生脈注射液對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血Beagle犬生理指標(biāo)及血清C-反應(yīng)蛋白、NO水平的影響＊

甘雨，包玉龍，張宏，王菲，范英蘭，喬敏，劉小虎，夏素霞，李國(guó)信

生脈注射液對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血Beagle犬生理指標(biāo)及血清C-反應(yīng)蛋白、NO水平的影響＊

甘雨，包玉龍，張宏，王菲，范英蘭，喬敏，劉小虎，夏素霞，李國(guó)信＊＊

（遼寧省中醫(yī)藥研究院沈陽(yáng)110034）

目的：探討生脈注射液對(duì)心肌缺血Beagle犬血壓、心率、心電圖及血清C-反應(yīng)蛋白、NO水平的影響。方法：30只Beagle犬隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、生脈注射液小劑量組(0.80 mL·kg-1）、生脈注射液大劑量組（3.20 mL·kg-1）和單硝酸異山梨酯組（0.07 mL·kg-1）。采用皮下注射鹽酸異丙腎上腺素制備心肌缺血模型，同時(shí)給予藥物治療。記錄給藥后1、6、12、24 h，犬血壓、心率和心電圖變化，并檢測(cè)血清C-反應(yīng)蛋白和NO含量。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，模型組Beagle犬平均動(dòng)脈壓（MBP）明顯降低（P＜0.01），心率（HR）明顯加快（P＜0.01或P＜0.05），心電圖ΔST值明顯增大（P＜0.01），生脈注射液能改善上述癥狀，但作用趨緩。生脈注射液對(duì)血清C-反應(yīng)蛋白含量降低和NO含量升高有明顯的對(duì)抗作用，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)論：生脈注射液能改善心肌缺血Beagle犬生理指標(biāo)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)C-反應(yīng)蛋白代謝，抑制NO分泌有關(guān)。

生脈注射液心肌缺血生理指標(biāo)C-反應(yīng)蛋白一氧化氮

生脈注射液源自中國(guó)古代經(jīng)典名方“生脈散”，是一種由紅參、麥冬和五味子經(jīng)現(xiàn)代工藝制成的純中藥制劑，具有穩(wěn)定的強(qiáng)心、升壓效應(yīng)，臨床廣泛用于心血管疾病的治療，尤其是對(duì)心肌缺血誘發(fā)的冠心病、心律失常、心力衰竭、體克等疾病療效顯著，但對(duì)生脈注射液改善心肌缺血?jiǎng)游锷碇笜?biāo)研究較少，且存在一定爭(zhēng)議[1-2]。另外，有關(guān)生脈注射液抗心肌缺血作用機(jī)制研究更是鮮有報(bào)道。為了更好地發(fā)揮名方的治療作用，本研究采用Beagle犬慢性心肌缺血模型，以臨床上治療心肌缺血療效得到普遍認(rèn)可的單硝酸異山梨酯作為陽(yáng)性對(duì)照藥，研究生脈注射液對(duì)心肌缺血?jiǎng)游锷碇笜?biāo)的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年Beagle犬30只，雌雄各半，月齡12～24月，體質(zhì)量（10.0±2.0）kg，自北京沙河通利試驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)[許可證號(hào)：SCXK（京）2013-0007]購(gòu)入，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（遼）2012-0010]適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后使用。

1.2 藥品與試劑

生脈注射液：由四川省宜賓五糧液集團(tuán)宜賓制藥有限責(zé)任公司提供，規(guī)格：20 mL/支，批號(hào)：13060112；單硝酸異山梨酯注射液（欣康）：由魯南貝特制藥有限公司提供，規(guī)格：5 mL∶25 mg/支，批號(hào)：1412100610；鹽酸異丙腎上腺素注射液：由上海禾豐制藥有限公司提供，規(guī)格：2 mL∶1 mg/支，批號(hào)：131001；C-反應(yīng)蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供，批號(hào)：201508；NO酶聯(lián)免疫試劑盒由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供，批號(hào)：201507。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

BP-2010E型智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)（北京軟隆科技有限責(zé)任公司）；SPECTRA MAX 190型酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；SP2006心電圖分析系統(tǒng)（北京軟隆科技有限責(zé)任公司）；SIGMA 3-18k型低溫離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司）；SHA-B型37度孵育箱（金壇市精達(dá)儀器制造廠）。

1.4 方法

1.4.1 分組與模型制備

取健康成年Beagle犬30只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組6只，即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、生脈注射液小劑量組（0.80 mL·kg-1）、生脈注射液大劑量組（3.20 mL·kg-1）和單硝酸異山梨酯組（0.07 mL·kg-1）。除空白對(duì)照組外，其余各組Beagle犬均皮下多點(diǎn)注射鹽酸異丙腎上腺素1.1 mg·kg-1，共注射3次，每次間隔12 h?？瞻讓?duì)照組皮下多點(diǎn)注射等容量生理鹽水。

1.4.2 給藥

于末次注射鹽酸異丙腎上腺素后，開(kāi)始股靜脈滴注各治療藥物，生脈注射液小劑量組靜滴生脈注射液0.80 mL·kg-1，生脈注射液大劑量組靜滴生脈注射液3.20 mL·kg-1，單硝酸異山梨酯組靜滴單硝酸異山梨酯0.07 mL·kg-1。各治療藥物在使用前均用5%葡萄糖注射液稀釋?zhuān)o藥體積為10 mL·kg-1，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組靜滴等容量的5%葡萄糖注射液，靜滴時(shí)間均控制在90 min左右。

1.4.3 檢測(cè)指標(biāo)

于造模前及造模后1、6、12、24 h，采集Beagle犬血壓、心率和Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以給藥前后ST段變化（ΔST）情況作為心肌缺血嚴(yán)重程度考察指標(biāo)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取基線平穩(wěn)的連續(xù)3個(gè)波形取平均值，并于造模后1、6、12、24 h采集靜脈血4 mL，3 500 rpm離心10 min，分離血清，置于-70℃冰箱保存待測(cè)。C-反應(yīng)蛋白和NO均采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

心電圖數(shù)據(jù)采用softron ECG processor 2006軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用DAS 2.1.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血壓變化

由表1可知，動(dòng)物注射鹽酸異丙腎上腺素造模后，平均動(dòng)脈壓（MBP）明顯降低，模型組各時(shí)間點(diǎn)與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。靜滴生脈注射液后，血壓逐漸恢復(fù)，至24 h時(shí)，小劑量組升高35.58 mmHg，大劑量組升高31.16 mmHg，均高于模型組自然恢復(fù)的19.00 mmHg，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 心率變化

由表2可知，動(dòng)物注射鹽酸異丙腎上腺素造模后，心率（HR）明顯加快，在模型組1 h、6 h時(shí)與空白對(duì)照組進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），至12 h時(shí)心率基本恢復(fù)正常。生脈注射液大劑量組心率變化趨于平穩(wěn)，在1 h時(shí)間點(diǎn)的心率明顯低于模型組（P＜0.05）。

2.3 心電圖改變

由表3、圖1可知，動(dòng)物注射鹽酸異丙腎上腺素造模后，Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段明顯下移，T波出現(xiàn)倒置，模型組ΔST值在1、6、12 h與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明動(dòng)物出現(xiàn)心肌缺血損傷。靜滴生脈注射液后，ΔST逐漸減小，但與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 生脈注射液對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血Beagle犬MBP的影響（mmHg，xˉ±s，n=6）

表2 生脈注射液對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血Beagle犬HR的影響（bpm，xˉ±s，n=6）

表3 生脈注射液對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血Beagle犬心電ΔST的影響（mV，xˉ±s，n=6）

2.4 血清C-反應(yīng)蛋白含量變化

由表4可知，動(dòng)物注射鹽酸異丙腎上腺素造模后，血清C-反應(yīng)蛋白含量明顯降低，模型組各時(shí)間點(diǎn)與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。靜滴生脈注射液后，血清C-反應(yīng)蛋白含量明顯升高，各劑量不同時(shí)間點(diǎn)均明顯高于模型組（P＜0.01或P＜0.05）。

2.5 血清NO含量變化

由表5可知，動(dòng)物注射鹽酸異丙腎上腺素造模后，血清NO含量明顯升高，模型組在1 h、24 h與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。靜滴生脈注射液后，血清NO含量明顯降低，各劑量不同時(shí)間點(diǎn)均明顯低于模型組（P＜0.01）。

3 討論

圖1 生脈注射液對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血Beagle犬心電圖的影響

心肌缺血是冠狀動(dòng)脈血液供應(yīng)減少或中斷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺氧，能量代謝障礙，從而無(wú)法正常維持心臟功能的一種病理狀態(tài)[3]。長(zhǎng)期的心肌缺血可誘發(fā)心絞痛或心肌梗塞，甚至發(fā)生毫無(wú)先兆的猝死，預(yù)后十分危急。為了將心肌缺血的治療提高到一個(gè)新水平，研發(fā)出更多新藥，揭示更多藥物的作用機(jī)制，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)必不可少，因此制備穩(wěn)定可靠，與人類(lèi)心肌缺血病因病機(jī)和臨床癥狀相似的動(dòng)物模型至關(guān)重要[4]。以往多采用開(kāi)胸結(jié)扎動(dòng)物冠狀動(dòng)脈分支造成心肌缺血[5,6]，但由于開(kāi)胸破壞了胸腔的完整性，對(duì)動(dòng)物創(chuàng)傷較大，同時(shí)動(dòng)物需要麻醉，監(jiān)測(cè)指標(biāo)都是在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行，所得數(shù)據(jù)缺乏臨床相似性。因此，制備清醒、無(wú)創(chuàng)，能模擬人類(lèi)心肌缺血發(fā)生發(fā)展過(guò)程的動(dòng)物模型有重要意義。本研究采用異丙腎上腺素小劑量多次皮下注射制備Beagle犬慢性心肌缺血模型，并在清醒、無(wú)創(chuàng)條件下監(jiān)測(cè)生理指標(biāo)，避免了動(dòng)物應(yīng)激對(duì)其生理參數(shù)造成的影響，為藥物研究提供了更真實(shí)、可靠數(shù)據(jù)。

表4 生脈注射液對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血Beagle犬血清C-反應(yīng)蛋白含量的影響（mg·L-1，xˉ±s，n=6）

表5 生脈注射液對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血Beagle犬血清NO含量的影響（μmol·L-1，xˉ±s，n=6）

生脈注射液是中醫(yī)“益氣復(fù)脈”古方—生脈散經(jīng)現(xiàn)代工藝制成的純中藥制劑，臨床廣泛用于冠心病、休克等疾病的治療[7]。但有關(guān)該藥物的臨床藥理和治療機(jī)制研究還很匱乏，并存在一定爭(zhēng)議。有研究認(rèn)為生脈注射液靜注對(duì)麻醉犬正常血壓有明顯的降壓作用，對(duì)心率無(wú)明顯影響[8]，這與其“升壓”、“強(qiáng)心”效應(yīng)相駁。本研究采用慢性心肌缺血模型，造模后Beagle犬MBP明顯降低（P＜0.01），HR明顯加快（P＜0.05）。靜滴生脈注射液后，血壓逐漸恢復(fù)，至24 h時(shí)，小劑量組升高35.58 mmHg，大劑量組升高31.16 mmHg，均高于模型組自然恢復(fù)的19.00 mmHg；心率變化更趨于平穩(wěn)，在1 h時(shí)間點(diǎn)的心率明顯低于模型組（P＜0.05）。提示生脈注射液對(duì)心肌缺血導(dǎo)致的低血壓和心率加快有抑制作用，可能對(duì)危重患者的救治有益。

心電圖ST段改變是心肌缺血損傷程度和范圍的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[9,10]。本研究中，動(dòng)物注射鹽酸異丙腎上腺素造模后，Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段明顯下移，T波出現(xiàn)倒置，模型組ΔST值在1 h、6 h、12 h與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明動(dòng)物出現(xiàn)心肌缺血損傷。靜滴生脈注射液后，ΔST逐漸減小，但與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這可能與單次給藥，中藥療效緩慢有關(guān)。

C-反應(yīng)蛋白是一種反映炎癥、損傷的非抗體性標(biāo)志物，與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂和促發(fā)局部血栓形成密切相關(guān)，可以作為心血管不良事件的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[11,12]。本研究中，動(dòng)物注射鹽酸異丙腎上腺素造模后，血清C-反應(yīng)蛋白含量明顯降低，模型組各時(shí)間點(diǎn)與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。靜滴生脈注射液后，血清C-反應(yīng)蛋白含量明顯升高，各劑量不同時(shí)間點(diǎn)均明顯高于模型組（P＜0.01或P＜0.05）。提示生脈注射液可能具有抗心肌缺血引起的炎癥反應(yīng)的作用。

NO是一種內(nèi)皮細(xì)胞分泌的超強(qiáng)舒血管性活性物質(zhì)，其恒定釋放對(duì)保持血管舒張狀態(tài)，抑制血小板聚集，調(diào)節(jié)冠脈張力等有重要作用[13-15]。本研究觀察到動(dòng)物注射鹽酸異丙腎上腺素造模后，血清NO含量明顯升高，將1 h、24 h時(shí)模型組與空白對(duì)照組進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），這可能是導(dǎo)致動(dòng)物血壓明顯下降的原因，也表明生脈注射液可能是通過(guò)抑制NO分泌，調(diào)節(jié)血管張力，進(jìn)而起到升壓作用。

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Effects of Shengmai Injection on Physiological Indices,C-reactive Protein and NO Levels in Experimental Beagle Dogs with Myocardial Ischemia

Gan Yu,Bao Yulong,Zhang Hong,Wang Fei,Fan Yinglan,Qiao Min,Liu Xiaohu,Xia Suxia,Li Guoxin
(Liaoning Institute of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110034,China)

This study was aimed to explore the effects of Shengmai(SM)injection on blood pressure(BP),heart rate(HR), electrocardiogram(ECG),and serum C-reactive protein(CRP)and NO levelin Beagle dogs with myocardial ischemia (MI).A total of 30 Beagle dogs were divided into 5 groups,which were the blank control group,model control group,SM injection low-dose group(0.80 mL·kg-1),SM injection high-dose group(3.20 mL·kg-1)and isosorbidemononitrate group (0.07 mL·kg-1).The MI model was established by the subcutaneous injection of isoprenaline hydrochloride,and the drug treatments were given at the same time.At 1 h,6 h,12 h,24 h after administration,changes of BP,HR and ECG were recorded;serum CRP and NO content were detected.The results showed that compared with the blank control group,the mean arterial pressure(MBP)was significantly decreased(P＜0.01),HR was significantly increased(P＜0.01,or P＜0.05), the ECGΔST value was significantly increased(P＜0.01)in the model group.SM injection could improve symptoms mentioned above,but the effectswereslow.SM injection had a significant antagonistic effect on the decreasing of CRPcontent and the increasing of NO content,compared with the model group.The difference was statistically significant(P＜0.01,or P＜0.05).It was concluded that SM injection could improve the physiological indices of Beagle dogs with MI, which might be related to the regulation of CRP and the inhibition of NO secretion.

Shengmai injection,myocardial ischemia,physiological index,CRP,NO

10.11842/wst.2017.05.000

R965.1

A

（責(zé)任編輯：張娜娜，責(zé)任譯審：王晶）

2017-05-12

修回日期：2017-06-30

＊科學(xué)技術(shù)部國(guó)家“十二五”中藥新藥臨床評(píng)價(jià)研究技術(shù)平臺(tái)建設(shè)（2012ZX09303-017-001）：中藥新藥Ⅰ期臨床關(guān)鍵技術(shù)和方法的研究，負(fù)責(zé)人：李國(guó)信。

＊＊通訊作者：李國(guó)信，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：臨床藥理學(xué)。