Exendin-4對(duì)淀粉樣 β 蛋白所致大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子的影響

潘艷芳，方 艷，應(yīng)小平

Exendin-4對(duì)淀粉樣 β 蛋白所致大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子的影響

潘艷芳，方 艷，應(yīng)小平

目的 探討Exendin-4對(duì)淀粉樣 β 蛋白( Aβ1- 42)所致大鼠學(xué)習(xí)記憶及對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。方法 SD雄性大鼠( n= 40)分為對(duì)照組、Aβ1- 42、Exendin-4、Exendin-4 + Aβ1- 42等4組。雙側(cè)海馬注射 Aβ1- 42 建立阿爾茨海默病(AD)模型，Exendin-4預(yù)處理后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力， 利用激光掃描共聚焦顯微成像技術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子[Ca2+]i熒光強(qiáng)度。結(jié)果 與對(duì)照組相比， 海馬單獨(dú)注射 Aβ1- 42 可導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降( P<0.05)；單獨(dú)注射Exendin-4不影響大鼠的學(xué)習(xí)記憶， 但Exendin-4預(yù)處理可有效逆轉(zhuǎn) Aβ1- 42 引起的學(xué)習(xí)記憶損傷(P>0.05)；Exendin-4預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了Aβ1- 42引發(fā)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度增高(P<0.05)。結(jié)論 Exendin-4可有效拮抗 Aβ1- 42 所致的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶傷害，作用機(jī)制可能通過(guò)調(diào)節(jié)AD模型大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)。

阿爾茨海默病；Exendin-4； 淀粉樣 β 蛋白；學(xué)習(xí)記憶； 細(xì)胞內(nèi)鈣濃度

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease， AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征性病理改變?yōu)槟X內(nèi)出現(xiàn)淀粉樣β蛋白(Amyloid β protein，Aβ)沉積，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)、大量的神經(jīng)元丟失與腦萎縮[1]。 Aβ是老年斑的主要成分， 其來(lái)源于淀粉樣前體蛋白(APP)在 γ 和 β 分泌酶的作用下裂解而成的一個(gè)多肽，具有廣泛的神經(jīng)毒性[2]。然而目前仍缺乏有效的AD治療手段。 近年來(lái)流行病學(xué)調(diào)查表明，AD與2型糖尿病(T2DM)的發(fā)生具有密切的相關(guān)性[3]。T2DM 病人罹患 AD 的概率比正常人高出兩倍，85%的 AD 病人同時(shí)伴發(fā)有T2DM 或血糖水平的明顯升高[4]。近年來(lái)提出的一個(gè)治療 AD 的新策略就是：利用抗 T2DM 的藥物干預(yù) AD。目前，這方面的研究已經(jīng)有一定進(jìn)展。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)及其類(lèi)似物能夠減少 Aβ的沉積和Tau蛋白磷酸化，改善線(xiàn)粒體功能，抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)，從而使AD病人的認(rèn)知功能得到改善[5]。Exendin-4是一個(gè)GLP-1的類(lèi)似物，與GLP-1受體結(jié)合后，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)增加、鈣離子濃度升高，促進(jìn)胰島素出胞，從而葡萄糖依賴(lài)性降低血糖上調(diào)。研究進(jìn)一步顯示， AD小鼠側(cè)腦室灌注 Exendin-4后全腦勻漿Aβ水平明顯下降，并能逆轉(zhuǎn)Aβ導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元凋亡[6]； 這提示， Exendin-4對(duì)Aβ可能具有強(qiáng)大的中樞拮抗效應(yīng)。本研究探討Exendin-4發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用是否通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 成年雄性 Sprague-Dawley (SD)大鼠230 g～250 g， 由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將40只大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只 ： control、 Aβ1-42 (3 nmoL)、Exendin-4(2 nmoL)和 Aβ1-42+ Exendin-4。Exendin-4 和Aβ1- 42均購(gòu)置美國(guó) Sigma 公司。Exendin-4 和Aβ1- 42經(jīng)微量二甲基亞砜 ( DMSO) 充分溶解后， 用磷酸鹽緩沖液( phosphate buffered saline， PBS) 稀釋。Aβ1-42 在 37 ℃下孵育 72 h， 間斷振蕩，使其老化成寡聚體。各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉 (300 mg/kg) 麻醉后， 固定于腦立體定位儀(68004， 瑞沃德公司 )上。 切開(kāi)頭皮，暴露顱骨，參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟點(diǎn) 為基準(zhǔn)， 用骨鉆于鉆孔， 將自制的不銹鋼給藥導(dǎo)管插入大鼠雙側(cè)海馬 CA1 區(qū)后3.0 mm、 中線(xiàn)旁開(kāi) 2.2 mm、 深度 3.0 mm， 再利用微量注射泵 (KD Scientific， Inc， KDS 310 Plus， USA) 和 5 μL微量注射器將藥物或溶劑 ( 2 μL)緩慢注入雙側(cè)海馬，給藥速度 0.2 μL/min。藥物注射完后留針 5 min， 藥物注射間隔 15 min。注射藥物后，顱骨上的注射孔用骨蠟封口、 皮膚縫合并給予抗生素處理。恢復(fù)1周后開(kāi)始水迷宮試驗(yàn)。

1.2 Morris水迷宮測(cè)試 大鼠被放置在一個(gè)直徑為 150 cm、 深度為 50 cm的水迷宮宮體中，水溫保持在(23±2) ℃，讓其尋找一個(gè)比水面低1 cm 的水下平臺(tái) ( 直徑 14 cm、 高 29 cm)。水池內(nèi)表面與平臺(tái)均涂成黑色。所有大鼠的活動(dòng)和軌跡通過(guò)水池正上方固定的攝像頭進(jìn)行監(jiān)視并把信號(hào)用行為學(xué)分析軟件系統(tǒng) (Ethovision 3.0， Noldus Information Technology， Netherlands) 進(jìn)行處理。全部測(cè)試包括三個(gè)方面：定位航行試驗(yàn)、空間探索試驗(yàn)和可視平臺(tái)試驗(yàn)。主要觀察指標(biāo)有：大鼠找到水下平臺(tái)的平均逃避潛伏期和平均逃避距離、撤除平臺(tái)后大鼠在目標(biāo)象限內(nèi)的游泳時(shí)間和距離百分比以及游泳速度等。

1.3 海馬原代神經(jīng)元培養(yǎng) 取新生SD大鼠，無(wú)菌條件下剪開(kāi)頭皮、顱骨，用彎鑷?yán)_(kāi)腦區(qū)視野，小心取出全腦，D-hanks液洗數(shù)次，以腦中線(xiàn)為起點(diǎn)，小心撥開(kāi)大腦顳葉皮層，小心夾出海馬組織，置于冰浴的D-hanks液中，仔細(xì)剔除微血管，大腦海馬剪成米粒大碎片， 以終濃度為 0.125%的胰蛋白酶消化( 37 ℃，20 min)，用含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化， 用尖頭吸管輕輕吹打細(xì)胞10～20 次數(shù)分鐘，至液體成米糊狀即停止吹打， 用150目網(wǎng)篩過(guò)濾， 濾后1 000 r/min 離心5 min， 棄上清， 用DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞， 調(diào)整細(xì)胞密度為 1×106/mL， 種植于預(yù)先用多聚賴(lài)氨酸液包被的 35 mm 培養(yǎng)皿中， 在 37 ℃、飽和濕度并通有 5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。接種后24 h將培養(yǎng)液換成含B27的無(wú)血清Neurobasal培養(yǎng)液， 48 h 后加入 10 μmol/L 的阿糖胞苷以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的增殖， 以后每3 d半量換液。

1.4 激光共聚焦顯微鏡鈣測(cè)定 取培養(yǎng)7 d后的海馬神經(jīng)細(xì)胞， 對(duì)Exendin-4對(duì)照組及聯(lián)合給藥組進(jìn)行Exendin-4預(yù)處理 24 h后，用PBS溶液洗滌3 次， 加入 Fluo-4/AM (5 μmol/L) 在37 ℃下負(fù)載30 min熒光染料，負(fù)載結(jié)束后， 用生理鹽溶液洗去細(xì)胞外多余染液。然后置于激光共聚焦倒置顯微鏡(日本OLYMPUS，F(xiàn)V-1000)下動(dòng)態(tài)檢測(cè)對(duì)[Ca2+]i對(duì)急性給予 Aβ1-42 的反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1 Exendin-4保護(hù)大鼠學(xué)習(xí)記憶免受 Aβ1- 42 引起的損傷 在定位航行試驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，對(duì)照組和各處理組大鼠尋找平臺(tái)所需要的時(shí)間(圖1A)和所游過(guò)的距離(圖1B)均逐漸減少。除訓(xùn)練第 1 天外， Aβ1-42組大鼠的游泳距離在2 d～5 d與對(duì)照組相比，均明顯增加(P<0.05)。單獨(dú)給予2 nmoL Exendin-4 沒(méi)有明顯影響(P>0.05)，但是與單獨(dú)給予Aβ1-42組相比，在2 d～5 d，2 nmoL Exendin-4+Aβ1-42組大鼠尋找平臺(tái)距離均明顯降低(P<0.05)。圖1C圖1D 顯示了第 6 天進(jìn)行的空間探索試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)組照大鼠在目標(biāo)象限內(nèi)停留百分比(45.62±2.72)%和距離百分比(44.71± 1.94)%，給予 Aβ1-42 的大鼠在目標(biāo)象限內(nèi)停留百分比(27.78± 2.54)%和游泳距離的百分比(29.13± 2.37)%，均較對(duì)照組明顯縮短(P<0.05)。單獨(dú)Exendin-4大鼠在目標(biāo)象限中花費(fèi)的時(shí)間百分比(45.71± 1.84)%和游過(guò)距離占游泳總距離的百分比為(44.42 ± 1.93)%， 與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。而2 nmoL Exendin-4+Aβ1-42組在目標(biāo)象限內(nèi)停留的時(shí)間占總時(shí)間的百分比(36.94 ± 2.51)%和游泳距離占游泳總距離的百分比分別為 (35.68 ±2.72)%，較單獨(dú) Aβ1-42 處理組明顯增加 (P<0.05)。以上結(jié)果表明， Exendin-4 單獨(dú)注射不影響大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能， 但 Exendin-4預(yù)處理卻拮抗 Aβ1-42 引起的學(xué)習(xí)記憶傷害。詳見(jiàn)圖1。

圖1 Exendin-4阻止Aβ1-42引起的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶傷害

2.2 Aβ1-42和Exendin-4對(duì)大鼠的視力及速度的影響 為了排除藥物對(duì)大鼠速度及視力的影響，在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了各組大鼠的游泳時(shí)間，在可視平臺(tái)試驗(yàn)中檢測(cè)了大鼠到達(dá)可視平臺(tái)所需時(shí)間。 各處理組大鼠平均游泳速度和尋找平臺(tái)潛伏期之間均無(wú)明顯差異。詳見(jiàn)圖2。藥物處理對(duì)大鼠行為學(xué)的影響不是通過(guò)影響視力和運(yùn)動(dòng)功能而實(shí)現(xiàn)的。

圖 2 海馬內(nèi)注射Exendin-4和Aβ1-42不影響大鼠的視力和運(yùn)動(dòng)能力

2.3 Exendin-4預(yù)處理拮抗了Aβ1-42引起的鈣超載 為了檢測(cè)Exendin-4拮抗Aβ1-42對(duì)學(xué)習(xí)記憶的傷害是否和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)有關(guān)系。本研究比較了不同處理對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。與對(duì)照組相比(100.0±5.1)%， 10 μmoL Aβ1-42加入后，細(xì)胞內(nèi)相對(duì)熒光密度增加到(228.1±6.7)%(P<0.05)。加入 200 nmoL Exendin-4后，相對(duì)熒光密度與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是在Exendin-4 (200 nmoL)預(yù)處理卻能夠抵抗Aβ1-42引起的熒光密度的增加。因此表明Exendin4發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用可能和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)[ Ca2+]i穩(wěn)態(tài)有關(guān)。詳見(jiàn)圖3。

圖3 Exendin-4預(yù)處理拮抗了Aβ1-42引起的鈣超載

3 討 論

雙側(cè)海馬注射 Aβ1-42 可引起大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能損傷 ；這一過(guò)程可能涉及細(xì)胞內(nèi)[ Ca2+]i穩(wěn)態(tài)的打破[7]。Exendin4 預(yù)處理可能通過(guò)調(diào)節(jié)[ Ca2+]i的平衡拮抗 Aβ1-42 引起的學(xué)習(xí)記憶傷害。鈣離子是一個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞信轉(zhuǎn)導(dǎo)號(hào)分子，在細(xì)胞增殖、神經(jīng)興奮性、突觸傳遞、基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起重要作用Ca2+參與突觸傳遞神經(jīng)遞質(zhì)釋放，以及神經(jīng)元興奮性和突觸可塑性調(diào)節(jié)[7]。細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的擾亂誘導(dǎo)了許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病， 包括AD、腦卒中和帕金森病[8]。一些研究表明，細(xì)胞內(nèi)正常濃度范圍的Ca2+能夠保持神經(jīng)元的興奮性。鈣超載可以降低神經(jīng)元興奮閾值，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[9]。還有研究表明，鈣穩(wěn)態(tài)破壞和神經(jīng)炎癥可導(dǎo)致認(rèn)知功能和突觸功能下降，且在衰老細(xì)胞中有過(guò)量的Ca2+。異常鈣調(diào)節(jié)是參與到AD的病理過(guò)程。調(diào)制鈣平衡可以提供潛在的方法預(yù)防和逆轉(zhuǎn)AD。

Aβ在AD發(fā)病早期起著重要作用。Aβ可以通過(guò)許多機(jī)制誘導(dǎo)神經(jīng)毒性，如鈣穩(wěn)態(tài)的打破，氧化應(yīng)激和神經(jīng)毒性； 然而，細(xì)胞內(nèi)鈣平衡的破壞被認(rèn)為是最重要。已經(jīng)有研究表明，細(xì)胞內(nèi)鈣超載會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，而Aβ25-35能夠引起原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的鈣超載和學(xué)習(xí)和記憶損害[10]。本研究發(fā)現(xiàn)Aβ1-42能夠引起原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的鈣超載和學(xué)習(xí)和記憶損傷。

近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)治療2型糖尿病的藥物可改善AD病理變化。GLP-1能夠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用和提高學(xué)習(xí)記憶功能，但是天然的GLP-1只有(1～2)

min的半衰期，從而導(dǎo)致了其臨床應(yīng)用的有限性。有幸的是，Exendin4擁有一個(gè)較長(zhǎng)的半衰期(60～90 min)，且能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，刺激軸突生長(zhǎng)，阻止興奮毒作用和氧化應(yīng)激[11]。本研究顯示：與單獨(dú)Aβ1-42相比，給予Exendin4能夠降低海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平，這一過(guò)程極可能參與到Exendin4拮抗Aβ1-42導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶功能傷害過(guò)程中。因此Exendin4可能用于AD的預(yù)防和治療中。

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(本文編輯王雅潔)

Effects of Exendin-4 on Amyloid β-protein Induced Impairments of Learning Memory and Intracellular Calcium Concentration of Hippocampal Neuron in Rats

Pan Yanfang，F(xiàn)ang Yan，Ying Xiaoping

School of Basic Medical Science， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， Shaanxi，China

Objective To explore the effects of exendin-4 on amyloid β-protein (Aβ) 1-42-induced deficits in learning memory and intracellular calcium concentration of hippocampal neuron in rats.Methods Forty male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups (n=10，each group):control， Aβ1-42 ， Exendin-4， Exendin-4+Aβ1-42.After bilateral hippocampal injection of Aβ1-42 and exendin-4 rats，Morris water maze test was used to test the ability of spatial learning and memory，and laser-scanning confocal calcium imaging technique was used to test the [Ca2+]i in primary cultured rat hippocampal neurons.Results Hippocampal injection of Aβ1-42 alone impaired spatial learning and memory of rats (P<0.05).Exendin-4 did not affect learning and memory of rats，but alleviated Aβ1-42-induced spatial learning and memory deficits，compared with Aβ1-42 alone group (P>0.05).Pretreatment with exendin-4 suppressed Aβ1-42-induced elevate on in intracellular calcium concentration [Ca2+]i.(P<0.05).Conclusion These findings indicate that systemic pretreatment with exendin-4 can effectively prevent the impairment in spatial learning and memory of rats induced by neurotoxic Aβ1-42， and the underlying protective mechanism of exendin-4 may be involved in regulation of calcium homeostasis.

Alzheimer’s disease；exendin-4；amyloid β-protein；spatial learning and memory;intracellular calcium concentration

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(No.2015JQ8299)

陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室( 陜西咸陽(yáng) 712046)

信息：潘艷芳，方艷，應(yīng)小平.Exendin-4對(duì)淀粉樣 β 蛋白所致大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(15)：1834-1837.

R749.1 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.15.006

1672-1349(2017)15-1834-04

2016-08-03)