穩(wěn)定過(guò)表達(dá)hB7-H3基因的人胰腺癌PANC1細(xì)胞株的構(gòu)建

李東寶 李德春 趙華 趙鑫

·論著·

穩(wěn)定過(guò)表達(dá)hB7-H3基因的人胰腺癌PANC1細(xì)胞株的構(gòu)建

李東寶 李德春 趙華 趙鑫

目的 構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)hB7-H3基因的人胰腺癌PANC1細(xì)胞株，為研究hB7-H3基因的功能提供基礎(chǔ)工具。方法 將hB7-H3基因片段插入攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒質(zhì)粒GV287，構(gòu)建重組hB7-H3-GV287質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)hB7-H3蛋白表達(dá)；通過(guò)慢病毒包裝后測(cè)定病毒滴度。將表達(dá)hB7-H3的病毒感染人胰腺癌PANC1細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP及hB7-H3陽(yáng)性表達(dá)率；實(shí)時(shí)PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)感染細(xì)胞的hB7-H3 mRNA及蛋白表達(dá)。以自身環(huán)化的GV287質(zhì)粒作為陰性對(duì)照(NC)。結(jié)果 重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增片段約1 368 bp，NC質(zhì)粒無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，重組質(zhì)粒DNA測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的片段完全一致，表明重組hB7-H3-GV287質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞表達(dá)hB7-H3蛋白，而NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞無(wú)hB7-H3蛋白表達(dá)。重組hB7-H3質(zhì)粒經(jīng)慢病毒包裝后的病毒滴度為2×108TU/ml。慢病毒感染人胰腺癌PANC1細(xì)胞后，細(xì)胞hB7-H3陽(yáng)性表達(dá)率、hB7-H3 mRNA及蛋白表達(dá)分別為94.3%、5.09±0.24、2.85±0.27，較NC慢病毒感染的18.5%、1.28±0.53、0.44±0.69顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。結(jié)論 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)hB7-H3基因的人胰腺癌PANC1細(xì)胞株的構(gòu)建成功。

胰腺腫瘤； 慢病毒感染； 基因表達(dá)； 細(xì)胞系，腫瘤； hB7-H3

【Fund program】 National National Science Foundation of China(81302146); Postdoctoral Science Foundation Grant of China(2016M591913); Natural Science Foundation of Jiangsu Province(BK20161225); Scientific Research Program of Jiangsu Provincial Commission of Health and Family Planning(H201620); Science and Technology Program of Suzhou City(SYS201539); Jiangsu Province Youth Medical Talent Project(QNRC2016732); Six Talent Peak Project in Jiangsu Province(2016-WSW-043)

人B7-H3(hB7 homology 3，hB7-H3)屬于B7共刺激分子家族的成員之一，最早由Chapoval等[1]從人樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)來(lái)源的cDNA文庫(kù)中克隆而來(lái)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，hB7-H3作為免疫共刺激分子，在T細(xì)胞等免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[2]。hB7-H3在多種人類(lèi)惡性腫瘤中高表達(dá)，如乳腺癌、腎癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、胰腺癌等，且與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)性[3-6]。Zhao等[7]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)人胰腺癌PaTu8988細(xì)胞hB7-H3表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，增加癌細(xì)胞對(duì)化療藥吉西他濱的敏感性。因此，hB7-H3作為一個(gè)潛在的“免疫卡控點(diǎn)”，對(duì)胰腺癌等惡性腫瘤的治療具有重大意義[8]。本研究構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)hB7-H3的人胰腺癌PANC1細(xì)胞株，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、重組hB7-H3-GV287表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank庫(kù)人hB7-H3(CD276)基因序列(NM_001024736)設(shè)計(jì)hB7-H3基因引物，上、下游分別帶有BamHI、AgeI酶切位點(diǎn)。上游序列為5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGCTGCG-TCGGCGGGGCA-3′；下游序列為5′-TCCTTGTAGTCCATACCGGCTATTTCTTGTCCATCATC-3′，由金唯智生物科技有限公司(蘇州，中國(guó))合成。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 2 min，30次循環(huán)，72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后采用DNA回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收，應(yīng)用雙酶切獲得hB7-H3基因片段。攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的環(huán)狀GV287慢病毒質(zhì)粒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，應(yīng)用BamHI、AgeI雙酶切獲得線性化GV287載體。線性化目的基因片段及線性化GV287載體通過(guò)In-fusion交換酶(美國(guó)Clontech公司)置25℃ 30 min、42℃ 15 min進(jìn)行連接，獲得表達(dá)hB7-H3的重組質(zhì)粒。以插入GAPDH片段質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，以自身環(huán)化質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。將3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5α大腸桿菌，接種到含AMP 100 μg/ml的LB瓊脂糖培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)鑒定。PCR引物上游序列5′-TGGCACAGGGCAACGCATC-3′，下游序列5′-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，30次循環(huán)，72℃ 5 min后置4℃保存。并將陽(yáng)性菌送上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

二、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞hB7-H3表達(dá)檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293T細(xì)胞，接種24孔板培養(yǎng)過(guò)夜。采用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)將重組質(zhì)粒、陰性對(duì)照質(zhì)粒、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，按試劑使用說(shuō)明書(shū)操作。轉(zhuǎn)染24 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP陽(yáng)性細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36 h后收集細(xì)胞，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)293T細(xì)胞hB7-H3蛋白表達(dá)。鼠抗人一抗購(gòu)自Sigma公司、羊抗鼠二抗購(gòu)于Santa-Cruz公司，抗體滴度參照說(shuō)明書(shū)。最后采用ECL發(fā)光，X光片曝光、顯影、定影。以WB標(biāo)準(zhǔn)品SURVIVIN-3FLAG-GFP (分子質(zhì)量48 000)作為陽(yáng)性對(duì)照行蛋白電泳觀察。

三、慢病毒顆粒包裝和滴度測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，以1.2×107個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)24 h。采用Qiagen公司提供的質(zhì)粒抽提試劑盒抽提重組質(zhì)粒、載體質(zhì)粒pHelper1.0及pHelper2.0的DNA，取10 μg DNA與相應(yīng)容積的Opti-MEM混均，采用Lipofectamine 2000將3種質(zhì)粒DNA共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心去細(xì)胞碎片，超濾濃縮，獲取病毒原液，分裝，置-80℃保存。于96孔板每孔接種4×104個(gè)293T細(xì)胞，取病毒原液，以倍比稀釋法加入各孔細(xì)胞的培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)4 d，觀察熒光蛋白表達(dá)并拍照，計(jì)算熒光細(xì)胞數(shù)，除以稀釋倍數(shù)，得出病毒原液的滴度，單位為T(mén)U/ml。

四、穩(wěn)定過(guò)表達(dá)hB7-H3(hB7-H3+)的PANC1細(xì)胞株建立

PANC1細(xì)胞株購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，以5×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，加入108TU/ml病毒4 μl(MOI 1∶20)感染細(xì)胞12 h，棄培養(yǎng)液，加入2 ml含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，感染后4 d觀察熒光細(xì)胞數(shù)并拍照，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)病毒感染率(hB7-H3+組)。再經(jīng)sorting流式細(xì)胞儀分選陽(yáng)轉(zhuǎn)細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性表達(dá)率。同法以陰性對(duì)照質(zhì)粒感染PANC1細(xì)胞作為陰性對(duì)照組(NC組)。

五、PANC1細(xì)胞hB7-H3表達(dá)陽(yáng)性率檢測(cè)

取對(duì)照組(親本細(xì)胞)、NC組、hB7-H3+組PANC1細(xì)胞，PBS洗滌后制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，每管加入3×105個(gè)細(xì)胞(3 ml)，每組2管。1管加入2 μl PE標(biāo)記的抗hB7-H3抗體(美國(guó)Invitrogen公司)，輕輕混勻，4℃反應(yīng)10 min，另1管不加抗體作為對(duì)照，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)hB7-H3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

六、PANC1細(xì)胞hB7-H3 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

分別取上述3組PANC1細(xì)胞，采用Trizol提取各組細(xì)胞的總RNA， 實(shí)時(shí) PCR SYBR GREEN法檢測(cè)細(xì)胞hB7-H3 mRNA表達(dá)。hB7-H3上游引物序列為5′-CTCTGCCTTCTCACCTCTTTG-3′；下游引物序列為5′-CCTTGAGGGAGGAACTTTATC-3′，擴(kuò)增片段134 bp。內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；下游引物序列為5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′，擴(kuò)增片段121 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 15 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，40次循環(huán)。以儀器自帶軟件獲得相應(yīng)的Ct值，以對(duì)照組細(xì)胞為基準(zhǔn)，采用公式 2-△△Ct計(jì)算hB7-H3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

七、PANC1細(xì)胞hB7-H3蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

分別取上述3組細(xì)胞， 裂解液提取細(xì)胞總蛋白， BCA法定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)hB7-H3蛋白表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。最后ECL發(fā)光，X光片曝光、顯影、定影。通過(guò)灰度分析軟件半定量hB7-H3蛋白表達(dá)量。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、重組hB7-H3-GV287表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

設(shè)計(jì)引物的PCR擴(kuò)增片段大小約為1 646 bp，與預(yù)期相符(圖1)。重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增片段約1 368 bp，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒擴(kuò)增出相應(yīng)片段，陰性對(duì)照質(zhì)粒無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物 (圖2)。DNA測(cè)序分析結(jié)果顯示重組質(zhì)粒的編碼序列與設(shè)計(jì)的片段完全一致(圖3)，表明重組hB7-H3-GV287表達(dá)載體構(gòu)建成功。

二、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞hB7-H3蛋白表達(dá)

293T細(xì)胞不表達(dá)hB7-H3蛋白，但重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后283T細(xì)胞表達(dá)hB7-H3蛋白(圖4)。

1：Marker；2：B7-H3 圖1 引物擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖

圖2 空白對(duì)照(1)、陰性對(duì)照(2)、陽(yáng)性對(duì)照(3)、重組質(zhì)粒(5～12)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖3 陽(yáng)性克隆hB7-H3基因測(cè)序圖

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品(1)、293T細(xì)胞(2)、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(3)hB7-H3蛋白表達(dá)

三、病毒包裝及滴度測(cè)定

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)明顯熒光(圖5)。慢病毒原液滴度為2×108TU/ml。

圖5 重組質(zhì)粒(5A)、陰性對(duì)照質(zhì)粒(5B)慢病毒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞[熒光顯微鏡(左)，光學(xué)顯微鏡(右)，×200]

四、hB7-H3+的PANC1細(xì)胞株建立及鑒定

對(duì)照組、NC組、hB7-H3+組PANC1細(xì)胞GFP陽(yáng)性率分別為 0、99.2%、95.0%(圖6)；細(xì)胞膜hB7-H3表達(dá)率分別為15.4%、18.5%、94.3%(圖7)；hB7-H3 mRNA表達(dá)量分別為1.19±0.78、1.28±0.53、5.09±0.24，蛋白表達(dá)量為0.37±0.18、0.44±0.69、2.85±0.27(圖8)。hB7-H3+組PANC1細(xì)胞的hB7-H3 mRNA及蛋白表達(dá)量顯著高于NC組及對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為20.45、21.78，P值均<0.0001)，表明穩(wěn)定過(guò)表達(dá)hB7-H3的PANC1細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖6 對(duì)照組(6A)、NC組(6B)、hB7-H3+組(6C)PANC1細(xì)胞GFP陽(yáng)性表達(dá)率

圖7 對(duì)照組(7A)、NC組(7B)、hB7-H3+組(7C)PANC1細(xì)胞膜hB7-H3 陽(yáng)性表達(dá)率

圖8 對(duì)照組(1)、hB7-H3+組(2)、NC組(3)PANC1細(xì)胞hB7-H3蛋白表達(dá)

討 論

基因治療是當(dāng)前研究熱門(mén)的治療手段之一。基因傳遞系統(tǒng)是基因治療的重要組成部分，也是目前基因治療的瓶頸?，F(xiàn)有的基因載體包括病毒載體和非病毒載體兩類(lèi)。鄒多宏等[9]采用RT-PCR法從淋巴細(xì)胞總RNA中獲得hB7-H3基因，構(gòu)建了人hB7-H3的真核表達(dá)載體pEGFP-C1-hB7-H3，并轉(zhuǎn)染到舌鱗癌細(xì)胞Tca8113。但非病毒載體存在靶向困難、轉(zhuǎn)染效率低、有效表達(dá)時(shí)間短等問(wèn)題[10]。慢病毒載體是人類(lèi)免疫缺陷病毒-1( HIV-1)來(lái)源的一種病毒載體，能高效地將目的基因?qū)爰?xì)胞，且感染效率高、攜帶基因片段容量較大、目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)可以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)[11]，因此是轉(zhuǎn)移目的基因的理想載體。目前第三代慢病毒載體是沒(méi)有完整復(fù)制功能的病毒載體，既含有標(biāo)志基因如GFP，又可攜帶治療性基因[12]。

本研究采用慢病毒載體系統(tǒng)由GV287質(zhì)粒、載體質(zhì)粒pHelper1.0、包裝質(zhì)粒pHelper2.0組成。GV287質(zhì)粒又?jǐn)y帶熒光標(biāo)志的GFP，能通過(guò)熒光顯微鏡觀察到病毒感染狀況。本研究結(jié)果顯示，導(dǎo)入目的基因hB7-H3的重組hB7-H3-GV287質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，293T細(xì)胞能有效地過(guò)表達(dá)hB7-H3蛋白。重組質(zhì)粒與載體質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，通過(guò)熒光顯微鏡可觀察到大量綠色熒光,說(shuō)明慢病毒包裝成功，且病毒滴度高達(dá)2×108TU/ml。將表達(dá)hB7-H3的慢病毒載體感染人胰腺癌PANC1細(xì)胞，PANC1細(xì)胞的hB7-H3 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著增加，提示穩(wěn)定過(guò)表達(dá)hB7-H3基因的人胰腺癌PANC1細(xì)胞株構(gòu)建成功，為進(jìn)一步研究hB7-H3的生物學(xué)功能及腫瘤的治療等方面提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ) 。

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(本文編輯：呂芳萍)

Construction of a human pancreatic cancer cell line PANC1 stably over-expressing hB7-H3 gene

Li Dongbao, Li Dechun, Zhao Hua, Zhao Xin.

Department of General Surgery, First Affiliated Hospital, Soochow University, Suzhou 215000, China

Zhao Xin, Email: zhaox@suda.edu.cn

Objective To construct the stably over-expressing hB7-H3 gene human pancreatic cancer cell line PANC1, and provide tools for further investigating the function of hB7-H3. Methods hB7-H3 gene fragment was inserted into lentiviral plasmid GV287 carrying GFP to construct recombinant hB7-H3-GV287 plasmid vector. 293T cells were transfected, and the GFP expression was evaluated under fluorescence microscopy. Western Blot wasused to detect the expression of hB7-H3 protein. Lentiviral vectors were packaged and the titer was determined. The recombinant hB7-H3 expressed lentivirus was used to infect PANC1 cell. Flow cytometry was applied to detecte the percentage of GFP and hB7-H3 positive cells. Real-time PCR and Western Blot was used to verify the mRNA and protein expression of hB7-H3. Self-cyclizing GV287 plasmid served as negative control (NC). Results PCR amplified fragment of recombinant plasmid was around 1 368 bp, and no amplified production of NC plasmid was observed. The DNA sequencing of recombinant plasmid was completely consistent with the designed fragment, indicating that hB7 H3-GV287 plasmid was successfully constructed. 293T cells transfected with recombinant plasmid expressed hB7-H3 protein, while those cells transfected with NC plasmid did not express hB7-H3 protein. The virus titer of lentiviral packaged recombinant hB7-H3 plasmid was 2×108TU/ml. The percentage of hB7-H3 positive cells, hB7-H3 mRNA and protein expression in PANC1 cells infected with cells infected with hB7-H3 lentivirus was 94.3%, 5.09±0.24 and 2.85±0.27, respectively, which was obviously higher than 18.5%, 1.28±0.53 and 0.44±0.69 in cells infected with NC lentivirus, and the differences were statistically significant (Pvalue <0.01). Conclusions A human pancreatic cancer cell line PANC1 stably over-expressing hB7-H3 was successfully constructed.

Pancreatic neoplasms; Lentiviral infections; Gene expression; Cell line, tumor; hB7-H3

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.04.007

215000 江蘇蘇州，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科、胰腺疾病研究中心

趙鑫，Email: zhaox@suda.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(81302146)；中國(guó)博士后基金(2016M591913)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20161225)；江蘇省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題(H201620)；蘇州市科技計(jì)劃(SYS201539)；江蘇省青年醫(yī)學(xué)人才項(xiàng)目(QNRC2016732)；江蘇省“六大人才高峰”計(jì)劃資助項(xiàng)目(2016-WSW-043)

2016-11-14)