熱應(yīng)激誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡及其對(duì)HSP70基因表達(dá)的影響

張響英，唐現(xiàn)文，陳靜波，李騰騰

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095)

熱應(yīng)激誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡及其對(duì)HSP70基因表達(dá)的影響

張響英1,2，唐現(xiàn)文1，陳靜波1，李騰騰1

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095)

為探討熱應(yīng)激對(duì)乳腺上皮細(xì)胞凋亡的影響，以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺上皮細(xì)胞分別置于39 ℃和41 ℃熱處理1 h(以37 ℃正常培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照)，在37 ℃恢復(fù)培養(yǎng)0、6、12 h后收集細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，Annexin V/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，比色法分析Caspase-3活性，熒光定量PCR檢測(cè)HSP70基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，39 ℃熱應(yīng)激組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和死亡率高峰期均發(fā)生在熱修復(fù)6 h，細(xì)胞死亡率為15.42%，而41 ℃熱應(yīng)激組發(fā)生在熱修復(fù)12 h，細(xì)胞死亡率高達(dá)23.18%；高溫處理后，Caspase-3活性呈上升趨勢(shì)；39 ℃熱應(yīng)激組在熱恢復(fù)6 h，HSP70基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，41 ℃熱應(yīng)激組在熱恢復(fù)0、6、12 h，HSP70基因的表達(dá)量分別為對(duì)照組的3.53倍、5.61倍和2.93倍。綜上可知，高溫應(yīng)激激活了Caspase-3活性，從而誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞凋亡，并隨高溫強(qiáng)度的增加而作用增強(qiáng)，同時(shí)高溫誘導(dǎo)了HSP70基因過表達(dá)，協(xié)助細(xì)胞獲得熱耐受性。

乳腺上皮細(xì)胞； 熱應(yīng)激； 細(xì)胞凋亡；HSP70基因

熱應(yīng)激是指機(jī)體應(yīng)對(duì)環(huán)境高溫所產(chǎn)生的非特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。奶牛耐寒畏熱，環(huán)境溫度過高時(shí)，便會(huì)出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂、產(chǎn)奶量下降、抗病力降低等，探索奶牛的熱應(yīng)激調(diào)控機(jī)制可提高奶牛生產(chǎn)性能。研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激能降低細(xì)胞的活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和熱休克蛋白(HSPs)表達(dá)[1-3]。HSP70作為最重要的HSPs成員，分布在各種細(xì)胞中，其在細(xì)胞內(nèi)的聚集或消退與細(xì)胞耐熱性的獲得或喪失密切相關(guān)[4]。在正常狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)存在一定量的HSP70，無DNA結(jié)合活性的熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(HSF-1)單體在胞漿內(nèi)與HSP70結(jié)合形成復(fù)合體，當(dāng)高溫應(yīng)激時(shí)，外界信號(hào)刺激HSF-1活化，與熱休克元件(HSE)結(jié)合，誘導(dǎo)HSP表達(dá)，阻斷Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制細(xì)胞凋亡[5-6]。不同種類細(xì)胞抵抗高溫應(yīng)激的能力，因熱處理溫度和時(shí)間的不同而存在差異。研究報(bào)道，間斷和持續(xù)高溫處理均可誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡[7-8]。本研究以體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，探討不同溫度處理對(duì)細(xì)胞凋亡及HSP70基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步揭示乳腺的熱應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，以期為緩解奶牛熱應(yīng)激提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

試劑：DMEM(Gibco公司)、犢牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、MTT(Amresco公司)、Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)、熒光定量PCR試劑盒(Zoonbio公司)、DEPC水(Sigma公司)、Trizol試劑(大連寶生物工程有限公司)等。

儀器：CO2培養(yǎng)箱、無菌操作臺(tái)、高速低溫離心機(jī)、WFJ7200型可見分光光度計(jì)、酶聯(lián)免疫儀、凝膠成像系統(tǒng)、FTC2000熒光定量PCR儀等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

采用組織塊法培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞[9]。取剛屠宰的健康荷斯坦奶牛乳腺組織，剔除脂肪，剪成1～2 mm3的小塊進(jìn)行接種培養(yǎng)，經(jīng)純化后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn)。試驗(yàn)分對(duì)照組(CK)、39 ℃熱應(yīng)激組和41 ℃熱應(yīng)激組。(1)對(duì)照組：37 ℃培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞；(2)39 ℃熱應(yīng)激組：將正常培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞置于39 ℃處理1 h，立即放回37 ℃恢復(fù)培養(yǎng)，分別在恢復(fù)培養(yǎng)的0、6、12 h收集細(xì)胞；(3)41 ℃熱應(yīng)激組：將正常培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞置于41 ℃處理1 h，立即放回37 ℃恢復(fù)培養(yǎng)，分別在恢復(fù)培養(yǎng)的0、6、12 h收集細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率檢測(cè)

收集各組處理細(xì)胞，加入MTT試劑培養(yǎng)4 h，吸棄上清，然后加入DMSO，靜置30 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm處的吸光值，計(jì)算抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組OD均值-試驗(yàn)組OD 均值)/對(duì)照組OD均值×100%。

1.4 乳腺上皮細(xì)胞凋亡檢測(cè)

收集各組處理細(xì)胞，采用Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，按照試劑盒使用說明用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡數(shù)，計(jì)算細(xì)胞死亡率。細(xì)胞死亡率=細(xì)胞早期凋亡率+細(xì)胞晚期凋亡率(壞死率)。

1.5 Caspase-3活性檢測(cè)

使用Caspase-3 比色試劑盒，按照使用說明檢測(cè)Caspase-3的活性。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)HSP70基因表達(dá)量

從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得目的基因mRNA序列，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，引物序列見表1。

表1 HSP70和GAPDH基因的熒光定量PCR引物

用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度，然后反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，按照以下反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：SYBRMIX 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ROX Dye 2.5 μL，cDNA 2.0 μL，用無菌去離子水補(bǔ)充體系至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。樣本基因HSP70的表達(dá)強(qiáng)度用其對(duì)應(yīng)的GAPDH基因的量進(jìn)行校正，即△Ct=Ct(HSP70基因)-Ct(GAPDH基因)，其相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0軟件中的One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱應(yīng)激對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響

與對(duì)照組相比，39 ℃熱應(yīng)激組在熱恢復(fù)0、6、12 h的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為14.07%(P>0.05)、 28.13%(P<0.05)和22.02%(P<0.05)，41℃熱應(yīng)激組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著增加，熱恢復(fù)0、6、12 h分別為17.13%(P>0.05)、39.76%(P<0.01)和43.73%(P<0.01)；與39 ℃熱應(yīng)激組相比，41 ℃熱應(yīng)激組熱恢復(fù)0 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率差異不顯著，熱恢復(fù)6、12 h細(xì)胞抑制率分別提高了11.63個(gè)百分點(diǎn)(P<0.05)和21.71個(gè)百分點(diǎn)(P<0.01)。以上結(jié)果表明，熱應(yīng)激抑制了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，溫度越高抑制作用愈明顯。

2.2 熱應(yīng)激對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的影響

由表2可知，熱應(yīng)激誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞死亡，并隨高溫強(qiáng)度的增加而作用增強(qiáng)，39 ℃熱應(yīng)激組細(xì)胞死亡高峰期出現(xiàn)在熱修復(fù)6 h左右，死亡率為15.42%。與對(duì)照組相比，熱恢復(fù)6 h時(shí)，39 ℃熱應(yīng)激組細(xì)胞晚期凋亡率(壞死率)提高了6.49個(gè)百分點(diǎn)(P<0.05)；41 ℃熱應(yīng)激組細(xì)胞死亡高峰期出現(xiàn)在熱修復(fù)12 h，死亡率高達(dá)23.18%。

表2 熱應(yīng)激對(duì)乳腺上皮細(xì)胞凋亡的影響

注:同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.3 熱應(yīng)激對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞Caspase-3活性的影響

從圖1可以看出，高溫處理后，Caspase-3活性呈上升趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，39 ℃和41 ℃熱應(yīng)激組在熱恢復(fù)0 h時(shí)，Caspase-3活性變化均不明顯，39 ℃熱應(yīng)激組在熱恢復(fù)6 h時(shí) Caspase-3活性顯著上升(P<0.05)，41 ℃熱應(yīng)激組在熱恢復(fù)6、12 h，Caspase-3活性分別為對(duì)照組的4.55倍(P<0.01)、5.31倍(P<0.01)；在熱恢復(fù)6、12 h，41 ℃熱應(yīng)激組Caspase-3活性顯著高于39 ℃熱應(yīng)激組。提示熱應(yīng)激反應(yīng)激活了凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵因子Caspase-3的活性，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。

同一時(shí)間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同圖1 熱應(yīng)激對(duì)乳腺上皮細(xì)胞Caspase-3活性的影響

2.4 熱應(yīng)激對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞HSP70基因表達(dá)的影響

從圖2可以看出，與對(duì)照組相比，39 ℃熱應(yīng)激組在熱恢復(fù)6 h，HSP70 基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，41 ℃熱應(yīng)激組在熱恢復(fù)0、6、12 h，HSP70基因的表達(dá)量分別為對(duì)照組的3.53倍(P<0.05)、5.61倍(P<0.01)和2.93倍(P<0.05)；在熱恢復(fù)6 h，41 ℃熱應(yīng)激組HSP70基因的表達(dá)量顯著高于39 ℃熱應(yīng)激組。說明熱應(yīng)激可提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞HSP70基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而保護(hù)細(xì)胞免受傷害。

圖2 熱應(yīng)激對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞HSP70基因表達(dá)的影響

3 結(jié)論與討論

乳腺細(xì)胞的增殖和凋亡共同處在動(dòng)態(tài)平衡之中，這對(duì)乳腺的發(fā)育和功能的形成都有重要作用[10]。乳腺細(xì)胞凋亡是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，不僅可自發(fā)產(chǎn)生，也受高溫、缺氧、射線、感染、藥物等多種因素的影響[11-13]。管英俊等[14]對(duì)原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的研究表明，高溫可使神經(jīng)細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)和內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，降低LDH活性，誘導(dǎo)DNA片段形成，從而誘發(fā)原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。杜娟等[3]報(bào)道，高溫使細(xì)胞G/M 期阻滯，誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞凋亡，形態(tài)上表現(xiàn)為染色質(zhì)濃縮、線粒體腫脹、空泡化、形成凋亡小體。熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的死亡誘導(dǎo)是一個(gè)延遲、漸進(jìn)的過程。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，39 ℃熱應(yīng)激組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和死亡率高峰期均發(fā)生在熱修復(fù)6 h，而41 ℃熱應(yīng)激組細(xì)胞死亡高峰期則出現(xiàn)在熱修復(fù)12 h左右，死亡率為23.18%。O’Neill等[15]將人淋巴細(xì)胞置于43 ℃環(huán)境熱處理1 h，在熱恢復(fù)12～18 h細(xì)胞凋亡達(dá)最高峰，提示高溫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡呈時(shí)間依賴性。人的白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞43 ℃熱處理1 h，熱恢復(fù)12 h出現(xiàn)死亡最高峰[16]?？梢?，細(xì)胞死亡是細(xì)胞遭受應(yīng)激的后續(xù)事件，不同的應(yīng)激因素，不同的細(xì)胞類型，其高峰期出現(xiàn)的時(shí)間也不一致。

Caspase家族是半胱氨酸依賴性細(xì)胞死亡蛋白酶，是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵元件[17]，其中Caspases-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，處于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是多種凋亡刺激信號(hào)傳遞的匯聚點(diǎn)，是細(xì)胞程序性死亡的介導(dǎo)者和執(zhí)行者[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫處理后，Caspase-3活性呈上升趨勢(shì)，在熱恢復(fù)6 h和12 h，41 ℃熱應(yīng)激組Caspase-3活性均顯著高于39 ℃熱應(yīng)激組。正常情況下，Caspase-3以無活性的酶原形式存在于胞漿中，而在細(xì)胞凋亡早期階段，Caspase-3被激活，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終引起細(xì)胞凋亡，Caspase-3活化是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志。

HSP70是細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下啟動(dòng)的一系列特殊基因編碼合成的蛋白質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能，如參與分子伴侶功能，提高細(xì)胞的應(yīng)激耐受性，參與細(xì)胞骨架的形成與修復(fù)等[19]。高熱、缺氧、機(jī)械刺激、射線等多種有害因素刺激均可誘導(dǎo)HSP70的產(chǎn)生[20-21]。熒光定量PCR分析結(jié)果表明，奶牛乳腺上皮細(xì)胞在41 ℃高溫應(yīng)激后0～12 h內(nèi)引發(fā)HSP70基因過表達(dá)，細(xì)胞凋亡率明顯增高，這與郭亮等[7]的報(bào)道相一致。這可能是因?yàn)閾p傷的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性、聚集、錯(cuò)折疊等現(xiàn)象大大增多，通過一系列機(jī)制誘導(dǎo)HSP70基因表達(dá)量上升。熱應(yīng)激后，HSP70高強(qiáng)度表達(dá)是評(píng)價(jià)組織細(xì)胞危險(xiǎn)性的生物標(biāo)志[22]，也提高了細(xì)胞的耐熱能力。HSP使細(xì)胞產(chǎn)生耐熱性的分子機(jī)制可能與HSP可防止細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊或聚集有關(guān)。熱應(yīng)激條件下，細(xì)胞DNA合成、RNA 轉(zhuǎn)錄及翻譯均會(huì)受到抑制，蛋白質(zhì)發(fā)生變性、錯(cuò)誤聚集甚至降解，細(xì)胞膜通透性改變[23]。Segal等[24]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致功能喪失，HSP70基因表達(dá)量升高，提高了細(xì)胞對(duì)高溫的耐受性。

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Effects of Heat Stress on Apoptosis and Expression ofHSP70 mRNA in Bovine Mammary Epithelial Cells

ZHANG Xiangying1，2，TANG Xianwen1，CHEN Jingbo1，LI Tengteng1

(1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College，Taizhou 225300，China;2.Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)

To explore the effects of heat stress on the apoptosis of the bovine mammary epithelial cells and the expression ofHSP70 mRNA,the logarithmic growth phase mammary epithelial cells were exposed to 39 ℃ and 41 ℃ for 1 h(the control group was cultured at 37 ℃),and cells were collected in the recovery times at 0,6，12 h.Cell growth inhibition rate was detected by MTT method,cell apoptosis was measured by Annexin V/PI double staining method,Caspase-3 activity was detected by colorimetric assay and the expression level ofHSP70 was tested by RQ-PCR.The results showed that the highest growth inhibition rate and maximum death rate of mammary epithelial cells occurred in the recovery 6 h against 39 ℃ and the cell mortality rate was 15.42%,while they occurred in the recovery 12 h against 41 ℃ and the largest cell mortality rate was 23.18%.After high temperature treatment,the activity of Caspase-3 increased.The expression level ofHSP70 mRNA in the recovery 6 h against 39 ℃was significantly higher than that in control.And it was 3.53 times,5.61 times and 2.93 times significantly higher than that of control in the recovery 0,6，12 h respectively against 41 ℃.This suggested that heat stress activated the activity of Caspase-3 in the mammary epithelial cells and induced cell apoptosis with the increase of temperature.At the same time,the cells over-expressedHSP70 by heat stress,and could acquire tolerance.

mammary epithelial cells; heat stress; cell apoptosis;HSP70

2017-02-26

江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2008306-2)；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(201612806053P)

張響英(1974-)，女，山東煙臺(tái)人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物遺傳繁育與生物技術(shù)研究。 E-mail:724673081@qq.com

S823;Q256

A

1004-3268(2017)08-0142-05