不同艾灸預處理時間對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3表達的影響

王超，劉薇薇，黃潔，劉密，譚成富，常小榮，嚴潔

(1.湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

針 灸 經 絡

不同艾灸預處理時間對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3表達的影響

王超1，劉薇薇1，黃潔2*，劉密1，譚成富1，常小榮1，嚴潔1

(1.湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

目的：通過觀察不同艾灸預處理時間對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞中低氧誘導因子-1α(HIF-1α)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)及天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3) 蛋白和基因表達的變化，探討艾灸預處理對MIRI預防保護機制。方法：將40只大鼠分為正常組、模型組、艾灸預處理5天組、艾灸預處理10天組。取“內關”穴行艾灸預處理5 d和10 d后，采用冠脈結扎法建立MIRI模型。運用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術以及Western blot方法檢測大鼠心肌細胞中Bcl-2、HIF-1α及Caspase-3蛋白及基因表達。結果：與正常組比較，模型組HIF-1α和Caspase-3蛋白及mRNA表達均高于正常水平(P<0.01)，Bcl-2蛋白及mRNA表達低于正常水平(P<0.01)。與模型組比較，艾灸預處理組HIF-1α蛋白及mRNA表達降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白及mRNA表達增高(P<0.01)，Caspase-3蛋白及mRNA表達下降(P<0.01 orP<0.05)。與5天組比較，艾灸預處理10天組HIF-1α mRNA表達明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白顯著增高(P<0.05)，Caspase-3蛋白及mRNA表達顯著下降(P<0.01)。結論：艾灸預處理可通過降低MIRI大鼠心肌細胞中HIF-1α、Caspase-3的含量，增加心肌細胞中Bcl-2的含量，改善心肌缺血缺氧狀態(tài)以及抑制心肌細胞凋亡，對損傷心肌細胞起到預防保護作用。其中艾灸預處理10天對心肌細胞保護作用優(yōu)于5天。

艾灸預處理；心肌缺血再灌注損傷；低氧誘導因子-1α；B細胞淋巴瘤/白血病-2；天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3

冠心病已成為全球范圍內高致病率和高死亡率的疾病之一[1]。目前臨床上主要通過藥物、介入、外科手術等手段來改善冠狀動脈血供、降低心肌耗氧量。然而各種血運重建手段的運用，在恢復心肌供血供氧同時可導致心肌細胞的損傷甚至壞死，稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)[2-3]。本課題組前期動物實驗證實，針灸預處理對MIRI造成的缺血心肌具有良好的保護作用[4-6]。與針刺比較，艾灸更安全，且易被患者接受的。本實驗旨在觀察不同艾灸預處理時間對MIRI大鼠心肌細胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3蛋白和基因表達的變化，探討艾灸預處理對MIRI心肌細胞的保護是否與這三者有關，同時明確不同艾灸預處理時間是否對心肌細胞作用結果存在差異。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體質量(220±10)g，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK(湘)2011-0003。飼養(yǎng)溫度22～25℃，濕度40%～60%。適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為4組，正常組、模型組、艾灸預處理5天組、艾灸預處理10天組。實驗程序經湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器

水合氯醛(上海山浦化工有限公司)；生理鹽水(雙鶴藥業(yè))；逆轉錄試劑盒(Fermentas)；Trizol(Invitrogen)。

ALC-V108動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)；ECG-9620P三道自動分析心電圖機(上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司)；艾條(南陽漢醫(yī)艾絨有限責任公司，豫衛(wèi)健用字[2004]第N0248號，規(guī)格：4 mm×120 mm×90支)；自制簡易艾灸架；TS-92搖床(其林貝爾)；TGL-18R臺式冷凍離心機(深圳黑馬)；164-5050電泳儀(Bio-rad)；PIKO REAL 96熒光定量RCP儀(Thermo)。

1.3 造模方法

模型組、艾灸預處理5天組及艾灸預處理10天組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100g)全身麻醉，將其仰臥位固定于鼠板之上，術前大鼠胸前區(qū)去毛，碘伏消毒，開胸沿左側第四、五肋骨間剪開，輕輕剪破心包膜，提起左心耳，在冠狀動脈左前降支1/3處穿0號線，置一硅膠管結扎，以心電圖ST段的改變及冠脈向外膨脹發(fā)紺為結扎成功標志，結扎40 min后，剪開硅膠管恢復左前降支灌流60 min。

1.4 穴位定位和處理方法

穴位定位參考常用動物穴位定位[7]，內關穴位于前肢內側離腕關節(jié)約3 mm左右的尺橈骨縫間。

正常組和模型組大鼠每天捆綁束縛20 min，連續(xù)5 d；艾灸預處理5天組大鼠每天捆綁固定于鼠板上，將艾條點燃后固定于自制灸架上，燃燒端分別對準大鼠雙側內關穴，距離約0.5 cm左右，內關穴局部溫度控制在(42±1)℃(隨著艾條的燃燒及時彈去灰燼并調整距離)，每次20 min，1次/d，共5 d；艾灸預處理10天組同樣固定、取穴、施灸，每次20 min，1次/d，共10 d。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 Western blot檢測

檢測大鼠心肌細胞中Bcl-2、HIF-1α及Caspase-3蛋白。剪取0.25 g心肌組織緩沖液洗凈后反復研磨，冰上蛋白裂解30 min，離心后取上清(即為組織蛋白)。按照BCA蛋白定量試劑盒(Wellbio)測定蛋白濃度。吸取蛋白組織與5×loading buffer混勻，沸水煮5 min制備電泳樣本，根據(jù)蛋白定量結果進行SDS-PAGE穩(wěn)壓電泳(濃縮膠電泳電壓為80 V，分離膠電泳電壓為120 V)。待溴酚藍電泳至膠底部時終止電泳。將PVDF膜與濾紙依次排列置于轉膜緩沖液中完全浸透，將膠上的蛋白轉移至PVDF膜(HIF-1α約2 h，Bcl-2約30 min， Caspase-3約40 min)。將膜取出漂洗后，按一定稀釋比例(HIF-1α∶1∶200；Bcl-2∶1∶500；Caspase-3∶1∶1000)與對應抗體進行一抗孵育，與HRP標記的二抗(稀釋比例1∶3000)進行二抗孵育。使用ECL化學發(fā)光液顯色曝光，顯影沖洗。

1.5.2 RT-PCR檢測

檢測心肌細胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3基因的相對表達。取心肌組織約0.02 g加入1 mL Trizol研磨勻漿，加三氯甲烷震蕩，離心加等體積的異丙醇靜置。低溫離心后棄上清保留白色沉淀，加乙醇震蕩。低溫離心棄上清加無菌無酶水溶解沉淀。吸取2μL RNA溶液運用紫外分光光度計測定在260 nm與280 nm處吸光度值，計算其濃度跟純度。經過逆轉錄cDNA，PCR擴增反應(actin為內參，引物序列及擴增長度見表1)，讀取Ct(cycle threshold)值，采用2-△△Ct值反映各樣品相對于對照組樣品目的基因的表達水平，重復3次獨立實驗，得到均值。

表1 引物序列及擴增長度

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 艾灸預處理對MIRI大鼠心肌細胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3蛋白影響

結果見表2。與正常組比較，模型組大鼠心肌細胞中Bcl-2的蛋白表達明顯降低(P<0.01)，HIF-1α及Caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，艾灸預處理5天組與艾灸預處理10天組大鼠心肌細胞中Bcl-2的蛋白表達顯著升高(P<0.01)，HIF-1α及Caspase-3蛋白表達明顯降低(P<0.01)；與艾灸預處理5天組比較，艾灸預處理10天組大鼠Bcl-2的蛋白表達顯著升高(P<0.05)，Caspase-3的蛋白表達顯著降低(P<0.01)，而心肌細胞中HIF-1α的蛋白表達未見明顯差異(P>0.05)。

2.2 艾灸預處理組對MIRI大鼠心肌細胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3基因的相對表達

結果見表3。與正常組比較，模型組大鼠心肌細胞中Bcl-2 mRNA含量明顯降低(P<0.01)，HIF-1α及Caspase-3 mRNA含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，艾灸預處理5天組與艾灸預處理10天組大鼠心肌細胞中Bcl-2 mRNA含量顯著升高(P<0.01)，HIF-1α及Caspase-3 mRNA含量明顯降低(P<0.01 orP<0.05)；與艾灸預處理5天組比較，艾灸預處理10天組大鼠HIF-1α mRNA含量及Caspase-3 mRNA含量顯著降低(P<0.05)，而心肌細胞中Bcl-2 mRNA含量未見明顯差異(P>0.05)。

表2 各組心肌細胞HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3蛋白表達的比較

注：與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較，▲P<0.01;與艾灸預處理5天組比較,●P<0.05,●●P<0.01

表3 各組心肌細胞HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3 mRNA含量比較

注：與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較，▲P<0.01,P<0.05;與艾灸預處理5天組比較，●P<0.05,●●P<0.01

3 討論

HIF-1α是維持體內氧穩(wěn)態(tài)平衡調節(jié)的核轉錄因子，心肌組織在缺血缺氧條件下可應激性的引起HIF-1α表達大量增加，在缺血的心肌組織中高表達HIF-1α會進一步激活細胞膜上的酸敏感離子通道，從而進一步破壞心肌細胞[8]。MIRI過程中最主要的分子生物變化表現(xiàn)為心肌細胞的大量凋亡，Bcl-2家族蛋白就是一類在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白質，其中Bcl-2為抗凋亡蛋白，其機制主要是通過抑制Caspase蛋白酶活性從而抑制細胞凋亡。一般情況下，當細胞受到損傷或者細胞凋亡時，Bcl-2基因表達則顯著下降。Caspase-3是參與細胞凋亡啟動與執(zhí)行的Caspase家族中最關鍵的凋亡蛋白酶，動物實驗證實[9]，由Caspase-3介導的心肌細胞凋亡是MIRI發(fā)生的重要機制。本研究結果顯示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠心肌細胞內HIF-1α和Caspase-3蛋白及mRNA表達均高于正常水平，Bcl-2蛋白及mRNA表達均低于正常水平，皆提示本實驗所采用的造模方法能使大鼠造成MIRI模型，引起大鼠心肌缺血缺氧，造成實驗大鼠心肌損傷，使大鼠心肌細胞凋亡。

中醫(yī)學歷來注重對疾病的預防，早在《內經》中已提出“不治已病治未病”。針灸“治未病”古稱“逆針灸”，即無病而施用針灸，以疏通經絡氣血，調節(jié)臟腑陰陽，以增強人體抗病能力。近年來針灸界提出的“針灸預處理”，與“逆針灸”有著相似之處。李曉泓[10]發(fā)現(xiàn)針灸“治未病”與現(xiàn)代醫(yī)學應激理論有一定的聯(lián)系，即機體通過采取一定物理或者化學預處理方法激發(fā)機體出現(xiàn)適度應激從而達到激發(fā)機體抗病能力的目的，這一特點與針灸預處理理論不謀而合。臨床上MIRI產生機制尚未明確，對其防治手段包括缺血預適應(ischemic preconditioning，IP)、缺血后處理、遠程缺血預適應、藥物治療等[11]，其中心肌缺血預適應(IP)作為目前最有效的內源性保護機制，是指心肌在遭受反復短暫缺血后對缺血再灌注損傷的耐受力增強，能顯著縮小心肌梗死面積、減輕心肌細胞超微結構損傷[12]，對心肌細胞能起到明顯的保護作用。課題組前期實驗證實[4-6],針灸預處理能取得與心肌缺血預適應相似的效果。

艾灸預處理與針刺預處理重視既病防傳的特點比較，更加注重于未病先防[13]。現(xiàn)代研究[14]證實艾灸存在藥物作用、溫熱作用與近紅外光輻射作用3大主要機制，其中溫熱作用引起的臨床效應稱之為溫補效應、溫通效應[15]。溫熱作用是產生灸效的主要因素，其中決定灸效的關鍵是灸量，而構成有效灸量的核心在于灸時。與用藥累積量同理，施灸時間越長能釋放更多被機體吸收的能量和化學物質[16]。中醫(yī)學中尚提及“心肌缺血再灌注損傷”這一病名，結合臨床表現(xiàn)將其歸于“胸痹”“心痛”范疇[17-18]。病性總屬本虛標實，故辨證論治不外乎“補”“通”兩義。艾灸預處理治療MIRI取之艾灸溫補溫通作用中“補虛固本”“通脈散瘀”之義。內關穴屬心包經之絡穴，外邪侵心治之以心包絡，取“代君受邪”之義。又為八脈交會穴，通陰維脈，為治療心胸疾病之首選穴位[19-20]。課題組前期實驗皆已經證實[3-5],針灸預處理“內關”穴對心肌細胞存在有保護作用。

本實驗結果顯示，與模型組比較，兩組艾灸預處理大鼠心肌細胞中HIF-1α蛋白及mRNA表達降低，提示艾灸預處理能降低HIF-1α濃度，改善心肌缺血、缺氧狀態(tài)。Bcl-2蛋白及mRNA表達增高，Caspase-3蛋白及mRNA表達均下調，提示艾灸預處理通過增加Bcl-2濃度，抑制Caspase-3蛋白酶活性，從而緩解MIRI引起的心肌細胞凋亡。與艾灸預處理5天組比較，艾灸預處理10天組HIF-1α mRNA表達顯著降低，提示10天組能更有效的緩解心肌缺血缺氧狀態(tài)。比較艾灸預處理5天組，Bcl-2蛋白顯著增高，Caspase-3蛋白及mRNA表達明顯降低，提示艾灸預處理10天組通過進一步高表達Bcl-2更有效的阻斷Caspase-3凋亡蛋白酶的激活，從而抑制細胞凋亡。

綜上所述，艾灸內關能顯著改善心肌缺血缺氧狀態(tài)以及抑制心肌細胞凋亡。隨著對心肌缺血發(fā)病機制的不斷深入研究，艾灸對于防治心肌缺血有巨大的學術研究空間和臨床運用價值。但不同艾灸預處理時間對心肌缺血療效中存在差異，與施灸時間和有效灸量有關，但其作用機制尚未明確，有待課題組進一步研究。

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Effect of Different Length of Moxibustion Preconditioning on the Expression of HIF-1α, Bcl-2 and Caspase-3 in Myocardial Cells of MIRI Rats

WANG Chao1, LIU Wei-wei1, HUANG Jie2, LIU Mi1, TAN Cheng-fu1, CHANG Xiao-rong1, YAN Jie1

(1.AcupunctureandMassageCollegeofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China;2.TheFirstAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410007,China)

Objective: To discuss the protective mechanism of moxibustion preconditioning for myocardial ischemia reperfusion injury(MIRI), by observing the expression changes of HIF-1α, Bcl-2, and Caspase-3 protein and mRNA in myocardial cells of MIRI rats by different length of moxibustion preconditioning. Methods: 40 rats were randomly divided into the normal group, the model group, the moxibustion preconditioning group A(preconditioning for 5 days), and moxibustion preconditioning group B(preconditioning for 10 days). Moxibustion preconditioning was applied on point of PC6 for 5 or 10 days respectively before MIRI model being established by coronary artery ligation. The expressions of HIF-1α, and Caspase-3 protein and mRNA in myocardial cells were detected with RT-PCR technique and Western blot method. Results: The protein and mRNA expressions of HIF-1α, and Caspase-3 in the model group was higher than the normal level(P<0.01); the protein and mRNA expressions of Bcl-2 in the model group was lower than the normal level (P<0.01). Compared to the model group, the expressions of HIF-1α and Caspase-3 in the moxibustion preconditioning groups decreased significantly(P<0.05,P<0.01), the expressions of Bcl-2 increased significantly(P<0.01), of which moxibustion preconditioning group B was superior to group A(P<0.05,P<0.01). Conclusion: Moxibustion preconditioning can decrease the expression of HIF-1α and Caspase-3 and increase the expression of Bcl-2 in myocardial cells to improve myocardial ischemia and inhibit myocardial apoptosis. The protective effect of moxibustion preconditioning for 10 days was better than that for 5 days.

Moxibustion preconditioning; Myocardial ischemia reperfusion injury; HIF-1α; Bcl-2; Caspase-3

2016-09-12

2017-02-20

2015年針灸推拿學湖南省“十二五”重點學科開放基金資助項目(06)；國家自然科學基金項目(81574080)；湖南省中管局課題(201521)；湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金項目(15k093)

王超(1974-)，女，碩士，副教授，碩士研究生導師，研究方向：經脈臟腑相關機制的研究。

*通訊作者：黃潔(1969-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導師,研究方向：經脈臟腑相關機制的研究。

R245;R285.5

A

1002-2392(2017)04-0070-04