn)從方法學(xué)角度對本試劑盒進(jìn)行評價(jià)，以期為行業(yè)監(jiān)管提供有力技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 β興奮劑一步法ELISA試劑盒，由浙江迪恩生物科技股份有限公司提供，批號分別為33215,81206,60106；試劑盒內(nèi)含包被有抗體的96微孔板一塊，酶標(biāo)物凍干粉1瓶，酶標(biāo)物溶解液1瓶(13 mL)，樣品稀釋液10×1瓶(20 mL)，清洗液20×1瓶(25 mL)，顯色劑一瓶(13 mL)，終止液一瓶(13 mL)，濃度分別為0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ng/mL的克倫特羅對照品；沙丁胺醇對照品，德國Dr.Ehrenstorfer公司，含量99%，批號20618；妥布特羅對照品，德國WITEGA，含量99.7%，批號272038；溴布特羅對照品，德國WITEGA,含量99.64%，批號231717；克倫特羅對照品，德國Dr.Ehrenstorfer公司，含量99.1%，批號50224；西布特羅對照品，德國WITEGA,含量99.42%，批號212332；馬布特羅對照品，德國WITEGA，含量99.88%，批號120805；特布他林對照品，德國Dr.Ehrenstorfer公司，含量98.5%，批號10331。Mide1680酶標(biāo)儀，Bio-Rad公司；XS205DU電子天平，瑞士mettler公司。

1.2 方法

1.2.1 試料的制備 空白試料 20份不同來源豬尿液，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證為不含β-受體激動(dòng)劑。用于準(zhǔn)確度和精密度評價(jià)的陽性添加試料為取經(jīng)儀器確證的空白試料，添加克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成濃度為0.7、1.4、2.8 μg/L的陽性添加試料，每個(gè)濃度同法配制6份。添加沙丁胺醇、妥布特羅、溴布特羅、克倫特羅、西布特羅、馬布特羅、特布他林標(biāo)準(zhǔn)溶液，各制成濃度為1.0 μg/L和2.0 μg/L的陽性添加試料作為評價(jià)交叉反應(yīng)率時(shí)使用。

1.2.2 試劑盒檢測步驟[5]所有試劑與微孔板放置于控制在室溫22～25 ℃的房間內(nèi)或22～25 ℃的恒溫箱內(nèi)進(jìn)行充分回溫，微孔板預(yù)先進(jìn)行編號，標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品和試料的位置，進(jìn)行雙孔平行實(shí)驗(yàn)，在對應(yīng)微孔板中加入50 μL的標(biāo)準(zhǔn)品和試料溶液，立即在所有孔中加入100 μL的酶標(biāo)物工作液，輕輕晃動(dòng)混勻，在22～25 ℃條件下孵育30 min，然后倒掉微孔中液體，按250 μL/孔的清洗液洗板四次，拍干，徹底清除微孔中的殘留液和氣泡，立即向每個(gè)微孔中加入100 μL顯色劑，在22～25 ℃條件下顯色10 min，再向每個(gè)微孔中加入100 μL終止液，混勻，在450 nm下10 min內(nèi)檢測吸光度值，并進(jìn)行分析。

1.2.3 試劑盒相關(guān)指標(biāo)檢測方法

1.2.3.1 靈敏度IC50 測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到該標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50，IC50用于衡量抗體靈敏度，IC50越低說明抗體的靈敏度越高。

1.2.3.2 檢測限 用3個(gè)批次的試劑盒測定20份空白試料，根據(jù)結(jié)果計(jì)算測定值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，檢測限為平均值加三倍標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.3.3 準(zhǔn)確度和精密度 將配制好的克倫特羅陽性添加試料進(jìn)行測定(0.7、1.4、2.8 μg/L)，重復(fù)測定6次,計(jì)算豬尿中克倫特羅的平均回收率和變異系數(shù)。

1.2.3.4 交叉反應(yīng)率 將配制好的7種β-受體激動(dòng)劑陽性添加試料進(jìn)行測定，每個(gè)濃度測定10個(gè)平行，計(jì)算平均回收率得出交叉反應(yīng)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定5條標(biāo)準(zhǔn)曲線 靈敏度 IC50的范圍為0.6～0.9 ng/mL。

2.2 檢測限 測定20份空白試料，根據(jù)測得OD值的結(jié)果計(jì)算測定值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，檢測限為0.7 μg/L(表1)。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度 在克倫特羅0.7、1.4、2.8 μg/L濃度的回收率范圍為72%～110%；批間變異系數(shù)為6.2%～12.1%；批內(nèi)變異系數(shù)為2.2%～11.9%。結(jié)果見表2。

表1 20份空白試料的測定值Tab 1 The measured value of 20 copies of blank sample

表2 準(zhǔn)確度和精密度Tab 2 Accuracy and precision

2.4 交叉反應(yīng)率 沙丁胺醇、溴布特羅、妥布特羅、克倫特羅、西布特羅、馬布特羅、特布他林在1.0和2.0 μg/L濃度時(shí)，交叉反應(yīng)率結(jié)果見表3。

表3 7種β-受體激動(dòng)劑的交叉反應(yīng)率Tab 3 Cross reactivity of 7 kinds of β-agonist

4 討論小結(jié)

本研究的結(jié)果表明新研發(fā)的試劑盒的靈敏度較好，尿液的檢測限為0.7 μg/L，陽性添加回收率范圍為70%～110%。試劑盒吸光度批內(nèi)誤差小于12%，批間誤差小于15%，沙丁胺醇、溴布特羅、妥布特羅、克倫特羅、西布特羅、馬布特羅、特布他林在1.0和2.0 μg/L濃度時(shí)，交叉反應(yīng)率結(jié)果在45%～395%之間。結(jié)果均符合《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17號附件2中試劑盒備案參考標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定[6]。

研發(fā)的一步法同時(shí)測定7種β-受體激動(dòng)劑殘留ELISA試劑盒，推廣應(yīng)用后將大大降低生產(chǎn)、銷售企業(yè)的自檢成本，提高畜產(chǎn)品安全檢測水平，從而保障消費(fèi)者的自身健康。

[1] 王培龍. β-受體激動(dòng)劑及其檢測技術(shù)研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全, 2014, (1): 44-52.

Wang P L. The research of β-agonists and dection techniques[J]. Quality and safety of agricultural products, 2014, (1): 44-52.

[2] 李 丹. 瘦肉精屢禁不止的原因和對策[J]. 養(yǎng)殖與飼料, 2009, (9): 62-63.

Li D. The reasons and Countermeasures of repeated prohibition of Clenbuterol[J]. Breeding and feed, 2009, (9): 62-63.

[3] 彭 濤, 賴衛(wèi)華, 張富生, 等. 20種β2-受體激動(dòng)劑的性質(zhì)及檢測方法研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械, 2013, (3): 254-260.

Peng T, Lai W H, Zhang F S,etal. Research progress of properties and detection methods of 20 kinds of β2-agonist[J]. Food and machinery, 2013, (3): 254-260.

[4] 張 浩, 艾君濤, 趙燕飛. HPLC-MS/MS同時(shí)測定豬肉中7種β-受體激動(dòng)劑殘留[J]. 肉類工業(yè), 2015, (11): 42-47.

Zhang H, Ai J T, Zhao Y F. Determination of seven β-agonists residues in pork by high performance liquid chromatography-tandem mass spectromrtry[J]. Meat industry,2015, (11): 42-47.

[5] β-興奮劑一步法ELISA試劑盒使用說明書1504版. 浙江迪恩生物科技股份有限公司[Z].

The instructions of β-agonist residues by one-step ELISA kit,2015, DNA[Z].

[6] 農(nóng)業(yè)部農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17號. 試劑盒備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)[S].

Ministry of Agriculture.No. 17 bulletin of Veterinary Bureau of Ministry of Agriculture,2005[S].

(編輯：侯向輝)

Evaluation of 7 Kinds of β-agonist Residues in Swine Urine by One-step ELISA Test Kit

CAI Wen-jin，YING Yong-fei，LU Chun-bo，CHEN Hui-hua，ZHOU Wei，LIN Xian-jun，QU Jian，CHEN Yong

(Zhejiang Province Supervisory Institute of Veterinary Drug and Feed, Hangzhou 311101, China)

The detection limit,sensitivity,multiple cross reactivity,accuracy and precision of one-step ELISA test kit were estimated,which could be used for the detections of clenbuterol,salbutamol,terbutaline,mabuterol,brombuterol,tulobuterol and cimbuterol simultaneously in swine urine. The results showed that this ELISA kit were suitable for the determinations of 7 kinds of β-agonists residues in swine urine.

β-agonist; multi crossover; enzyme-linked immunosorbent assay

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.05

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015C32015)

蔡文金，助理獸醫(yī)師，從事畜產(chǎn)品中藥物殘留和獸藥檢測工作。E-mail：526667495@qq.com

2017-01-10

A

1002-1280 (2017) 08-0026-04

S859.83