糖腎寧含藥血清對(duì)高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞增殖作用及RhoA/ROCK信號(hào)通路影響的實(shí)驗(yàn)研究＊

王婷，趙宗江，張新雪，苗永輝，楊冠男

糖腎寧含藥血清對(duì)高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞增殖作用及RhoA/ROCK信號(hào)通路影響的實(shí)驗(yàn)研究＊

王婷，趙宗江＊＊，張新雪，苗永輝，楊冠男

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院北京100029）

目的：探討糖腎寧含藥血清對(duì)高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞增殖作用及RhoA/ROCK信號(hào)通路的影響。方法：10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞分為正常組、模型組、厄貝沙坦組和糖腎寧組，按每孔3 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中。每組8個(gè)復(fù)孔，加入6%的各組含藥血清培養(yǎng)，分別于12、24、48、60 h觀察細(xì)胞形態(tài)并應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況；Western blotting檢測RhoA、ROCK1、α-SMA和E-Cadherin蛋白的表達(dá)。結(jié)果：正常組細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，高糖刺激下，細(xì)胞呈梭型，加入含藥血清后呈扁平不規(guī)則多角形。MTT：24、48 h，正常組與模型組比較，有極顯著性差異（P＜0.01），60 h，正常組與模型組比較，有顯著性差異（P＜0.05）；24 h，糖腎寧組與厄貝沙坦組比較，有顯著性差異（P＜0.05）；48 h，糖腎寧組與厄貝沙坦組、Y27632組比較，有極顯著性差異（P＜0.01）；60 h，糖腎寧組與厄貝沙坦組、Y27632組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。Western blotting：正常組與模型組、Y27632組比較RhoA蛋白表達(dá)減少，有極顯著性差異（P＜0.01）；糖腎寧組與模型組比較，有極顯著性差異（P＜0.01）；糖腎寧組與Y27632組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。正常組與模型組比較ROCK1蛋白表達(dá)減少，有極顯著性差異（P＜0.01）；Y27632組、各治療組和模型組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。正常組與模型組比較α-SMA蛋白表達(dá)減少，有極顯著性差異（P＜0.01）；Y27632組、各治療組和模型組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。正常組與模型組組比較E-Cadherin蛋白表達(dá)增加，有顯著性差異（P＜0.05）；Y27632組與糖腎寧組比較，有顯著性差異（P＜0.05）；模型組與Y27632組、各治療組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論：糖腎寧可抑制高糖培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞增殖和RhoA/ROCK信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、減輕腎間質(zhì)纖維化、延緩DKD進(jìn)程。

糖腎寧腎痿腎小管上皮細(xì)胞株KKay小鼠細(xì)胞增殖MTT EMT RhoA/ROCK信號(hào)通路

由于人口老齡化情況加劇，飲食結(jié)構(gòu)以及生活方式的不斷改變，使眾多發(fā)展中國家及部分發(fā)達(dá)國家中罹患糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）的人數(shù)急劇上升。我國在過去30年中DM發(fā)病率急劇攀升，據(jù)統(tǒng)計(jì)中國約0.92億人罹患DM[1～3]。此外，DM其微血管并發(fā)癥糖尿病腎病（Diabetic Kidney Disease，DKD）嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。DKD已成為終末期腎?。‥nd stage renal disease,ESRD）的主要原因[4,5]。現(xiàn)研究表明DKD發(fā)病機(jī)制與腎小球及腎小管的病理改變密切相關(guān)，抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化在延緩糖尿病腎病進(jìn)程中具有重要作用。目前多應(yīng)用ACEI及ARB類藥物，可降低尿蛋白水平、減少并發(fā)心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)及控制血壓[6]。因此如何有效防治本病的發(fā)生發(fā)展是亟需解決的重要問題。

近年來，中醫(yī)藥在防治本病方面取得了一定的進(jìn)展，并初步顯示出獨(dú)特優(yōu)勢。導(dǎo)師趙宗江教授發(fā)掘傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“痿癥”相關(guān)理論，并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)DKD的認(rèn)識(shí)，提出了DKD“腎痿”假說，并在此理論指導(dǎo)下組方糖腎寧，前期研究表明以“腎痿”假說組方的糖腎寧具有消除水腫、降低蛋白尿等的作用；糖腎寧可通過下調(diào)腎組織TGF-β1、NF-?B蛋白表達(dá)，上調(diào)smad7蛋白的表達(dá)來改善STZ誘導(dǎo)DKD大鼠腎功能及氧化應(yīng)激狀態(tài)，起到延緩DKD進(jìn)程的重要作用，此外，應(yīng)用高糖培養(yǎng)足細(xì)胞中證實(shí)糖腎寧可以下調(diào)TGF-β1、NF-?B表達(dá)，上調(diào)smad7表達(dá)[7,8]。而且糖腎寧通過調(diào)控TGF-β1-smad2/3-ILK信號(hào)通路，抑制足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，保護(hù)腎小球結(jié)構(gòu)與功能，從而減輕DKD腎臟損害，延緩病程進(jìn)展[9]。本研究擬通過給予高糖環(huán)境刺激小鼠腎小管上皮細(xì)胞，觀察糖腎寧含藥血清對(duì)高糖培養(yǎng)小鼠腎小管上皮細(xì)胞增殖及RhoA/ROCK信號(hào)通路的影響，以期闡述其對(duì)腎小管上皮細(xì)胞增殖與上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響，為糖尿病腎病“腎痿”科學(xué)假說提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

小鼠近端腎小管上皮細(xì)胞株（購買自美國ATCC公司，4100-57）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

糖腎寧（熟地黃6 g、山萸肉3 g、懷山藥3 g、杜仲2 g、炒白芍2 g、淫羊藿2 g、水蛭2 g、酒大黃2 g，北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制劑室制備，批號(hào)：2016019）；厄貝沙坦片（賽諾菲安博維，進(jìn)口藥品注冊證號(hào)：H20140006，國藥準(zhǔn)字J20130049）。

1.3 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco，批號(hào)：1786043）；胰蛋白酶（Amresco，批號(hào)：1554C333）；胎牛血清（HyClone，批號(hào)：NZE1145）；MTT（Amresco，批號(hào)：20120308418）；DMSO（Amresco，批號(hào)：2075C127）；青鏈霉素混合液（Solarbio，貨號(hào)：P1400）；右旋葡萄糖（D-GLU，Amresco，批號(hào)1056C459）；蛋白抽提試劑（MERCK，71009-3CN）；通用型蛋白酶抑制劑（MERCK，539134）；BCA法蛋白定量試劑盒（普利萊，批號(hào)：20151511052003）；一抗β-actin（CST，批號(hào)：0011）；RhoA（Novus Biologicals，批號(hào)：Rb0322-200308-WS）；ROCK1（Abcam，批號(hào)：GR149410-2）；α-SMA（Abcam，批號(hào)：GR32377-41）；E-Cadherin（Abcam，批號(hào)：GR216035-1）；二抗山羊抗兔（Abcam，批號(hào)：GR231489-1）；山羊抗鼠（Abcam，批號(hào)：GR215715-5）；ECL超敏發(fā)光液（Millipore，批號(hào)：1316802）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

倒置顯微鏡（Olympus），超凈工作臺(tái)（北京市昌平長城空氣凈化設(shè)備公司)，B5060EK/CO2恒溫CO2培養(yǎng)箱（德國），450型自動(dòng)酶標(biāo)儀（MuLtiskan Aseentvl 24345-00627T）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 含藥血清的制備

9只Wistar大鼠，雄性，SPF級(jí)，體重（300±20）g，按照體重隨機(jī)分層，分為正常組、厄貝沙坦組、糖腎寧組3組，每組各3只，給藥組每天灌胃給藥1次，灌胃劑量1 mL·100 g-1，正常組灌等量去離子水，依據(jù)人臨床用藥劑量，糖腎寧按人臨床用藥劑量7倍（1.05 g·kg-1）灌胃給藥；厄貝沙坦組按人臨床用藥劑量7倍（17.5 mg·kg-1）灌胃給藥，每日1次，連續(xù)灌胃7天，末次給藥2 h后，股動(dòng)脈取血，離心分離血清，-20℃保存

2.2 細(xì)胞處理及分組

鏡下觀察細(xì)胞生長至80%左右時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化2 min，10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基終止消化后離心，1 000 rpm離心2 min，棄上清；加含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、抑制劑（Y27632）組、厄貝沙坦組、糖腎寧組。正常組：6%正常大鼠血清-RPMI 1640；模型組：6%正常大鼠血清-RPMI 1640+DGLU（30 mmol/L）；Y27632組：6%FBS-RPMI 1640+DGLU（終濃度30 mmol/L）+Y27632（10 umol/L）；厄貝沙坦組：6%厄貝沙坦含藥血清-RPMI 1640+D-GLU（30 mmol/L）；糖腎寧組：6%糖腎寧含藥血清-RPMI 1640+D-GLU（30mmol/L）；

2.4 倒置相差顯微鏡下觀察小鼠腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)的改變

選擇合適亮度及瞳距，先以目鏡為10×，物鏡為4×觀察，粗微調(diào)焦后使鏡下腎小管上皮細(xì)胞清晰，切換到10×物鏡統(tǒng)一選取培養(yǎng)瓶中央拍照。

圖1 各組小鼠腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)及增殖情況（×100）

2.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖

細(xì)胞生長至80%左右，0.25%的胰酶1 mL消化，等體積6%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基終止消化；按每孔300 0個(gè)細(xì)胞種植于96孔培養(yǎng)板上，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，置培養(yǎng)箱中孵育24 h，無血清RPMI 1640液每孔200 μL培養(yǎng)，細(xì)胞同步24 h，使細(xì)胞靜止于Go期；吸棄舊的培養(yǎng)基，加入相應(yīng)組別含藥血清；繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、60h甩去96孔板內(nèi)培養(yǎng)基，各孔加入10 μL終濃度為5 mg·ml-1的MTT溶液及190 μL無血清1640培養(yǎng)基；37℃、CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h；甩去各孔培養(yǎng)基，室溫避光條件下加入200 μL DMSO（二甲基亞砜，Dimethylsulfoxide），置于搖床上輕輕震蕩10 min，450型自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測并記錄各孔吸收波OD值（波長492 nm）。

2.6 Western blotting檢測各組腎小管上皮細(xì)胞中RhoA、ROCK1、α-SMA、E-Cadherin蛋白的表達(dá)

取小鼠腎組織勻漿后加1 mL預(yù)冷的RIPA裂解液，取上清液。BCA法測蛋白濃度，加上樣緩沖液沸水浴5 min進(jìn)行蛋白變性，制備SDS-PAGE膠、蛋白上樣，凝膠電泳80 V，30 min左右，藍(lán)色指示劑到達(dá)濃縮膠下緣時(shí)，調(diào)節(jié)電壓為120 V繼續(xù)電泳1.5 h左右終止電泳。恒壓轉(zhuǎn)膜60 V 2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBS（TBS-T）沖洗，分別加β-actin（1∶200 0）、RhoA（1∶500）、ROCK1（1∶500）、α-SMA（1∶200 0）、E-Cadherin（1∶100 0），4℃過夜。加二抗（稀釋1∶200 0），置于搖床室溫反應(yīng)1小時(shí)，ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，應(yīng)用BIO-RAD曝光成像系統(tǒng)拍照，Image J圖像分析進(jìn)行圖像分析；各靶蛋白均與內(nèi)參β-actin蛋白對(duì)照，計(jì)算靶蛋白條帶與β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為靶蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS22.0系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用（xˉ±s）表示，組間比較用One-Way ANOVA，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)

正常培養(yǎng)下小鼠腎小管上皮細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央圓形核，細(xì)胞融合呈鵝卵石狀；高糖刺激后，細(xì)胞呈梭形，生長時(shí)呈放射狀；相應(yīng)含藥血清干預(yù)后，胞體由拉長的梭形向扁平不規(guī)則多角形發(fā)展，見圖1。

3.2 糖腎寧對(duì)小鼠腎小管上皮細(xì)胞增殖的影響

如表1所示，24、48 h時(shí)，正常組與模型組比較，有極顯著性差異（P＜0.01），60 h，正常組與模型組比較，有顯著性差異（P＜0.05）；24 h，糖腎寧組與厄貝沙坦組比較，有顯著性差異（P＜0.05）；48 h，糖腎寧組與厄貝沙坦組、Y27632組比較，有極顯著性差異（P＜0.01）；糖腎寧組與厄貝沙坦組、Y27632組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。

3.3 糖腎寧對(duì)高糖培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞RhoA、

ROCK1、E-cadherin、α-SMA蛋白表達(dá)的影響

3.3.1 RhoA、ROCK1表達(dá)

正常組與模型組、Y27632組比較RhoA蛋白表達(dá)減少，有極顯著性差異（P＜0.01）；糖腎寧組與模型組比較，有極顯著性差異（P＜0.01）；糖腎寧組與Y27632組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。正常組與模型組比較ROCK1蛋白表達(dá)減少，有極顯著性差異（P＜0.01）；Y27632組、各治療組和模型組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 糖腎寧對(duì)高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞增殖的影響（xˉ±s，n=7，OD值）

表2 糖腎寧對(duì)高糖刺激小鼠腎小管上皮細(xì)胞RhoA/ROCK通路蛋白表達(dá)的影響（xˉ±s，n=3）

3.3.2 α-SMA、E-Cadherin表達(dá)

正常組與模型組比較α-SMA蛋白表達(dá)減少，有極顯著性差異（P＜0.01）；Y27632組、各治療組和模型組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。正常組與模型組比較E-Cadherin蛋白表達(dá)增加，有顯著性差異（P＜0.05）；Y27632組與糖腎寧組比較，有顯著性差異（P＜0.05）；模型組與Y27632組、各治療組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。見表2，圖2。

4 討論

圖2 糖腎寧對(duì)高糖刺激小鼠腎小管上皮細(xì)胞RhoA、ROCK1、α-SMA、E-CAD蛋白表達(dá)的影響

DKD是糖尿病常見的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制與血流動(dòng)力學(xué)異常、糖代謝紊亂和遺傳等因素有關(guān)，其病理改變主要包括腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化[10,11]。腎小管上皮細(xì)胞作為形成腎小管-間質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要細(xì)胞之一，其表型轉(zhuǎn)化在腎小管-間質(zhì)纖維化進(jìn)展過程中起重要作用。腎小管上皮細(xì)胞EMT是 DKD功能喪失的關(guān)鍵因素，糖尿病腎病時(shí)，高糖刺激下會(huì)加重腎小管間質(zhì)的損傷。糖尿病腎病時(shí)發(fā)生腎小管上皮細(xì)胞損傷，機(jī)體通過細(xì)胞增殖起到保護(hù)作用，也可以在增殖后進(jìn)一步轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞，分泌致纖維化生長因子加重DKD腎纖維化的進(jìn)程[6]。因此，通過抑制細(xì)胞增殖可以在一定程度上抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。研究高糖培養(yǎng)下腎小管上皮細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)分化之間的關(guān)系變得尤為重要。

中醫(yī)學(xué)中將糖尿病腎病歸屬于“水腫”、“消渴腎病”、“腎風(fēng)”等范疇。導(dǎo)師趙宗江教授在整理古代文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床實(shí)踐，提出糖尿病腎病“腎痿”假說：DKD的發(fā)生發(fā)展，實(shí)質(zhì)上是DM遷延不愈，傷陰耗氣，痰郁熱瘀互相膠結(jié)，積聚于腎臟，損傷“腎體”，結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)，導(dǎo)致“腎用”發(fā)生改變，腎臟痿廢不用，發(fā)為“腎痿”[7]。在“腎痿”假說指導(dǎo)下組方的糖腎寧，其藥物組成有熟地黃、山萸肉、懷山藥、杜仲、炒白芍、淫羊藿、水蛭、酒大黃，其中熟地黃、山萸肉、懷山藥滋腎陰補(bǔ)血；淫羊藿、杜仲溫腎助陽；炒白芍健脾補(bǔ)虛柔肝；水蛭、酒軍活血化瘀解毒，諸藥合用可溫腎健脾，化瘀解毒，適用于陰陽兩虛證、瘀毒內(nèi)阻證，對(duì)DKD具有良好的效果[8]。

糖腎寧不僅在臨床上取得了較好的療效，本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究也肯定了糖腎寧的療效[8,9]。前期研究表明糖腎寧可通過提高Smad7、抑制TGF-β1和NF-κB表達(dá)來改善DN大鼠糖尿病腎病癥狀，同時(shí)，糖腎寧可通過調(diào)控TGF-β1-smad2/3-ILK信號(hào)通路抑制足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，保障腎小球?yàn)V過屏障功能，延緩DKD進(jìn)程。本次細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是在前期研究基礎(chǔ)上，探討糖腎寧對(duì)高糖培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)分化的影響，結(jié)果表明糖腎寧可以抑制高糖培養(yǎng)下的腎小管上皮細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)分化，降低RhoA、ROCK1和α-SMA蛋白表達(dá)水平，升高E-Cadherin蛋白表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，抑制DKD腎間質(zhì)纖維化，延緩疾病進(jìn)程，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1Zhu B,Wu X,Bi Y,et al.Effect of bilirubin concentration on the risk of diabetic complications:A meta-analysis of epidemiologic studies.Sci Rep-UK,2017,7:41681.

2Liu Y,Song Y,Tao L,et al.Prevalence of diabetic retinopathy among 13 473 patients with diabetes mellitus in China:a cross-sectional epidemiological survey in six provinces.Bmj Open,2017,7(1): e013199.

3Jia W,Tong N.Diabetes prevention and continuing health-care reform in China.Lancet Diabetes&Endocrinology,2015,3(11):840-842.

4Zuo H,Shi Z,Hussain A.Prevalence trends and risk factors for the diabetes epidemic in China:a systematic review and meta-analysis. Diabetes Res Clin Pract.2014,104(3):63–72.

5Mansour I,Thajudeen B.Overview of Diabetic Nephropathy.Managing Diabetic Nephropathies in Clinical Practice.New York:Springer International Publishing,2017:1-21.

6Huang S,Susztak K.Epithelial plasticity versus EMT in kidney fibrosis. Trends Mol Med,2016,22(1):4-6.

7趙宗江,豆小妮,張新雪.糖尿病腎病“腎痿”假說探討.中醫(yī)雜志, 2011,52(S1):8-10.

8馮麗園.糖腎寧膠囊對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟保護(hù)作用及其對(duì)TGF-β1/ Smad7信號(hào)通路影響的實(shí)驗(yàn)研究.北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文,2010:27-67.

9趙宗江.糖腎寧對(duì)DN大鼠TGF-β1-Smad2/3-ILK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響的研究.[C]中西醫(yī)結(jié)合實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)第十二次全國中西醫(yī)結(jié)合實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)暨第七次湖南省中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)科專業(yè)委員會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集，中西醫(yī)結(jié)合實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì):2015: 31-32.

10 Gross J L,De Azevedo M J,Silveiro S P,et al.Diabetic nephropathy: diagnosis,prevention,and treatment.Diabetes care,2005,28(1):164-176.

11 Huang L,Khardori R.Pathogenesis of Diabetic Nephropathy.Managing Diabetic Nephropathies in Clinical Practice.New York:Springer International Publishing,2017:23-45.

Effect of Compound Tangshenning on Proliferation and RhoA/ROCK Signaling Pathway of High Glucose-induced Epithelial Cells of Renal Tubules

Wang Ting,Zhao Zongjiang,Zhang Xinxue,Miao Yonghui,Yang Guannan
(College of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029)

Objective:To study the effect of the prescription Tangshenning on the proliferation of the high glucoseinduced cells of near-end kidney tubules.Method:To prepare durg-contained serum from mice to enter into in vitor reaction system，the cells were randomly divided into 4 groups:the normal group,the model group,the,the irbesartan group,the tangshenning group and then detect the effects of all serum sections on the proliferation of high glucose-induced epithelial cells of kidney tubules by the MTT colorimetric method,and the expression of RhoA,ROCK1,E-cadherin and α-SMA in each group were detected by Western blotting.Result:The high glucose group of renal tubular epithelial cells form from the flat irregular polygon into long fusiform;After adding the drug-containing serum corresponding intervention into the cells into a flat in irregular polygon.The high glucose group of renal tubular epithelial cells show obvious proliferation condition,In the condition of 24 h,48 h,The high glucose group proliferation is better than the normal group(P＜0.01),in 60 h,The high glucose group proliferation is better than the normal group(P＜0.05);In 24 h,compared with the irbesartan,Tangshenning has better effect of inhibiting the cell proliferation(P＜0.05); In 48 h,Tangshenning has the better effect than irbesartan and Y27632(P＜0.01);In 60 h,Tangshenning has the better effect than irbesartan and Y27632(P＜0.05);Western blotting:Western blotting analysis showed that compared with the normal group,the expression of RhoA protein in high glucose group and Y27632 decreased(P＜0.01);The high glucose group and Tangshenning have significant difference(P＜0.01);Y27632 and Tangshenning have difference(P＜0.05). compared with the normal group,the expression of ROCK1 protein in high glucose group decreased(P＜0.01);The high glucose group,Tangshenning,the irbesartan and Y27632 have difference(P＜0.05).Compared with the normal group,the expression of α-SMA protein in high glucose group decreased(P＜0.01);The high glucose group,Tangshenning,the irbesartan and Y27632 have difference(P＜0.05).Compared with the normal group,the expression of E-Cadherin protein in high glucose group increased(P＜0.05).Y27632 and Tangshenning have difference(P＜0.05).The high glucose group, Tangshenning,the irbesartan and Y27632 have difference(P＜0.05).Conclusion:The prescription Tangshenning is able to inhibit the proliferation of high glucose-induced epithelial cells of kidney tubules and and can reverse renal tubularepithelial cell transdifferentiation via regulating RhoA/ROCK signaling pathway,and restrain renal interstitial fibrosis, thereby delaying the pathogenesis of diabetic kidney disease.

Tangshenning;consumptive kidney disease;Renal Tubular Epithelial Cell Line;KKAy Mouse;Cell Proliferation;MTT;EMT;RhoA/ROCK signaling pathway

10.11842/wst.2017.06.028

000

A

2017-04-28

修回日期：2017-06-18

＊國家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81373831）：基于“腎痿”組方的糖腎平干預(yù)糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的分子機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：趙宗江。

＊＊趙宗江，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病腎病的機(jī)制研究。