尿路上皮癌抗原1過表達(dá)對胰腺癌CaPan-2細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響

許朝 陳思 呂超藍(lán) 余躍 張開光

·短篇論著·

尿路上皮癌抗原1過表達(dá)對胰腺癌CaPan-2細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響

許朝 陳思 呂超藍(lán) 余躍 張開光

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是指一類長度大于200個(gè)核苷酸、不編碼蛋白質(zhì)的RNA。近年來研究發(fā)現(xiàn)，它在諸如表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾和核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[1]。尿路上皮癌抗原1(urothelial carcinoma associated 1，UCA1)即是一個(gè)lncRNA，在人類多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，并顯著增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖和耐藥性[2-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，UCA1在胰腺癌組織中高表達(dá)，且與臨床轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，抑制UCA1可抑制人胰腺癌PANC1細(xì)胞的體外侵襲能力[5]。本研究通過脾內(nèi)注射切脾法建立胰腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，進(jìn)一步探討UCA1過表達(dá)對胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。

一、材料與方法

1．穩(wěn)定過表達(dá)UCA1的CaPan-2細(xì)胞株的建立：全長UCA1基因(1.44 kb)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。合成的UCA1基因片段及pGLV5-EF1a-EGFP/Puro質(zhì)粒用NotⅠ和NsiⅠ雙酶切后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收和純化酶切片段，用T4 DNA連接酶將UCA1片段以黏端方式與質(zhì)粒片段連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a大腸桿菌擴(kuò)增后提取重組質(zhì)粒，通過酶切及測序鑒定正確后，采用脂質(zhì)體法將其與包膜蛋白質(zhì)粒(pVSV-G)、核心蛋白/逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)粒(pGag/Pol)和載體質(zhì)粒(pRev)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。72 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，過濾后4℃ 20 000 r/min離心2 h，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0% FBS的DMEM培養(yǎng)液20 μl 10倍稀釋4個(gè)梯度分別感染293T細(xì)胞，通過熒光顯微鏡計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度約為1×109TU/ml。CaPan-2細(xì)胞1.0×106/孔的密度接種96孔板，培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入200 μl 1×108TU/ml的病毒液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后更換為McCoy′s 5a完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，48 h后更換為含嘌呤霉素(終濃度為0.35 μg/ml)的McCoy′s 5a完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，期間每2 d換液。10 d后獲得穩(wěn)定過表達(dá)UCA1的人胰腺癌CaPan-2細(xì)胞(CaPan-2/UCA1)。同法用空病毒載體感染CaPan-2細(xì)胞(CaPan-2/NC)作為陰性對照。

2．CaPan-2細(xì)胞UCA1的表達(dá)水平檢測：Trizol提取各組細(xì)胞的總RNA，采用SuperscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測細(xì)胞UCA1 mRNA的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列：UCA1上游引物為5′-ATGGTGTCCTCAAGCCTACTCTCA-3′，下游引物為5′-TGAAATGTCCCAAGCCCTCTAAC-3′， 產(chǎn)物片段長度為139 bp；GAPDH上游引物為5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，下游引物為5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′，產(chǎn)物片段長度為299 bp。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 10 min；95℃ 10 s、60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算UCA1在癌細(xì)胞中的相對表達(dá)量。

3．CaPan-2細(xì)胞體外侵襲能力檢測：胰酶消化并收集各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)后用McCoy′s 5a無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml。將Matrigel Transwell小室(Chemicon公司)置于24孔板中，上室中加入無血清培養(yǎng)液稀釋的細(xì)胞懸液100 μl，下室中加入含10%胎牛血清的McCoy′s 5a培養(yǎng)液500 μl，常規(guī)培養(yǎng)24 h。棄上室液體，用棉簽輕輕拭去濾膜上表面未穿膜的細(xì)胞，用甲醇溶液固定10 min，常規(guī)結(jié)晶紫染色。在倒置顯微鏡下選擇10個(gè)高倍鏡視野(×200)，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4．裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：6周齡BALB/C裸鼠購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于SPF條件下，8周齡后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用脾內(nèi)注射切脾法建立胰腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，即在麻醉后行左上腹橫切口，顯露脾臟并小心拉出體外，用1 ml注射器從脾臟上極沿脾縱軸進(jìn)針，緩慢注射胰腺癌CaPan-2細(xì)胞懸液0.5 ml(1×107個(gè)/ml)，注射區(qū)可見被膜變白隆起。待隆起消失后5 min切除脾臟，無出血后關(guān)腹。用隨機(jī)數(shù)字表法將裸鼠分為2組；CaPan-2/UCA1組，注射CaPan-2/UCA1細(xì)胞懸液；CaPan-2/NC組，注射CaPan-2/NC細(xì)胞懸液，每組10只。注射6周后脫頸處死裸鼠，開腹取肝臟，計(jì)數(shù)肝表面的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)并稱重。以10%甲醛固定肝組織后常規(guī)行病理學(xué)檢查。

二、結(jié)果

1．各組細(xì)胞UCA1 mRNA表達(dá)量：CaPan-2/UCA1、CaPan-2/NC及親本CaPan-2細(xì)胞UCA1 mRNA相對表達(dá)量分別為3.103±0.103、1.130±0.043和1.000±0.047。CaPan-2/UCA1細(xì)胞的表達(dá)顯著高于CaPan-2/NC(t=2.110，P<0.05)以及親本細(xì)胞(t=2.204，P<0.05)，而CaPan-2/NC和親本細(xì)胞間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2．UCA1過表達(dá)CaPan-2細(xì)胞體外侵襲能力的改變：CaPan-2/UCA1、CaPan-2/NC和親本CaPan-2細(xì)胞24 h的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(34.67±7.35)、(24.33±4.12)和(21.67±4.04)個(gè)/200倍視野。CaPan-2/UCA1明顯高于CaPan-2/NC(t=22.99，P<0.05)及親本細(xì)胞(t=20.323，P<0.05)，而CaPan-2/NC與親本細(xì)胞間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

圖1 CaPan-2組(1A)、CaPan-2/NC組(1B)、CaPan-2/UCAI(1C)的穿膜細(xì)胞(結(jié)晶紫染色 ×200)

3．UCA1過表達(dá)CaPan-2細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的影響：CaPan-2/NC組中只有2只裸鼠有肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(2/10)，而Capan-2/UCA1組6只裸鼠有肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(6/10)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 CaPan-2/NC(2A)、CaPan-2/UCA1(2B)裸鼠的肝轉(zhuǎn)移灶(HE ×100)

討論 UCA1基因位于19號染色體的區(qū)鏈p13區(qū)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物UCA1是一個(gè)lncRNA，缺少明顯的開放性閱讀框而不具備蛋白編碼功能。Wang等[6]首次在膀胱癌中鑒定并克隆出了UCA1的全長cDNA，并因其與泌尿道上皮腫瘤的密切相關(guān)性而將其命名。此后的研究顯示UCA1在人類胎盤組織和胎兒的心臟、膀胱和宮體組織中均有表達(dá)，而在絕大多數(shù)正常成人組織(除心臟和脾臟外)中均無表達(dá)[7]。隨后的研究顯示，UCA1在人類多種惡性腫瘤中(如胃癌，卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌等)異常高表達(dá)，并能促進(jìn)腫瘤增殖能力和耐藥性，被認(rèn)為具有癌基因功能[8-11]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，UCA1在胰腺癌組織中表達(dá)異常增高，并且在伴有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中的表達(dá)明顯高于無轉(zhuǎn)移者；進(jìn)一步通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)UCA1表達(dá)后，胰腺癌PANC1細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力均明顯減弱[5]。最新研究報(bào)道，UCA1表達(dá)水平與黑色素瘤和舌鱗癌的臨床轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，抑制UCA1表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力[12-13]。為進(jìn)一步探討UCA1對胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響，本研究成功建立了穩(wěn)定過表達(dá)外源UCA1的CaPan-2細(xì)胞株，結(jié)果顯示，UCA1過表達(dá)顯著增強(qiáng)了CaPan-2細(xì)胞的體外侵襲能力和肝轉(zhuǎn)移能力。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的重要機(jī)制。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，沉默UCA1可顯著下調(diào)胰腺癌PANC1細(xì)胞間質(zhì)分子vimentin的表達(dá)[5]，細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞形態(tài)。Cheng等[14]早前通過芯片技術(shù)檢測沉默UCA1對膀胱癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，結(jié)果顯示細(xì)胞中間質(zhì)分子fibronectin和vimentin的表達(dá)水平均明顯下調(diào)。因此，筆者推測UCA1可能通過正向調(diào)控細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程繼而促進(jìn)腫瘤侵襲。新近研究發(fā)現(xiàn)，UCA1可通過激活多條細(xì)胞內(nèi)信號通路誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，如AKT/mTOR，Wnt/β-catenin信號通路[15-16]。另一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)，UCA1通過競爭結(jié)合hsa-miR-145并干擾后者對 ZEB1/2表達(dá)的負(fù)性調(diào)控，ZEB1/2表達(dá)上調(diào)繼而誘導(dǎo)了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。然而，UCA1是否通過以上機(jī)制調(diào)控胰腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化仍有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.04.010

230001 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院消化內(nèi)科

許朝，Email: xuchaoseu@126.com

2016-07-02)