補腎活血中藥復方對AGEs條件下體外純化培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞活力的影響

秦偉，謝學軍，李志英，楊宇琦，宋明霞，曹新偉，馬殿偉，榮素然，陳一兵，王雪菁

(1.廣州中醫(yī)藥大學附屬中山醫(yī)院，廣東 中山 528400;2.成都中醫(yī)藥大學眼科四川 成都 610075;3.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院眼科，廣東 廣州 510000)

實 驗 研 究

補腎活血中藥復方對AGEs條件下體外純化培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞活力的影響

秦偉1，謝學軍2*，李志英3，楊宇琦1，宋明霞2，曹新偉2，馬殿偉2，榮素然2，陳一兵1，王雪菁1

(1.廣州中醫(yī)藥大學附屬中山醫(yī)院，廣東 中山 528400;2.成都中醫(yī)藥大學眼科四川 成都 610075;3.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院眼科，廣東 廣州 510000)

目的：探討補腎活血中藥對體外糖基化終末產物(AGEs)條件下視網(wǎng)膜Müller細胞活力的影響。 方法：體外純化培養(yǎng)7天SD大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞至P2代；中藥血清藥理學方法制備補腎活血中藥含藥血清；體外純化培養(yǎng)的P2代視網(wǎng)膜Müller細胞置于AGEs狀態(tài)下，以補腎活血中藥含藥血清干預，檢測乳酸脫氫酶(LDH)漏出量。結果：(1)低AGEs組較正常對照組LDH值有升高趨勢，其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；高AGEs組較正常對照組LDH值明顯升高，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(2)正常中藥干預組與正常對照組LDH值比較，其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(3)AGEs中藥干預組較AGEs組LDH值明顯降低，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：AGEs條件可導致體外純化培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞細胞膜穩(wěn)定性下降，通透性增加，細胞活力降低，補腎活血中藥含藥血清可提高AGES條件下視網(wǎng)膜Müller細胞活力，這可能是補腎活血中藥防治糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)的藥物干預途徑之一。

補腎活血；Müller細胞；糖基化終末產物；乳酸脫氫酶

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見的慢性微血管并發(fā)癥，成人主要致盲疾病之一。DR發(fā)病機制有糖基化終末產物(advanced glycationend products，AGEs)形成堆積、細胞生長因子異常、多元醇肌醇代謝異常等，其中AGEs的形成和堆積，可導致氧化應激作用增強、血管舒縮調節(jié)功能異常、細胞外基質結構和功能異常、白細胞粘滯性增加并影響視網(wǎng)膜內皮細胞、周細胞、RPE細胞的生理功能，使視網(wǎng)膜屏障受到破壞[1]，可作為DR微血管病變的獨立危險因素。目前多項實驗表明視網(wǎng)膜Müller細胞在DR疾病過程中起重要作用，包括影響視網(wǎng)膜的代謝狀況, 破壞視網(wǎng)膜精細結構，分泌多種生長因子等，并可能參與免疫細胞增殖及視網(wǎng)膜神經細胞損傷過程[2]。本實驗組前期研究表明補腎活血中藥復方[3-7]是治療DR的一種有效方法。其作用機制是否與補腎活血中藥復方對糖尿病條件下視網(wǎng)膜Müller細胞活力的調節(jié)有關？綜上，本實驗旨在研究AGEs條件下補腎活血中藥復方對視網(wǎng)膜Müller細胞活力的影響，為臨床更好的應用補腎活血中藥防治DR提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

視網(wǎng)膜Müller細胞純化培養(yǎng)：清潔級Sprague-Dawley(SD)SD大鼠9只，新生7天，雌雄不限，成都中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供(川實動管質第99-11號)。

補腎活血中藥復方含藥血清：清潔級Sprague-Dawley(SD)SD大鼠50只，體質量約150～180 g，8～12周齡，雌雄各半，成都中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供(川實動管質第99-11號)。

實驗試劑：糖基化終末產物(AGEs北京博奧森生物技術有限公司)；谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)鑒定 I抗兔多克隆抗體(SANTA CRUZ，美國)，II抗生物素化羊克兔抗體(SANTA CRUZ，美國)；LDH檢測試劑(Bio-Rad，美國)。

1.2 中藥含藥血清制備

補腎活血中藥復方(由人參須、丹參、地黃、葛根等組方，成都中醫(yī)藥大學提供)。SD大鼠50只，體質量120～150 g，隨機分為補腎活血中藥復方血清組、空白對照組兩組，簡稱為中藥含藥血清組、空白血清組，具體方法同前期研究[8]。

1.3 視網(wǎng)膜Müller細胞原代及傳代培養(yǎng)及鑒定

SD大鼠9只，新生7天，酶消化法體外純化傳代培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞，GS免疫組化染色鑒定，實驗細胞取用P2代細胞；具體方法同前期研究[8]。

圖1 SD大鼠原代視網(wǎng)膜Müller細胞培養(yǎng)5 d后倒置顯微鏡像(×100)

圖2 SD大鼠P2代視網(wǎng)膜Müller細胞培養(yǎng)5 d后谷氨酰胺合成酶(GS)染色像(×200)

1.4 實驗分組

實驗1組：正常對照組，DMEM培養(yǎng)基，含20%空白血清；實驗2組：正常中藥干預組，DMEM培養(yǎng)基，含20%中藥含藥血清；實驗3組：低劑量AGEs組，含20%空白血清的DMEM培養(yǎng)基+終濃度為50 mg/L的AGEs；實驗4組：低劑量AGEs中藥干預組，含20%中藥含藥血清的DMEM培養(yǎng)基+終濃度為50mg/L的AGEs；實驗5組：高劑量AGEs組，含20%空白血清的DMEM培養(yǎng)基+終濃度為100 mg/L的AGEs；實驗6組：高劑量AGEs中藥干預組，含20%中藥含藥血清的DMEM培養(yǎng)基+終濃度為100 mg/L的AGEs。

1.5 視網(wǎng)膜Müller細胞LDH漏出量的測定

將密度為2×106個/mL的P2代Müller細胞接種于48孔培養(yǎng)板，每孔400 μL；培養(yǎng)24 h，棄用含有血清的培養(yǎng)液，加入無血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，棄用無血清培養(yǎng)液，加入上述分組不同條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)干預48 h；每孔收集培養(yǎng)基上清液50 μL，并快速加入LDH檢測試劑(具體操作參照LDH試劑盒說明書)，使用490型酶標儀檢測吸光度(OD)值的變化(440 nm)，計算LDH值，單位：U/L。

1.6 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)分析應用SPSS17.0軟件，多組間兩兩比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 視網(wǎng)膜Müller細胞鑒定結果

純化培養(yǎng)原代視網(wǎng)膜Müller細胞，GS染色陽性率達80%以上,表現(xiàn)為大量棕色陽性反應位于細胞核及細胞漿內，細胞周圍可見稍淺的免疫陽性反應，勾勒出的帶有終足以及蹼形爪的扁平細胞輪廓，P1代與P2代細胞GS染色陽性率達85%以上。見圖1、圖2。

2.2 AGEs條件對體外純化培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞LDH漏出量的影響

見表1。低AGEs組LDH值與正常對照組比較有升高趨勢，其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；高AGEs組LDH值較正常對照組升高，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 AGEs條件對視網(wǎng)膜Müller細胞LDH漏出量的影響

注：與正常對照組比較,▲P<0.05；與低AGEs組比較,●P<0.05

2.3 正常條件下補腎活血中藥復方含藥血清對體外純化培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞LDH漏出量的影響

見表2。正常中藥干預組的的LDH值與正常對照組比較，其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 正常條件下含藥血清對視網(wǎng)膜Müller細胞LDH漏出量的影響

2.3 補腎活血中藥復方含藥血清對低劑量AGEs條件下體外純化培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞LDH漏出量的影響

見表3。低AGEs中藥干預組LDH值較低AGEs組明顯降低，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 低劑量AGEs條件下含藥血清對視網(wǎng)膜Müller細胞LDH漏出量的影響

注：與低AGES組比較,▲P<0.05

2.4 補腎活血中藥復方含藥血清對高劑量AGEs條件下體外純化培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞LDH漏出量的影響

見表4。高AGEs中藥干預組LDH值較高劑量AGEs組明顯降低，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 高劑量AGEs條件下含藥血清對視網(wǎng)膜Müller細胞LDH漏出量的影響

注：與高AGES組比較,▲P<0.05

3 討論

DR屬祖國醫(yī)學“消渴目病”范疇，基本病機為氣陰兩虛、肝腎不足，瘀血阻絡、痰濁內生及痰瘀互結，以肝腎虧虛為本，以瘀為標[9-10]。滋補精血、補益肝腎為治療之本，活血化瘀通絡之法貫穿治療始終[11-12]。據(jù)此我們自擬補腎活血中藥復方用于治療DR。前期研究表明[3-7]它是治療DR的一種有效方法。

視網(wǎng)膜Müller細胞是視網(wǎng)膜最重要的神經膠質細胞，它貫穿整個視網(wǎng)膜，自外界膜縱向向內伸展，包裹并串聯(lián)起視網(wǎng)膜的各類神經細胞，對視網(wǎng)膜神經元細胞有營養(yǎng)支持作用，視網(wǎng)膜Müller細胞的突起緊緊貼附于視網(wǎng)膜毛細血管壁，是血-視網(wǎng)膜屏障重要的構成部分，這也決定了Müller細胞對維持視網(wǎng)膜穩(wěn)定的內環(huán)境將起到至關重要的作用[13]。同時，Müller細胞的形態(tài)結構也決定了Müller細胞極易受到各種病例因素的影響。視網(wǎng)膜電圖的b波起源于視網(wǎng)膜神經元和Müller細胞，有研究表明在DR早期即發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜電圖b波改變[14]，這就表明Müller細胞在DR的早期即發(fā)生了功能障礙。

細胞膜具有通透性，其通過選擇性的控制物質進出細胞膜而控制細胞內外的物質交換，從而使細胞處于一個相對穩(wěn)定的環(huán)境中。細胞膜通透性發(fā)生障礙是細胞代謝障礙的首要表現(xiàn)。有學者認為糖尿病患者各類并發(fā)癥發(fā)生的一個重要基礎病變就是細胞膜系統(tǒng)的異常，其是導致細胞內外環(huán)境改變的基本條件[15]。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)是一種活細胞內特異性標志酶，正常生理狀態(tài)下細胞外漏出量很少，病理條件下導致細胞膜通透性發(fā)生障礙，細胞外 LDH 漏出量則大量增多，且其累計漏出量與受損細胞數(shù)量呈正相關[16]?？梢?，病理條件下細胞膜越不穩(wěn)定，細胞外LDH漏出量越多。因此，LDH細胞外釋放量就可作為一個反映視網(wǎng)膜Müller細胞在DR早期功能受損情況的敏感指標。本實驗結果顯示，低劑量AGEs組、高劑量AGEs組較正常對照組LDH值均升高，高劑量AGEs組較正常對照組，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這就表明：在AGEs條件下，體外純化培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞受損，細胞膜穩(wěn)定性下降，通透性增加，活性減弱。

本實驗結果顯示，補腎活血中藥復方含藥血清對正常條件下體外純化培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細胞的LDH漏出量無明顯影響(P>0.05)；但能明顯降低AGEs條件下視網(wǎng)膜Müller細胞的LDH漏出量(P<0.05)。這就提示補腎活血中藥復方含藥血清對正常條件下視網(wǎng)膜Müller細胞細胞活性無明顯影響，但能明顯提高AGEs條件下視網(wǎng)膜Müller細胞細胞膜穩(wěn)定性、降低細胞膜通透性，從而減輕細胞損害，提高細胞活力。因此，筆者推測，補腎活血中藥復方能提高糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)患者視網(wǎng)膜Müller細胞細胞膜的穩(wěn)定性，增強視網(wǎng)膜Müller細胞活力，這可能是補腎活血中藥復方防治DR的藥物干預途徑之一。

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Effect of Bushen Huoxue Compound Formulae on Retinal Müller Cells Cultured in AGEs Condition

QIN Wei1, XIE Xue-jun2, LI Zhi-ying3, YNAG Yu-qi1, SONG Ming-xia2, CAO Xin-wei2,MA Dian-wei2, RONG Su-ran2, CHEN Yi-bing1, WANG Xue-jing1

(1.ZhongshanHospitalAffiliatedofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Zhongshan528400,China;2.ChengduUniversityofTCM,Chengdu610075,China;3.TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510000,China)

Objective：To investigate the effect of Bushen Huoxue formula on the activity of retinal Müller cells(RMCs) purified in vitro under AGEs conditions. Methods: The RMCs of seven-day SD rats was cultured by way of modified enzyme-digestion method. The serum was made from Bushen Huoxue formula. Purified RMCs were cultured under AGEs conditions, and the serum was added to the culture medium. After 48hrs, LDH leakage was detected. Results: 1.Compared to the normal control group, there was an increasing trend of LDH leakage in the low-dose AGEs group, but there was no significant difference between the two groups (Ρ>0.05); LDH leakage was increased significantly in the high-dose AGEs group compared to the normal control group (Ρ<0.05). 2.There was no statistical significance in terms of LDH leakage between the TCM intervention group and the normal control group (Ρ>0.05). 3.The LDH leakage of the TCM intervention group was reduced significantly compared to the AGEs group (Ρ<0.05). Conclusion: The serum made from Bushen Huoxue formula could increase the activity of RMCs under AGEs conditions, which may be its mechanism for diabetic retinopathy.

Bushen Huoxue; Müller cells; AGEs; LDH

2016-08-20

2016-09-25

國家自然科學基金資助項目(81072845)；廣東省中醫(yī)藥管理局資助項目(20164030)；廣東省中山市科技局資助項目(2016B1050)

秦偉(1979-)，男，博士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：眼底病防治。

*通訊作者：謝學軍(1963-)，女，博士，教授，博士研究生導師，研究方向：中醫(yī)藥防治眼底病。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0009-04