TNF-α誘導(dǎo)MLO-Y4細胞發(fā)生RIP3介導(dǎo)的程序性壞死*

崔紅旺， 孟志斌， 黃 濤， 祝開忠， 趙志榮， 朱永俊

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1脊柱骨病外科， 2腎病風(fēng)濕科， 海南 ?？?570102)

TNF-α誘導(dǎo)MLO-Y4細胞發(fā)生RIP3介導(dǎo)的程序性壞死*

崔紅旺1， 孟志斌1， 黃 濤1， 祝開忠1， 趙志榮1， 朱永俊2△

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1脊柱骨病外科，2腎病風(fēng)濕科， 海南 ?？?570102)

目的： 探討腫瘤壞死因子α(TNF-α)能否誘導(dǎo)小鼠長骨骨樣細胞株MLO-Y4發(fā)生程序性壞死及其發(fā)生機制。方法: 將MLO-Y4細胞分為正常對照(control)組、TNF-α處理組、TNF-α+necrostatin-1 (Nec-1)處理組、TNF-α+Z-VAD處理組和TNF-α+受體相互作用蛋白3(RIP3)-siRNA組。用流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡或壞死率，透射電鏡鑒定細胞形態(tài)學(xué)變化，用Western blot法測定RIP1、RIP3和cleaved caspase-3的蛋白水平，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察RIP1和RIP3蛋白的共表達，應(yīng)用熒光標記法檢測各組細胞活性氧(ROS)水平。結(jié)果: TNF-α誘導(dǎo)MLO-Y4細胞24 h，凋亡和壞死率明顯高于control組(P<0.01)。與TNF-α組相比，Nec-1、Z-VAD和RIP3-siRNA均能降低細胞的凋亡或壞死率(P<0.01)。在TNF-α組可見大量壞死樣細胞，在Z-VAD組仍可見到壞死樣細胞，而在Nec-1和RIP3-siRNA組未見到壞死樣細胞。Western blot實驗結(jié)果顯示Nec-1可有效抑制RIP1蛋白表達，而Z-VAD對RIP1和RIP3蛋白表達無影響，RIP3-siRNA可有效降低RIP3蛋白表達(P<0.01)。與TNF-α組比較，Nec-1可有效降低RIP1-RIP3蛋白共表達陽性細胞百分率(P<0.01)，而Z-VAD對其無影響。與control組相比，TNF-α組的ROS水平明顯增高(P<0.01)；與TNF-α組相比，Nec-1、Z-VAD及RIP3-siRNA均能有效抑制ROS水平(P<0.01)。結(jié)論: TNF-α能誘導(dǎo)MLO-Y4細胞發(fā)生RIP3介導(dǎo)的程序性壞死；ROS可能是MLO-Y4細胞程序性壞死的執(zhí)行者。

腫瘤壞死因子α； 程序性壞死； 受體相互作用蛋白3； MLO-Y4細胞

在成人骨組織中，骨細胞占 90%～95%。骨細胞通過其樹突將信號傳遞給骨表面的成骨細胞和破骨細胞以調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收平衡[1]。骨細胞的死亡在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)發(fā)病過程中起重要的作用[2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢切除(ovariectomized，OVX)大鼠骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中，程序性壞死(necroptosis)是引起骨細胞死亡的另一種重要方式[3]；應(yīng)用程序性壞死特異性抑制劑necrostatin-1 (Nec-1)干預(yù)OVX大鼠骨質(zhì)疏松模型，可有效減少骨細胞程序性壞死，進而減少了骨量的丟失[4]。但在PMOP的發(fā)病過程，是何種因素促發(fā)骨細胞發(fā)生程序性壞死的，目前尚不清楚。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)對PMOP骨代謝的調(diào)節(jié)起著重要作用[5]。大鼠OVX術(shù)后TNF-α在肝組織勻漿明顯增加[6]；健康的絕經(jīng)前婦女接受OVX術(shù)后TNF-α增加，術(shù)后8 周達到最高水平，這些變化與骨吸收指標密切相關(guān)[7]。已證實TNF-α與其受體作用可激活細胞程序性死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進而導(dǎo)致細胞發(fā)生程序性壞死[8]。TNF-α能否促發(fā)骨細胞發(fā)生程序性壞死，尚不清楚。本研究旨在驗證TNF-α能否促發(fā)小鼠長骨骨樣細胞株MLO-Y4發(fā)生程序性壞死，并初步探討其發(fā)生機制，為PMOP的發(fā)病機理提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

MLO-Y4細胞株(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein，RIP)3-siRNA(上海吉瑪基因公司，正義鏈為CCAAGUAUGACCAAGCACAdTdT，反義鏈為UGU-GCUUGGUCAUACUUGGdTdT)；TNF-α(Sino Biological Inc.)；Lipofectamine 2000(Invitrogen)；小鼠抗RIP1單克隆抗體和兔抗RIP3多克隆抗體(Abcam)；兔抗cleaved caspase-3單克隆抗體(Cell Signaling Technology)；兔抗β-actin單克隆抗體(Santa Cruz)；Nec-1(Sigma-Aldrich)；DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)；臨用時加入胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS；Gibco)配制為含10% FBS 的培養(yǎng)基。

2 實驗方法

2.1 實驗分組及處理 實驗分為5組，處理方法如下[9]：正常對照(control)組單純采用DMEM/F12完全培養(yǎng)基作用MLO-Y4細胞24 h；TNF-α組用含50 μg/L TNF-α的DMEM/F12完全培養(yǎng)基作用MLO-Y4細胞24 h[10]；TNF-α+Nec-1組先用含50 μmol/L Nec-1的DMEM/F12完全培養(yǎng)基作用MLO-Y4細胞30 min，再用含50 μg/L TNF-α的DMEM/F12完全培養(yǎng)基作用MLO-Y4細胞24 h；TNF-α+Z-VAD組先用含20 μmol/L Z-VAD的DMEM/F12完全培養(yǎng)基作用MLO-Y4細胞30 min，再用含50 μg/L TNF-α的DMEM/F12完全培養(yǎng)基作用MLO-Y4細胞24 h；TNF-α+RIP3-siRNA組的處理方法見2.2。

2.2 RIP3-siRNA轉(zhuǎn)染MLO-Y4細胞 根據(jù)轉(zhuǎn)染方式不同分成對照組(僅用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑)、陰性對照siRNA(negative control siRNA，NC-siRNA)轉(zhuǎn)染組(Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑+NC-siRNA序列)和RIP3-siRNA轉(zhuǎn)染組(Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑+RIP3-siRNA序列)。取生長狀態(tài)良好的MLO-Y4細胞，按1×108/L接種于6孔板內(nèi)，每孔加500 μL DMEM/F12完全培養(yǎng)基，放入5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)過夜，次日細胞密度約為培養(yǎng)瓶底面積的80%左右時進行轉(zhuǎn)染。用25 μL Opti-MEM稀釋1.0 μL 脂質(zhì)體Lipofectamine 2000配制為轉(zhuǎn)染試劑，輕輕震蕩混勻，室溫靜置5 min待用。將RIP3-siRNA或NC-siRNA序列混于轉(zhuǎn)染試劑配制終濃度為100 nmol/L轉(zhuǎn)染混合物，室溫靜置20 min。棄掉各孔內(nèi)的舊DMEM/F12完全培養(yǎng)基，根據(jù)不同組別每孔加入100 μL轉(zhuǎn)染混合物，放入5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，6 h后6孔板更換為含有50 μg/L TNF-α的DMEM/F12完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收集細胞提取總蛋白。應(yīng)用Western blot實驗驗證RIP3-siRNA對RIP3蛋白的影響。

2.3 流式細胞術(shù)檢測TNF-α誘導(dǎo)MLO-Y4細胞凋亡和壞死 收集各組細胞，用0.01 mol/L PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化后，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管，1 500 r/min離心5 min，用1 mL預(yù)冷的PBS重懸細胞，Annexin V-FITC/PI 雙染法測定細胞凋亡和壞死率，此實驗重復(fù)3次。采用右下象限(Annexin V+/PI-，代表早期凋亡細胞)和右上象限(Annexin V+/PI+，代表晚期凋亡或壞死細胞)的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.4 電鏡觀察細胞的形態(tài)變化 各組處理的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，800 r/min離心5 min，2.5%戊二醛固定液保存所得細胞團塊。細胞團塊經(jīng)2%鋨酸(pH 7.4)常溫下固定4 h后，梯度乙醇脫水，轉(zhuǎn)入丙酮。然后包埋于環(huán)氧樹脂包埋劑中。應(yīng)用超微切片機將標本切成50 nm超薄切片，放置在Formvar膜包被的銅網(wǎng)格上晾干。最后用3%醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，于透射電鏡下觀察骨組織超微結(jié)構(gòu)。

2.5 激光共聚焦顯微成像檢測RIP1和RIP3蛋白的共表達 向24孔板內(nèi)的爬片中央滴入細胞懸液約1×106/L個細胞，放入5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，6 h后細胞固定在爬片上，再向各孔內(nèi)加入10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基100 μL，放入5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)過夜。次日各組細胞處理同方法2.1。收集細胞爬片，PBS緩沖液沖洗3次，加入4%多聚甲醛固定細胞10 min，棄上清，PBS緩沖液沖洗3次；應(yīng)用0.3%Triton X-100室溫下破膜處理10 min；PBS緩沖液沖洗3次；滴加山羊血清封閉液50 μL，室溫孵育10 min，甩去封閉液；滴加RIP1和RIP3的 I 抗混合液(RIP1小鼠單克隆抗體和RIP3兔多克隆抗體均稀釋為1∶100，二者混合)，在4 ℃冰箱中孵育過夜；次日，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h；PBS緩沖液沖洗3次；(以下操作步驟在暗室進行)滴加1∶200稀釋的Dylight 594山羊抗小鼠IgG和Dylight 488山羊抗兔IgG混合液，常溫下孵育1 h；PBS緩沖液沖洗3次；DAPI復(fù)染細胞核5 min；PBS緩沖液沖洗3次；用50%甘油封片，指甲油固定。在LEICA TCS SP2激光共聚焦顯微鏡下，采集圖片，每個樣本隨機選6個視野計算陽性細胞百分數(shù)，進行統(tǒng)計分析。

2.6 Western blot檢測RIP1、RIP3和cleaved caspase-3蛋白的水平 倒掉各組T25培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，倒掉洗滌液，盡量去盡殘液。用刮匙從T25培養(yǎng)瓶收集各組處理的細胞，加入蛋白裂解液，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，并配平；凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，5% BSA-TBST室溫封閉；加 I 抗：RIP1(1∶1 000)、 RIP3(1∶1 000)、cleaved caspase-3(1∶1 000)和β-actin(1∶2 000)，4 ℃過夜；加入 II 抗37 ℃孵育1 h；TBST洗膜，ECL發(fā)光顯色。以β-actin作為內(nèi)參照，采用VILBER Fusion FX7分析軟件進行定量分析。

2.7 熒光標記定量分析活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的生成 用DCFH-DA懸浮各組處理好的細胞，調(diào)整細胞濃度為5×109/L，每組設(shè)置3孔,每孔加200 μL樣本，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育25 min，每5 min輕輕震蕩1次，用無血清的新鮮培養(yǎng)基反復(fù)漂洗細胞3次，除去未進入細胞內(nèi)的DCHF-DA。調(diào)整熒光酶標儀激發(fā)波長為488 nm，在發(fā)射波長525 nm下檢測各組細胞的熒光強度，此實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 RIP3-siRNA可有效干擾MLO-Y4細胞的RIP3蛋白表達

提取細胞總蛋白，應(yīng)用Western blot檢測各組細胞RIP3蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組比較，RIP3-siRNA轉(zhuǎn)染組的RIP3蛋白表達明顯降低(P<0.01)，而RIP3蛋白表達在NC-siRNA組與對照組無顯著差異，說明該RIP3-siRNA序列對有效干擾了RIP3的表達，見圖1。

Figure 1.The effect of RIP3-siRNA on RIP3 protein expression detected by Western blot analysis. Mean±SEM.n=3.##P<0.01vscontrol group.

圖1 Western blot檢測RIP3-siRNA對MLO-Y4細胞RIP3表達的影響

2 TNF-α能有效誘導(dǎo)MLO-Y4細胞發(fā)生凋亡和壞死

與對照組相比，TNF-α組的早期凋亡率明顯增高(P<0.01)，Z-VAD能有效降低MLO-Y4細胞的早期凋亡率(P<0.01)，而Nec-1和RIP3-siRNA對MLO-Y4細胞的早期凋亡率無明顯影響。TNF-α組的晚期凋亡或壞死率較對照組明顯增高(P<0.01)，Nec-1、Z-VAD和RIP3-siRNA均能有效降低MLO-Y4細胞的晚期凋亡或壞死率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

3 TNF-α對MLO-Y4細胞形態(tài)學(xué)的影響

透射電鏡觀察結(jié)果示，在TNF-α組可見MLO-Y4細胞呈明顯的壞死形態(tài)學(xué)特征：線粒體腫脹增多，細胞膜破裂，胞漿內(nèi)容物外溢；在TNF-α+Z-VAD組同樣可以見到壞死的細胞。而TNF-α+Nec-1和TNF-α+RIP3-siRNA組未發(fā)現(xiàn)明顯壞死的細胞，僅見少數(shù)細胞線粒體呈輕度腫脹，見圖3。

Figure 2.Comparison of apoptosis/necrosis rate in each group. Mean±SEM.n=3.##P<0.01vscontrol group；**P<0.01vsTNF-α group.

圖2 各組MLO-Y4細胞凋亡或壞死率的比較

Figure 3.The morphological changes of MLO-Y4 cells were visualized by TEM. The scale bar=2 μm.

圖3 透射電鏡觀察各組MLO-Y4細胞形態(tài)學(xué)變化

4 TNF-α對MLO-Y4細胞程序性壞死特異性蛋白表達的影響

RIP1和RIP3是程序性壞死發(fā)生過程中的關(guān)鍵信號分子，且二者相互作用參與形成促程序性壞死小體[11]。本實驗應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測了RIP1和RIP3蛋白在MLO-Y4細胞的共表達情況。鏡下可見RIP1和RIP3蛋白主要表達于細胞胞漿，RIP1(紅色)和RIP3(綠色)陽性細胞表達重疊呈黃色，見圖4。共表達陽性率結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α組細胞RIP1和RIP3的共表達陽性率明顯增高(P<0.01)，Nec-1和RIP3-siRNA能有效降低MLO-Y4細胞RIP1和RIP3共表達陽性率(P<0.01)，見圖5。

應(yīng)用Western blot檢測程序性壞死關(guān)鍵蛋白RIP1、RIP3及凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3的表達水平。與對照相比，TNF-α組的RIP1、RIP3及cleaved caspase-3蛋白水平明顯增高(P<0.01)。Nec-1能有效抑制RIP1蛋白的表達(P<0.01)，而Z-VAD對RIP1蛋白表達無影響。RIP3-siRNA能有效降低RIP3蛋白的表達(P<0.01)。與TNF-α組相比，TNF-α+Z-VAD組的cleaved caspase-3蛋白水平明顯下降(P<0.01)，但是Nec-1對cleaved caspase-3蛋白水平無影響，見圖6。

Figure 4.The representative immunofluorescence images of MLO-Y4 cells for RIP1 (red), RIP3 (green), and DAPI labeling. RIP1 and RIP3 double positive cells (yellow) were shown. The scale bar=50 μm.

圖4 激光共聚焦觀察RIP1和RIP3 蛋白在MLO-Y4細胞共表達情況

Figure 5.The quantitative analysis of RIP1-RIP3-positive cells. Mean±SEM.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsTNF-α group.

圖5 定量分析RIP1-RIP3共表達陽性的MLO-Y4細胞百分比

5 熒光標記法檢測各組細胞ROS水平的變化

TNF-α組的ROS水平較對照組明顯增高(P<0.01)。而Nec-1、Z-VAD及RIP3-siRNA均能有效抑制TNF-α導(dǎo)致的MLO-Y4細胞ROS水平增高(P<0.01)，見圖7。

討 論

在骨骼修復(fù)重建中，骨細胞能夠?qū)⑼饨绱碳?yīng)力信號轉(zhuǎn)化為生化信號，通過骨細胞-小管結(jié)構(gòu)體系傳遞信號，調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的功能。骨細胞的大量死亡使骨量丟失，損害了骨組織的微結(jié)構(gòu)，增加了骨脆性；同時骨細胞死亡破壞了骨細胞-小管結(jié)構(gòu)體系，造成對骨陷窩-小管系統(tǒng)內(nèi)液體流動的改變，阻礙了骨組織的重建，結(jié)果形成了不可修復(fù)的骨缺損[12]。那么在病理狀態(tài)下，如果能阻斷骨細胞的過度死亡，就可能有效維護骨重建中骨吸收和骨形成的平衡。因此，探討骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中骨細胞死亡的分子生物學(xué)調(diào)控機制，可能為骨質(zhì)疏松防治提供新靶點。

隨著人們對細胞死亡方式不斷的深入研究，發(fā)現(xiàn)有一種細胞死亡方式具有典型細胞壞死的形態(tài)學(xué)特征，而且可以被調(diào)控，這與以往的細胞壞死具有本質(zhì)的不同，因此人們將這種細胞死亡方式命名為“程序性壞死”[13]。發(fā)生程序性壞死的細胞可以被Nec-1特異性抑制，而不受凋亡抑制劑(如Z-VAD)的影響[14]。在許多生理和病理過程中，程序性壞死起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[15]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)OVX大鼠骨質(zhì)疏松模型骨組織中具有典型壞死形態(tài)特征的程序性壞死骨細胞，RIP1和RIP3共表達且水平明顯增高，應(yīng)用1.65 mg/kg Nec-1連續(xù)腹膜下注射4周可有效減少骨細胞程序性壞死，進而減少了骨量的丟失[4]。這些結(jié)果提示在OVX大鼠骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中，程序性壞死可能是引起骨細胞死亡的一種重要方式。另外，我們還發(fā)現(xiàn)大鼠行OVX術(shù)后，TNF-α在骨細胞表達顯著增強[4]，這與以往的研究報道一致[6-7]。但TNF-α是否誘導(dǎo)骨細胞程序性壞死參與骨質(zhì)疏松癥發(fā)病過程的機制仍不完全明確。

Figure 6.The protein levels of RIP1, RIP3 and cleaved caspase-3 were detected by Western blot. Mean±SEM.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsTNF-α group.

圖6 Western blot分析各組MLO-Y4細胞RIP1、RIP3和cleaved caspase-3蛋白水平的變化

Figure 7.DCFH-DA analysis for determining the ROS levels in each group. Mean±SEM.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsTNF-α group.

圖7 各組MLO-Y4細胞ROS水平的比較

本實驗應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測到50 μg/L TNF-α誘導(dǎo)MLO-Y4細胞的凋亡和壞死率明顯高于對照組。為了區(qū)分這些死亡的細胞是程序性壞死還是凋亡，我們分別應(yīng)用程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1、凋亡抑制劑Z-VAD以及RIP3-siRNA干預(yù)TNF-α誘導(dǎo)的MLO-Y4細胞作了進一步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)50 μg/L的TNF-α誘導(dǎo)MLO-Y4細胞24 h，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)大量的細胞腫脹、線粒體腫脹增多、細胞膜破裂、胞漿及細胞器外溢。應(yīng)用Nec-1預(yù)處理MLO-Y4細胞后，在電鏡下沒有發(fā)現(xiàn)典型的壞死細胞。Wes-tern blot檢測發(fā)現(xiàn)，TNF-α干預(yù)MLO-Y4細胞24 h后RIP3、RIP1及cleaved caspase-3的蛋白水平顯著增高，Nec-1預(yù)處理后RIP1明顯降低，Z-VAD預(yù)處理后cleaved caspase-3的蛋白水平顯著降低，RIP3-siRNA能有效減少RIP3表達，結(jié)合電鏡結(jié)果，我們推測TNF-α誘導(dǎo)MLO-Y4細胞發(fā)生了程序性壞死。

研究證實RIP1和RIP3能相互磷酸化，共同參與程序性壞死小體 “necrosome”的形成，從而啟動程序性壞死[13]。在本實驗中Nec-1和RIP3-siRNA能分別抑制RIP1 和RIP3的表達，可能影響RIP1和RIP3的相互磷酸化，抑制程序性壞死小體的形成，從而阻斷程序性壞死。我們應(yīng)用激光共聚焦纖維成像觀察了RIP1-RIP3的共表達情況，發(fā)現(xiàn)在TNF-α干預(yù)MLO-Y4細胞24 h后 RIP1-RIP3共表達率高達33.96%±2.67%，而應(yīng)用Nec-1或RIP3-siRNA處理后，RIP1-RIP3的共表達率明顯下降，而Z-VAD對此無影響。RIP3-siRNA處理后RIP3蛋白表達下降，電鏡下看不到壞死樣的細胞，流式細胞術(shù)檢測細胞壞死率明顯降低。這些結(jié)果與程序性壞死的特征一致[14-15]，進一步證實MLO-Y4細胞發(fā)生了RIP3介導(dǎo)的程序性壞死。

ROS在程序性壞死過程中擔(dān)任著執(zhí)行者的角色[16]，它可以誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)或改變某些通道蛋白的功能,從而導(dǎo)致細胞損傷。有研究報道高表達的RIP3可以活化磷酸化酶、谷氨酸脫氫酶1等，促使線粒體能量代謝增強，ROS產(chǎn)生增多，導(dǎo)致細胞發(fā)生程序性壞死[17]?？梢奟IP1-RIP3復(fù)合物作為程序性壞死信號通路的上游信號分子調(diào)控ROS的產(chǎn)量[18-19]。與這些報道相一致，我們也發(fā)現(xiàn)TNF-α干預(yù)MLO-Y4細胞24 h后ROS產(chǎn)生增多。在Nec-1抑制上游信號分子RIP1后或RIP3-siRNA干擾RIP3后，MLO-Y4細胞過量的ROS含量也隨之下降。我們推測ROS可能是MLO-Y4細胞程序性壞死的執(zhí)行者。另外，在本研究中也發(fā)現(xiàn)：使用凋亡抑制劑Z-VAD后，如同使用壞死抑制劑Nec-1或RIP3-siRNA干擾RIP3后一樣，MLO-Y4細胞過量的ROS含量也隨之下降，提示ROS參與了細胞的凋亡過程，這與以往研究報道一致[20-21]。但是，對于TNF-α干預(yù)MLO-Y4細胞24 h后細胞發(fā)生凋亡和程序性壞死的比例，我們將作進一步研究。

綜上所述，TNF-α可誘導(dǎo)MLO-Y4 骨細胞發(fā)生了RIP3依賴的程序性壞死，ROS可能是MLO-Y4細胞程序性壞死的執(zhí)行者。但骨細胞程序性壞死促發(fā)骨質(zhì)疏松的具體機制有待進一步深入研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

TNF-α induces PIP3-mediated necroptosis in MLO-Y4 cells

CUI Hong-wang1, MENG Zhi-bin1, HUANG Tao1, ZHU Kai-zhong1, ZHAO Zhi-rong1, ZHU Yong-jun2

(1DepartmentofSpineandOsteopathicSurgery，2DepartmentofNephrologyandRheumatology,TheFirstAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,Haikou570102,China.E-mail:cqchw2013@sina.com)

AIM: To explore whether tumor necrosis factor-α (TNF-α) induces necroptosis in murine long bone osteocyte-like cell line MLO-Y4 and the possible mechanism. METHODS: The MLO-Y4 cells were divided into control group， TNF-α group， TNF-α+necrostatin-1 (Nec-1) group, TNF-α+Z-VAD group and TNF-α+receptor-interacting protein 3 (RIP3)-siRNA group. The death rate of MLO-Y4 cells was assessed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. The morphological features of the cells were observed under transmission electron microscope (TEM). The protein levels of RIP1, RIP3 and cleaved caspase-3 were determined by Western blot. Finally, the numbers of total cells and RIP1-RIP3-positive cells were observed under laser scanning confocal microscope. The production of reactive oxygen species (ROS) in the cells was measured by DCFH-DA staining. RESULTS: Compared with control group, the apoptotic or necroptotic rate of the cells induced by TNF-α was increased significantly (P<0.01). The increased apoptotic or necroptotic rate was dramatically reduced by treating with Nec-1， Z-VAD or RIP3-siRNA transfection (P<0.01). In TNF-α group and TNF-α+Z-VAD group, a lot of MLO-Y4 cells with typical necroptotic morphological features were observed under TEM. However, obvious necroptotic cells were not found in Nec-1 or RIP3-siRNA treatment group. The protein level of RIP1 in the cells treated with Nec-1 was sharply lower than that in TNF-α group (P<0.01). However, Z-VAD did not reduce the elevated levels of RIP1 and RIP3. RIP3-siRNA effectively down-regulated the protein level of RIP3 compared with TNF-α group (P<0.01). Nec-1 effectively down-regulated the protein levels of RIP1 colocalized with RIP3 compared with TNF-α group (P<0.01). However, Z-VAD did not reduce the levels of RIP1 colocalized with RIP3. Nec-1, Z-VAD and RIP3 siRNA significantly decreased the ROS levels (P<0.01). CONCLUSION: TNF-α induces the necroptosis of MLO-Y4 cells. RIP3 play vital roles in the cell necroptotic signal pathway. ROS may be the executor of necroptosis of MLO-Y4 cells.

Tumor necrosis factor-α; Necroptosis; Receptor-interacting protein 3; MLO-Y4 cells

1000- 4718(2017)08- 1499- 07

2017- 04- 14

2017- 07- 12

海南省自然科學(xué)基金資助項目(No. 817326)

R681

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.025

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