苗藥鼻寧噴霧劑治療過敏性鼻炎藥效物質(zhì)研究＊

熊永愛，李文美，呂佳佳，陳莉，歐水平，王森＊＊

苗藥鼻寧噴霧劑治療過敏性鼻炎藥效物質(zhì)研究＊

熊永愛1，李文美1，呂佳佳1，陳莉1，歐水平2，王森1＊＊

（1.遵義醫(yī)學(xué)院遵義563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院遵義563003）

目的：研究苗藥鼻寧噴霧劑治療過敏性鼻炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升奠定基礎(chǔ)。方法：稱取處方量的一枝黃花飲片、鵝不食草飲片加水浸泡，進(jìn)行回流提取，提取液分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，所得各部位分別干燥后制備成實(shí)驗(yàn)用樣品溶液。選取健康成年SD大鼠60只，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為正常組（Normal）、模型組（Model）、石油醚組（SYM）、乙酸乙酯組（YSYZ）、正丁醇組（ZDC）、水部位組（Water）。除正常組大鼠外其余組大鼠分別用20%二甲苯橄欖油溶液進(jìn)行造模，造模成功后各給藥組滴鼻給藥，正常組和模型組滴予生理鹽水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束采集各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清，ELISA法測(cè)定大鼠血清中IgE、IL-4和HT的含量，并對(duì)鼻粘膜組織病理形態(tài)學(xué)進(jìn)行分析。結(jié)果：與正常組對(duì)照比較，模型組大鼠血清IgE、IL-4和HT含量均有顯著增加（P＜0.05）；與模型組對(duì)照比較，水部位組大鼠IgE、IL-4和HT含量均有顯著降低（P＜0.05），其余各組IgE、IL-4和HT的含量表現(xiàn)出降低趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鼻黏膜組織病理檢查結(jié)果顯示，與正常組對(duì)照比較，模型組大鼠鼻粘膜組織病理損傷指數(shù)極顯著增大（P＜0.01）；與模型組比較，正丁醇部位組與水部位組大鼠鼻粘膜組織病理損傷指數(shù)顯著減少（P＜0.05），其余組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：鼻寧噴霧劑治療過敏性鼻炎時(shí)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)主要是水部位組分。

鼻寧噴霧劑過敏性鼻炎藥效物質(zhì)水部位

苗藥鼻寧噴霧劑在臨床上治療過敏性鼻炎，療效確切。該處方主要是由一枝黃花與鵝不食草精制而成。鵝不食草別名地胡菽，又名通天竅，味辛、性溫，屬傳統(tǒng)解表類中藥，其化學(xué)成分主要為揮發(fā)油、甾醇類、黃酮類、三萜類化合物等[1]。鵝不食草的藥理作用十分廣泛，具有抗炎、抗癌、抗過敏、抗腫瘤、抗誘變等療效。近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者運(yùn)用鵝不食草治療過敏性鼻炎上取得了大量的經(jīng)驗(yàn)，例如有學(xué)者研究鵝不食草軟膏、浸液可治療過敏性鼻炎[2]。其黃酮類、揮發(fā)油、偽愈創(chuàng)木內(nèi)酯類成分所具有的抗過敏、抗炎作用是其治療鼻炎的藥理學(xué)基礎(chǔ)，但目前其作用機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)仍未明確。

一枝黃花主要含有黃酮、皂苷、苯丙酸、炔屬化合物等[3]。一枝黃花的資源豐富，臨床應(yīng)用廣泛。具有解毒消腫、疏風(fēng)清熱的功效，主要用于治療風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、毒蟲叮咬、跌打損傷等[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，一枝黃花具有抗菌、祛痰平喘以及利尿的作用。近年來，國內(nèi)開始重視對(duì)一枝黃花藥理活性的研究，主要致力于開發(fā)出新產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)其臨床應(yīng)用價(jià)值。

過敏性鼻炎（Allergic rhinitis，AR），是臨床常見的鼻科病。該病為I型變態(tài)反應(yīng)性疾病，主要病癥包括鼻塞、水樣鼻涕、鼻黏膜腫脹等。長(zhǎng)久的鼻炎癥狀還會(huì)引起鼻腔嗅覺減退、引起呼吸障礙，血氧濃度降低等癥狀，進(jìn)一步影響機(jī)體的其他組織器官的功能與代謝，引起其他的并發(fā)癥。其發(fā)病機(jī)制主要是：變應(yīng)原進(jìn)入氣管和鼻腔后，刺激T淋巴細(xì)胞，使其分化為Th1、Th2類淋巴細(xì)胞，其中Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5等細(xì)胞因子而輔助B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，再由漿細(xì)胞分泌合成IgE抗體，IgE抗體與肥大細(xì)胞結(jié)合，當(dāng)機(jī)體再次接觸變應(yīng)原后，肥大細(xì)胞就釋放組胺，組胺會(huì)引起過敏反應(yīng)[6]。

處方是中醫(yī)藥臨床辨證施治的智慧結(jié)晶，同時(shí)也是中成藥二次開發(fā)的基礎(chǔ)。明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理作用機(jī)制，是中藥現(xiàn)代化的重要保障。因此，我們有必要對(duì)鼻寧噴霧劑治療過敏性鼻炎的藥效物質(zhì)進(jìn)行篩選，以便明晰其藥效物質(zhì)，從而為患者提供更有效的藥物治療基礎(chǔ)，改善患者生活質(zhì)量。同時(shí)，也為其質(zhì)控水平的提升和臨床適應(yīng)癥的拓展奠定基礎(chǔ)，增強(qiáng)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，滿足不斷發(fā)展的臨床用藥需求以及產(chǎn)品可持續(xù)化發(fā)展的要求。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試劑

一支黃花飲片（貴州百花藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：160509），鵝不食草飲片（貴州百花藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)：160721），大鼠IgE（批號(hào)：EK-R31200）、IL-4（批號(hào)：EK-R30199）、HT（批號(hào)：EK-R30185）及ELISA試劑盒均購自欣博盛生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠60只（許可證號(hào)：SCXK（渝）2010-0005），購自第三軍醫(yī)大學(xué)。

2 方法與步驟

2.1 藥材提取液的制備

依照鼻寧噴霧劑的生產(chǎn)工藝，稱取處方量一枝黃花飲片250 g，鵝不食草飲片60 g，加入處方兩倍量的蒸餾水浸泡2 h，用蒸餾裝置進(jìn)行回流提取，直到收集處方3倍量的芳香水為止，藥渣加水煎煮3次，第一次加入處方6倍量水煎煮2 h，第二次加入處方5倍量水煎煮1.5 h，第三次加入處方4倍量水煎煮1.5 h。合并煎液并過濾，濃縮至相對(duì)密度1.15（60℃），加入乙醇使含醇量達(dá)70%并攪勻，冷藏24 h，取上清液并回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度為1.20（60℃）的浸膏。浸膏先后用石油醚，乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別收集各有機(jī)層和水層溶劑，干燥。

2.2 樣品溶液的配制

按照鼻寧噴霧劑的臨床用藥劑量計(jì)算出以上樣品對(duì)于大鼠的給藥量，按配比配制成一定濃度的溶液。稱取石油醚部位組分溶于70%的聚乙二醇水溶液中配制成濃度為0.12 mg·mL-1的溶液，乙酸乙酯萃取的干燥物溶于聚乙二醇配制成濃度為0.6 mg·mL-1的溶液、同法配制正丁醇部位組分為0.6 mg·mL-1的水溶液、水部位組分配制成8.25 mg·mL-1的水溶液，以上樣品溶液分別低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 動(dòng)物分組、造模及給藥

將60只大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。分別為石油醚組（SYM）、乙酸乙酯組（YSYZ）、正丁醇組（ZDC）、水部位組（Water）、模型組（Model）和正常組（Nor?mal）。除正常組外其余每組大鼠分別滴鼻給20%二甲苯橄欖油溶液20μL，每側(cè)鼻孔10μL，1次/天，連續(xù)7天，7天后改為隔日滴鼻一次維持致敏狀態(tài)，直到給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)束。而正常組不作任何處理[8]。將上述制備的樣品溶液按相應(yīng)的組分別對(duì)大鼠進(jìn)行給藥，給藥方法為1次/天，每側(cè)鼻孔10μL，連續(xù)用藥15天[9]。正常組與模型組給予同劑量的生理鹽水。

2.4 血清與組織收集與處理

于最后一次給藥后2 h，每組大鼠進(jìn)行股動(dòng)脈取血，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，置-20℃保存待分析。大鼠斷頸處死后剖取兩側(cè)的鼻粘膜組織，去皮后浸泡在甲醛溶液中，置-20℃保存待測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 大鼠血清中IgE的含量測(cè)定

按照免疫酶聯(lián)法（ELISA）操作方法對(duì)大鼠血清標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定[10]，計(jì)算出IgE含量。如圖1所示，與正常組相比，模型組大鼠血清IgE含量顯著增多（P＜0.05）；與模型組對(duì)照比較，水部位組大鼠血清IgE含量顯著降低（P＜0.05），其余各組大鼠血清IgE含量?jī)H有降低趨勢(shì)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該結(jié)果表明水部位組分可降低過敏性鼻炎大鼠血清中IgE含量。

3.2 大鼠血清中IL-4的含量測(cè)定

按照免疫酶聯(lián)法（ELISA）操作方法對(duì)大鼠血清標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定[11]，進(jìn)而得出IL-4含量。如圖2，與正常組相比，模型組大鼠血清IL-4的含量顯著增加（P＜0.05），其余組僅有增多趨勢(shì)；與模型組對(duì)照比較，水部位組大鼠血清IL-4含量顯著降低（P＜0.05），其余各組大鼠血清IL-4含量?jī)H有降低趨勢(shì)。該結(jié)果顯示，水部位組分具有較好的降低過敏性鼻炎大鼠血清中IL-4含量的作用。

圖1 大鼠血清中IgE含量（n=10）

圖2 大鼠血清中IL-4的含量

圖3 大鼠血清中HT的含量

3.3 大鼠血清中HT的含量

圖4 大鼠鼻黏膜組織的病理切片

嚴(yán)格按照免疫酶聯(lián)法（ELISA）操作方法對(duì)大鼠血清HT進(jìn)行測(cè)定[12]。結(jié)果見圖3，與正常組相比，模型組大鼠血清HT的含量顯著增多（P＜0.05），其余組僅有增多趨勢(shì)；與模型組對(duì)照比較，水部位組大鼠血清HT含量顯著降低（P＜0.05），其余各組大鼠血清HT含量?jī)H有降低趨勢(shì)，該結(jié)果顯示，水部位組分具有較好的降低過敏性鼻炎大鼠血清中HT含量的作用。

3.4 大鼠鼻黏膜組織的病理檢查

圖4結(jié)果顯示模型組鼻粘膜組織粘膜上皮和固有層排列、分界清晰，粘膜層和粘膜下層分界不清，粘膜層顯著增厚，粘膜上皮細(xì)胞脫落，或潰爛，粘膜層和粘膜下層大量的炎細(xì)胞浸潤，其中包括較多的淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。石油醚部位組大鼠鼻粘膜上皮細(xì)胞脫落仍然嚴(yán)重，粘膜層和粘膜下層炎細(xì)胞較多；乙酸乙酯部位組大鼠鼻粘膜上皮細(xì)胞潰爛、脫落較石油醚組有所減輕，粘膜層和粘膜下層炎細(xì)胞開始減少；正丁醇部位組大鼠鼻粘膜上皮細(xì)胞潰爛、脫落較石油醚組開始明顯減輕，粘膜層和粘膜下層炎細(xì)胞明顯減少，炎性反應(yīng)明顯減輕。而水部位組大鼠鼻粘膜組織粘膜上皮和固有層排列、分界清晰，纖毛上皮排列整齊，偶見有個(gè)別組織內(nèi)可見炎細(xì)胞浸潤，恢復(fù)良好。由表1可知，與正常組對(duì)照比較，模型組大鼠鼻粘膜組織病理損傷指數(shù)極顯著增大（P＜0.01）；與模型組比較，水部位組大鼠鼻粘膜組織病理損傷指數(shù)顯著減少（P＜0.05），其余組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

過敏性鼻炎在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中屬“鼻鼽”范疇。我國歷代醫(yī)家對(duì)于鼻鼽均有闡述，在病因病機(jī)上多認(rèn)為其因臟腑虧虛，風(fēng)寒外襲所致。對(duì)其發(fā)病機(jī)制的闡釋為：肺氣虛弱，衛(wèi)表不固，風(fēng)寒乘虛而入，犯及鼻竅，邪正相搏，肺氣不得通調(diào)，津水停聚，鼻竅壅塞，遂致噴嚏、流清涕。臨床以鼻癢、打噴嚏、流清涕、鼻塞為主要癥狀[13]。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為過敏性鼻炎是由IgE介導(dǎo)通過釋放組織胺或其它化學(xué)活性物質(zhì)誘發(fā)的鼻黏膜I型變態(tài)反應(yīng)，屬于鼻腔粘膜的變應(yīng)性疾病。變應(yīng)原經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞與肥大細(xì)胞表面的IgE抗體結(jié)合，肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放炎性反應(yīng)介質(zhì)如組胺、激肽、白細(xì)胞三烯、前列腺素、嗜酸細(xì)胞趨化因子、血小板活化因子、五羥色胺等生物活性介質(zhì)，從而導(dǎo)致患者出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)癥狀[14]。

過敏性鼻炎是主要由IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性炎癥。多種因素（主要是IL-4/IL-13）參與IgE合成的調(diào)細(xì)胞表面高親和力受體結(jié)合可誘發(fā)釋放多種炎性介質(zhì)，在過敏性鼻炎中起重要作用[15]。體內(nèi)IgE水平的增節(jié)，IgE與其受體（FcεR-Ⅰ、FcεR-Ⅱ）也存在復(fù)雜的相互作用。IgE與肥大細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞及嗜酸粒高往往可以反映過敏性鼻炎特應(yīng)癥（個(gè)體對(duì)環(huán)境中常見的過敏原具有產(chǎn)生IgE抗體的遺傳易感性。IgE水平的高低和特應(yīng)癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[16]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，鼻靈噴霧劑治療過敏性鼻炎的物質(zhì)基礎(chǔ)在于水部位，即水溶性有效組分。其機(jī)制可能是通過降低AR大鼠血清的IgE、IL-4和HT濃度，降低鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，抑制炎性介質(zhì)的釋放，減少炎癥細(xì)胞在鼻黏膜的聚集，從而減輕鼻道的變態(tài)反應(yīng)。課題組下一步將對(duì)該部位有效組分進(jìn)行指紋圖譜分析和有效成分指認(rèn)，為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供依據(jù)。

1林遠(yuǎn)燦,高明.鵝不食草的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,35(2):303-304.

2張舒娜,張亞玉.鵝不食草的臨床應(yīng)用及藥理研究進(jìn)展.吉林農(nóng)業(yè), 2015,5(19):76-77.

3吳娜,梅艷等.入侵植物加拿大一枝黃花的化學(xué)成分及其生物活性綜述.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(5):5-7.

4溫強(qiáng)蔚,祡川,崔小兵,等.加拿大一枝黃花的研究進(jìn)展.中國名族民間醫(yī)藥,2012,12(2):51-53.

5李曉嵐,裘名宜,劉素鵬,等.一枝黃花的化學(xué)成分、藥理活性及臨床應(yīng)用.時(shí)針國醫(yī)國藥,2008,19(1):93-94.

6王敏,張偉.過敏性鼻炎及過敏與原免疫治療機(jī)制的研究進(jìn)展.中國免疫學(xué)雜志,2010,26(12):1137-1140.

7成洪淑,余美榮.鵝不食草提層成分對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2生長(zhǎng)抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2011,29(7):2-3.

8佟雷,劉金麗,高月娟,等.玉屏風(fēng)顆粒對(duì)過敏性鼻炎大鼠免疫因子的影響.中國中藥雜志.2016,41(4):728-730.

9袁穎,郭忻,潘穎宜.鼻炎噴霧劑對(duì)變應(yīng)性鼻炎模型大鼠的藥效學(xué)研究.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2006,22(1):61-63.

10閆津津,馮珍如,鄭新芝,等.變應(yīng)性鼻炎患者血清抗交叉反應(yīng)性糖類決定簇IgE水平與血清IgE水平和皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)的關(guān)聯(lián)性分析.中國全科醫(yī)學(xué),2016,7(21):2499-2504.

11童鐵鋼,白宇.檢測(cè)馬白細(xì)胞介素-18雙抗夾心法ELLSA方法的建立.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2008,14(4):364-368.

12楊軍,鄧秋,周蕓,等.實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性鼻炎中鼻黏膜組胺的測(cè)定.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,27(1):110-111.

13胡瑤,陳旭青,嚴(yán)道南,等.基于“三因制宜”探析過敏性鼻炎治未病理念.中華中醫(yī)藥雜志,2017,6(1):77-79.

14王敏,張偉,張羅,等.過敏性鼻炎及過敏原免疫治療機(jī)制的研究進(jìn)展.中國免疫學(xué)雜志,2010,26(12):1137-1140.

15 Schroeder J T,Bieneman A P,Xiao H,et al.TLR9-and Fcepsi lonRI-me?diated responses oppose one another in plasmacytoid dendritic cells by down-regulating receptor expression.J Immunol,2005,175(19):5724-5731.

16 Schroeder J T,Chichester K L,Bieneman A P,et al.Toll-like receptor 9 suppression in plasmacytoid dendrit ic cells after IgE-dependent acti?vation is mediated by autocrine TNF-α.J Allergy Clin Immunol,2008, 121(12):486-491.

Study on Material Basis of Miao Medicine Bi-Ning Spray inAllergic Rhinitis Treatment

Xiong Yong’ai1,Li Wenmei1,Lv Jiajia1,Chen Li1,Ou Shuiping2,Wang Sen1
(1.Zunyi Medical University,Zunyi 563000,China; 2.Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi 563003,China)

This paper was aimed to study the material basis for the efficacy of Miao medicine Bi-Ning spray in the treatment of allergic rhinitis,and to lay a foundation for improvement of its quality standard.Solidago and Centipeda minima were weighed according to the prescription and then soaked in water.Reflux extraction was conducted to the liquid.Petroleum ether,ethyl acetate,and n-butanol were used in the extraction,respectively.Each

composition was dried and made into sample solution for the experiment.A total of 60 healthy adult SD rats,with the ratio of half male and half female,were selected and randomly divided into 6 groups according to the weight with 10 rats in each group. There were the normal group,the model group,the petroleum ether(SYM)group,the ethyl acetate(YSYZ)group,the nbutyl alcohol(ZDC)group and the water group.The 20%xylene olive oil solution was used in the model establishment of rats from different groups except the normal group.Intranasal administration of drug was given to different dosage group after the models were successfully established.Normal saline was given to the normal group and the model group.Serum of each experimental rat was collected at the end of the experiment.The contents of IgE,IL-4 and HT in serum were detected by ELISA.The pathological morphology of the nasal mucosa was analyzed.The results showed that compared with the normal group,the contents of IgE,IL-4 and HT in serum of the model group increased significantly(P＜0.05). Compared to the model group,the contents of IgE,IL-4 and HT in serum of the water group decreased significantly(P＜0.05).Contents of IgE,IL-4 and HT in other groups presented decreasing tendency.However,there was no statistical significance.The pathological morphology of the nasal mucosa results showed that compared with the normal group,the cell inflammatory response of the nasal mucosa tissues significantly increased in the model group(P＜0.01).Compared with the model group,the cell inflammatory response of nasal mucosa tissues significantly decreased in the ZDC group and water group(P＜0.05).There was no statistical significance in other groups.It was concluded that components in water part were the main material basis for efficacy of Bi-Ning spray in the treatment of allergic rhinitis.

Bi-Ning spray,allergic rhinitis,medicinal substances,water part

10.11842/wst.2017.05.029

R96

A

（責(zé)任編輯：陳寧，責(zé)任譯審：王晶）

2017-04-19

修回日期：2017-05-18

＊貴州省科技廳貴州省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合SY字[2015]3034）：苗藥鼻寧噴霧劑的技術(shù)提升與深度開發(fā)研究；負(fù)責(zé)人：王森；遵義市科技局遵義市“15851人才精英工程”項(xiàng)目：苗藥鼻寧噴霧劑的技術(shù)提升與深度開發(fā)研究，負(fù)責(zé)人：王森。

＊＊通訊作者：王森，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：經(jīng)皮給藥制劑。