1株豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及其生物學特性研究

李曉楠，唐青海,*，李 羽，王 瑾，姚倫廣，闞云超，楊 海

(1.南陽師范學院 河南省伏牛山昆蟲生物學重點實驗室/昆蟲生物反應器河南省工程實驗室，河南 南陽 473061；2.衡陽師范學院 生命科學與環(huán)境學院/生物藥物研究所，湖南 衡陽 421008)

1株豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及其生物學特性研究

李曉楠1，唐青海1,2*，李 羽1，王 瑾1，姚倫廣1，闞云超1，楊 海2

(1.南陽師范學院 河南省伏牛山昆蟲生物學重點實驗室/昆蟲生物反應器河南省工程實驗室，河南 南陽 473061；2.衡陽師范學院 生命科學與環(huán)境學院/生物藥物研究所，湖南 衡陽 421008)

采集1例疑似感染豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)仔豬的糞便，運用RT-PCR方法和血清學方法對病料進行TGEV檢測，并應用豬睪丸細胞(ST)進行病毒分離培養(yǎng)，分別采用免疫過氧化物酶單層細胞染色法(IPMA)和RT-PCR方法檢測病毒在ST細胞中的增殖動態(tài)，應用RT-PCR方法擴增分離TGEVS1基因，經序列測定后，采用DNAStar 7.0和Mega 5.0軟件對TGEV進行生物信息學分析。結果表明，病料接種到ST細胞培養(yǎng)后，出現明顯細胞病變效應(CPE)；RT-PCR檢測結果顯示，TGEV核酸陽性；血清學鑒定TGEV抗原陽性。將分離毒株命名為TGEV-NY。感染12 h后，IPMA檢測結果陽性，且可從細胞培養(yǎng)上清中檢出TGEV核酸。序列測定分析表明，分離毒株S1基因開放閱讀框(ORF)為2 220 bp，編碼740個氨基酸。進化分析顯示，分離毒株與我國2006年分離的SC-Y毒株親緣關系最近，分離毒株屬于基因Ⅰ群。

豬傳染性胃腸炎病毒； 分離培養(yǎng)； 免疫過氧化物酶單層細胞染色法；S1基因

傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)是冠狀病毒科(Coronaviridae)成員，該病毒是引起豬胃腸炎的主要病原體。所有年齡段的豬均能夠被該病毒感染，尤其以哺乳期仔豬易感性最強，發(fā)病率和死亡率最高，哺乳動物死亡率可高達100%[1-2]。TGEV是囊膜病毒，遺傳物質為正鏈、單股RNA，基因組的1/3堿基編碼結構蛋白和非結構蛋白，編碼基因按照5′-rep-S-3a-3b-E-M-N-ORF7-3′順序排列。其中，纖突蛋白(S蛋白)、跨膜蛋白(M蛋白)、小包膜蛋白(E蛋白)和核衣殼蛋白(N蛋白)為病毒結構蛋白。S蛋白不僅是介導病毒吸附宿主細胞、入侵機體的主要結構蛋白，也是刺激機體產生抗TGEV中和性抗體的主要抗原蛋白。S蛋白是一種糖基化蛋白，肽鏈全長約為1 450個氨基酸，糖基化分子質量為128～160 ku，其N端的S1區(qū)有4個抗原位點，分別為A、B、C和D表位。其中，A表位可刺激機體產生中和抗體，并能夠與機體的氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)結合，從而介導病毒感染[3-5]。因此，S1蛋白也是TGEV基因工程疫苗、診斷、分子流行病學調查分析和遺傳變異研究的主要蛋白[6-10]。本研究從采自南陽地區(qū)1份疑似TGEV感染糞樣中分離培養(yǎng)TGEV，并進行核酸和血清學鑒定，研究其體外培養(yǎng)特性和進化特征，為進一步開展更廣泛的流行病學調查、建立新的血清學診斷方法及開發(fā)新型疫苗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株、質粒及主要試劑

1.2 病料的采集和處理

收集病料(病豬糞便)200 μg左右，置于已滅菌的EP管中，加入1 mL PBS溶液，充分混勻，放于-20 ℃和37 ℃反復凍融3次，振蕩15 s，3 000 r/min離心2 min，取上清放于-20 ℃冰箱保存。樣品編號為NY。

1.3 病料的RT-PCR檢測

根據GenBank上公布的TGEV-S核酸序列(TGEV-S收錄號為EU074218)，在保守區(qū)設計1對特異性引物，TGEV-S-F:5′-ACTAAGCTTTTAGCTTACATCACATGGCGTTACAG-3′， TGEV-S-R:5′-ACTGGATCCATGAAAAAATTATTTGTGGT-3′，擴增片段大小為2 220 bp。取步驟1.2中200 μL上清，應用Trizol試劑提取總RNA，取2 μg總RNA，采用PrimeScriptⅡFirst Strand cDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA，取2 μL合成產物進行PCR擴增。采用50 μL PCR反應體系，2 μL模板DNA，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，5× Primer Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，Prime STAR GXL DNA聚合酶1 μL，ddH2O 31 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性4 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 5 min，35個循環(huán)；68 ℃ 7 min，4 ℃保存。以吉林五星疫苗毒為陽性對照，以ddH2O為陰性對照。取PCR反應產物5 μL，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.4 病毒的分離培養(yǎng)

ST細胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(青霉素鈉和硫酸鏈霉素各100 μg/mL)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，待細胞長至80%時，用PBS洗滌1次，并將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。將1.2中處理上清，經0.22 μm濾器進行無菌過濾，接種細胞(體積比1∶10)。每間隔24 h觀察細胞病變效應(CPE)，在CPE達80%以上時，凍融3次，收獲病毒，按照上述方法將病毒進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，另設定正常細胞為對照。

1.5 病毒在ST細胞中的增殖動態(tài)檢測

日本的立法模式采用的是混淆可能性包含于商標近似的判定標準。這種模式的好處是考慮因素比較全面，而且對商標近似的判定將會更加準確，因為其依靠商標混淆可能性的判定因素來確定。日本商標法37條提煉了8個商標侵權的行為要件。因為日本的判定標準在前文中也進行分析了，主要采用“商標近似+商品類似”的方法，后來又凝練成三要素的判定方法，但是在司法實踐中日本也并非全是按照這種判定方法進行審理商標侵權案件的，在1959年以后，多冊進行修改，也出現很多典型的判例，最后在司法實踐和理論探討中形成了混淆可能性包含于商標近似的判定標準。

1.5.1 病毒感染上清RT-PCR檢測 將ST細胞接種到8個直徑為35 mm培養(yǎng)皿中，保持密度適當，以24 h長至80%為宜；將分離得到的第3代病毒(F3)接種至ST細胞，每個培養(yǎng)皿接種劑量為4×103TCID50，留1個培養(yǎng)皿不接種病毒為對照。棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，加入2 mL無血清的培養(yǎng)基，取10 μL病毒液加入到培養(yǎng)基中，充分搖勻，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，分別收集單層接毒后4、6、8、12、24、48 h樣品。每個培養(yǎng)皿取上清200 μL提取RNA，用于RT-PCR檢測，檢測方法如1.3所述，以不接毒細胞為陰性對照，擴增片段大小為718 bp。

1.5.2 免疫過氧化物酶單層細胞染色法(IPMA)檢測細胞中病毒動態(tài) IPMA方法參考文獻[11]改進后進行，每個培養(yǎng)皿細胞用2 mL PBS洗滌3次，真空干燥，加入1.5 mL 4%的多聚甲醛，室溫條件下固定1 h，真空干燥，加入1.5 mL 按1∶20比例稀釋的TGEV S1蛋白多克隆抗體(本實驗室制備)，37 ℃條件下孵育1 h。PBS洗滌3次。加入1.5 mL經1∶3 000倍稀釋的HRP-SPA，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次，加入1.5 mL AEC底物顯色液，37 ℃孵育15 min。棄掉反應液，蒸餾水沖洗2次，每個培養(yǎng)皿中加入終止液2 mL。

1.6 TGEV-NYS1基因的克隆及序列分析

將1.3中得到PCR產物采用Axygen公司PCR產物純化試劑盒進行純化，純化后的產物按1∶1的比例與Premix ExTaq混合，經95 ℃ 5 min、68 ℃ 20 min反應后，用Axygen公司PCR產物純化試劑盒進行純化。將純化產物與pET28a載體連接，轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆后提取質粒進行酶切和序列測定，將得到的重組載體命名為pET28a-TGEV-S1。將測序序列與GenBank中公布的TGEV-133(登錄號JQ693049)等33株(毒株信息見表1)S1全基因序列進行比對，運用Mega 5.0軟件進行分析，通過鄰接法比較，構建系統(tǒng)進化樹，分析分離毒株的進化地位。

表1 TGEV參考毒株信息

2 結果與分析

2.1 病料的RT-PCR檢測

從圖1可以看出，樣品NY和陽性對照均擴增出了2 220 bp條帶，與預期片段長度一致。這一結果表明，樣品NY為TGEV核酸陽性。

M：Marker 2000；1：樣品NY；2：陽性對照；3：陰性對照圖1 RT-PCR檢測結果

2.2 病毒的分離培養(yǎng)

鑒于病料NY中TGEV核酸陽性，將處理過的病料按同步接毒的方式接種至ST細胞，培養(yǎng)72 h，未接種病料的對照細胞生長正常，接種病料的細胞出現典型的TGEV細胞病變，細胞變圓、脫落、拉網(圖2)。連續(xù)接種培養(yǎng)3代，均出現出明顯的CPE。將分離培養(yǎng)的病毒命名為TGEV-NY。

圖2 TGEV-NY毒株的細胞病變情況

2.3 TGEV-NY毒株在ST細胞中的增殖動態(tài)檢測結果

2.3.1 病毒感染上清RT-PCR檢測結果 從圖3可以看出，TGEV-NY感染12 h后，從細胞培養(yǎng)上清中能夠檢出TGEV核酸，且隨著感染時間的延長，擴增條帶亮度增強。

M:Marker 5000；1—7依次為感染4、6、8、12、24 h后的細胞上清，48 h后的陰性細胞上清，感染48 h后的陽性細胞上清；8：陽性對照圖3 TGEV感染細胞上清的核酸RT-PCR擴增結果

2.3.2 IPMA檢測細胞中病毒動態(tài) 經IPMA檢測發(fā)現，感染后6 h和8 h，細胞中可見極少量特異性染色陽性細胞，陽性細胞在細胞核周圍呈棕紅色染色；感染12 h后可檢出大量陽性細胞，隨著時間的延長，染色范圍越來越大，陽性細胞越來越多，可觀察到成片感染病毒的細胞。感染24～48 h后染色效果最佳。未接毒的細胞在培養(yǎng)48 h后仍然生長良好(圖4)。

2.4 TGEV-NYS1基因的克隆及序列分析

用引物TGEV-S-F和TGEV-S-R對TGEV-NY進行擴增，結果顯示，特異性條帶大小為2 220 bp，與預期大小相符，表明擴增到了TGEV-NY毒株的S1基因。將基因純化回收克隆至pET28a載體并命名為pET28a-TGEV-NY-S1，重組載體經Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切，得到相應大小的目的條帶，表明重組載體構建成功。經序列測定，表明擴增基因為S1基因，其全長為2 220 bp,編碼740個氨基酸。將測序所得序列提交至NCBI數據庫中進行比對發(fā)現，TGEV-NY株與美國、英國、韓國等國際參考毒株的核苷酸和氨基酸序列的相似性都高于85%。利用Mega 5.0軟件，以鄰接法對選取的來自美國、韓國、英國等多個國家的33個參比序列構建進化樹(圖5)。

圖4 IPMA檢測TGEV-NY在ST中的增殖動態(tài)

圖5 TGEV毒株S1基因系統(tǒng)進化樹

結果表明，TGEV的S1基因可以分為2個群(基因Ⅰ型和基因Ⅱ型)，TGEV-NY分離株與中國株TGEV SHXB KP202848、美國株TGEV PUR46-MAD M94101、韓國株TGEV DAE JQ693050等同屬于基因Ⅰ型，與中國株TGEV SC-Y DQ443743距離最近。

3 結論與討論

目前，臨床上用于TGEV核酸診斷最常用的方法有普通RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR[12-14]。本研究在臨床發(fā)現1例以嘔吐、水樣腹瀉和脫水為特征的病例，疑似文獻報道TGEV感染出現的癥狀[15]。經RT-PCR檢測，病料的TGEV核酸檢測結果呈陽性。隨后，將病料接種ST細胞培養(yǎng)72 h，出現典型的CPE。由于TGEV毒株的不同，對細胞的感染力和增殖動態(tài)有一定的差異。ST細胞接種TGEV-NY毒株后，出現CPE的時間與接種時的病毒量、接種方法和細胞密度等因素有關。普遍認為細胞密度為80%左右時接種病毒，以2%左右的胎牛血清培養(yǎng)基作為維持液進行培養(yǎng)，比較適合病毒的增殖[15]。本研究采用同樣細胞密度接種病毒，以無血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，這樣既能夠排除血清中的某些因子對病毒分離培養(yǎng)的影響，又能節(jié)約培養(yǎng)成本。

目前，TGEV病毒抗原檢測方法有膠體金試紙條法、ELISA法和間接免疫熒光等方法[16-18]。ELISA法能通過吸光度檢測病毒的含量，但不能直觀顯示病毒在細胞中的分布狀態(tài)；間接免疫熒光需在熒光顯微鏡下觀察，對設備要求高、操作復雜，且假陽性率較高。IPMA法等已經用于多種病毒如馬動脈炎病毒[11]、豬流感病毒[19]、豬戊型肝炎病毒[20]、犬細小病毒[21-22]、豬圓環(huán)病毒[23]等及其相應抗體的檢測。為了研究TGEV-NY的體外感染增殖特性，本研究采用IPMA法檢測了病毒在ST細胞中感染的早期增殖動態(tài)。結果顯示，病毒接種后24 h和48 h，TGEV核酸陽性結果較為明顯，與之對應的細胞IPMA染色也為陽性；感染6 h后至感染12 h后這個階段病毒的增殖相對較慢。病毒感染24 h后，TGEV感染陽性細胞明顯增多，而且染色較早期感染更深，說明細胞內的病毒抗原含量增加；感染48 h后，90%以上的細胞均為TGEV抗原陽性，說明感染后24～48 h為TGEV在ST細胞中的快速增殖階段。

前人研究表明，TGEV僅有1種血清型，但從其基因組核酸特征將其劃分為基因Ⅰ型和基因Ⅱ型[1,24]。為了確定TGEV-NY毒株的基因型，測定了該病毒S1基因序列，生物信息學分析顯示，TGEV-NY屬于基因Ⅰ型，與中國株TGEV SC-Y DQ443743距離最近，與英國株TGEV AF104420、中國株TGEV TSX DQ001167距離較遠。根據文獻報道，我國的大部分地區(qū)流行的毒株也以基因Ⅰ型毒株較多[15]。S蛋白氨基端是TGEV識別靶細胞和決定病毒組織噬性的密切相關區(qū)，不同毒株的氨基端變異程度差異很大[7]，將S1基因作為TGEV分子流行病學調查的靶基因對于掌握臨床流行毒株分子進化和抗原變異情況具有重要的指導意義，可為病原監(jiān)控、開發(fā)與流行毒株相匹配的診斷試劑和疫苗提供基礎數據[25]。

綜上，本研究成功分離鑒定了1株TGEV基因Ⅰ型毒株，研究了其體外培養(yǎng)特性，為進一步開展該病毒的診斷和疫苗研究提供了基礎材料。

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Isolation and Identification of a Transmissible Gastroenteritis Virus Strain NY and Its Biological Characterization

LI Xiaonan1，TANG Qinghai1,2*，LI Yu1，WANG Jin1，YAO Lunguang1，KAN Yunchao1,YANG Hai2

(1.Henan Provincial Engineering Laboratory of Insect Bio-reactor/Henan Provincial Key Laboratory of Funiu Mountain in Insect Biology,Nanyang Normal University,Nanyang 473061,China； 2.Institute of Biological Medicine,College of Life Sciences and Environment,Hengyang Normal University,Hengyang 421008,China)

The faeces samples were collected from a pig with severe diarrhoea,transmissible gastroenteritis virus(TGEV) nucleotide was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and serological methods to isolate the new TGEV strain.The filtered samples were inoculated into ST cells to isolate viruses,then the characterization of the viruses propagated in ST cells were determined by immunoperoxidase monolayer assay(IPMA) and RT-PCR.TGEVS1 gene was amplified by RT-PCR and sequenced,analyzed by solftware DNAStar 7.0 and Mega 5.0.Results showed that significant cytopathic effect(CPE) of ST cells inoculated the sample was observed;RT-PCR detection results showed that the culture samples were TGEV nucleotide positive,as well as serologic test results showed that the culture samples were TGEV antigenic positive.The isolated virus strain was named TGEV-NY.TGEV could be detected in the ST cells 12 hours post infection(hpi) by IPMA,as well as TGEV nucleotide could be detected by RT-PCR in the culture supernant.Nucleotide sequences showed that the open reading frame ofS1 gene was 2 220 bp encoding 740 aa.Phylogenetic analysis showed that TGEV-NY strain belonged to the gene groupⅠ,shared close genetic relationship with TGEV strain SC-Y which was isolated in 2006 from China.

transmissible gastroenteritis virus; isolation and culture; immunoperoxidase monolayer assay;S1 gene

2016-12-02

河南省重點科技攻關項目(142102110101)；河南省高等學校重點科研項目(16A230023)；南陽師范學院研究生創(chuàng)新基金項目(2016CX008)；衡陽師范學院引進人才專項(16D20)

李曉楠(1989-)，女，河南南陽人，在讀碩士研究生，研究方向：生物制藥與疫苗工程。E-mail:929016862@qq.com

*通訊作者：唐青海(1982-)，男，湖南祁陽人，講師，博士，主要從事生物制藥與疫苗工程研究。 E-mail:qinghaitang109@126.com

S855.3

A

1004-3268(2017)08-0131-06