中藥0期臨床藥效學(xué)試驗(yàn)探索＊

梁麗喆，李國信，于雪峰

中藥0期臨床藥效學(xué)試驗(yàn)探索＊

梁麗喆，李國信＊＊，于雪峰＊＊

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院沈陽110034）

目的：以舒血寧注射液為研究對(duì)象，探索中藥開展0期臨床藥效學(xué)試驗(yàn)的可行性。方法：確立適合中藥0期（早期）臨床評(píng)價(jià)的關(guān)鍵技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。按照所建立的研究方法，進(jìn)行健康受試者低劑量舒血寧注射液體內(nèi)給藥，收集給藥前和給藥后血清，進(jìn)行人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞模型損傷的體外實(shí)驗(yàn)，并以臨床給藥劑量的血液樣本為對(duì)照，驗(yàn)證低劑量用藥與臨床劑量用藥的藥效學(xué)趨勢(shì)一致性。結(jié)果：在過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷實(shí)驗(yàn)中，低劑量舒血寧注射液含藥血清能夠影響細(xì)胞增殖，保護(hù)細(xì)胞形態(tài)，減少細(xì)胞損傷所導(dǎo)致的離子釋放以及細(xì)胞上清分泌，轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)具有藥效學(xué)趨勢(shì)。結(jié)論：與臨床給藥組相比，低劑量給藥具有大致相同的藥理活性趨勢(shì)，中藥0期臨床藥效學(xué)試驗(yàn)具有可行性。

中藥0期臨床試驗(yàn)藥效學(xué)舒血寧注射液

中藥作為天然藥物，具有多組分、多途徑、多靶點(diǎn)等的特點(diǎn)，組分與靶點(diǎn)間的關(guān)系相互交叉，故在單味中藥甚至方劑配伍的療效研究中，探尋明確的作用機(jī)制相對(duì)困難[1-3]。隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的推進(jìn)，中藥新藥研發(fā)偏重于提取有效組分并且劑型西化，而組分中藥能否替代單味中藥或者處方所具備的療效，成為中醫(yī)界亟需解釋和解決的問題。西藥0期臨床試驗(yàn)，以小樣本、小劑量、短時(shí)間的方式在人體進(jìn)行臨床前試驗(yàn)，中藥若能借鑒其“探索”思路，在新藥研發(fā)初期，從微觀角度進(jìn)行人體的藥效機(jī)制評(píng)價(jià)，將會(huì)拓寬中藥新藥優(yōu)選途徑，節(jié)約時(shí)間、經(jīng)費(fèi)和人力[4，5]。本研究與西藥0期臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行類比，擬定適合中藥的0期（早期）臨床評(píng)價(jià)方法，并以舒血寧注射液的示范性臨床試驗(yàn)，對(duì)所建立方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1 方法學(xué)建立

1.1 藥物選擇

西藥0期臨床試驗(yàn)多數(shù)應(yīng)用于腫瘤等沒有治療藥物或治療方案不合理的疾病，藥物具備治療窗寬、靶點(diǎn)明確、生物標(biāo)記確證等特性[6]；中藥吸收代謝過程復(fù)雜，明確的藥效機(jī)制探討僅見于個(gè)別成分，選擇符合中藥開展0期（早期）臨床試驗(yàn)的藥物特點(diǎn)如下：①代謝途徑相對(duì)簡(jiǎn)單：以靜脈給藥的中藥注射劑為宜，作為代謝途徑相對(duì)單一的中藥成藥，其直接入血，現(xiàn)代藥理研究相對(duì)簡(jiǎn)單；②成分種類相對(duì)分明：選擇成分種類分明（如黃酮、內(nèi)酯類、生物堿）的藥物進(jìn)行試驗(yàn)，按每種成分的主要藥效作用分別進(jìn)行機(jī)制探討；③生物標(biāo)記相對(duì)確切：采用對(duì)其主要成分有足夠研究基礎(chǔ)的藥物，從文獻(xiàn)中獲得用于該藥物藥效學(xué)檢測(cè)的常用生物標(biāo)記物、藥物作用靶點(diǎn)以及相應(yīng)檢測(cè)方法，既可以對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的科學(xué)性進(jìn)行支撐，也能為臨床驗(yàn)證提供便利。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

西藥0期臨床試驗(yàn)是在藥物開發(fā)早期，于較短時(shí)間內(nèi)在少量目標(biāo)患者（不超過30人）進(jìn)行結(jié)構(gòu)類似化合物的臨床研究，為從眾多類似物中挑選出最佳候選藥物提供理想平臺(tái)[7]。針對(duì)中藥成分在體內(nèi)代謝復(fù)雜的狀況，本研究將西藥0期臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)與中藥特有的血清藥理學(xué)方法相結(jié)合，進(jìn)行健康受試者體內(nèi)給藥后的體外誘導(dǎo)損傷試驗(yàn)，模擬藥物在患者體內(nèi)代謝情況。通過檢測(cè)給藥前后含藥血清作用下的細(xì)胞生物標(biāo)記物變化，進(jìn)行藥效機(jī)制探討，既避免了患者不能耐受小劑量給藥，及健康受試者不能體現(xiàn)藥物療效的尷尬局面，又在一定程度上減輕倫理壓力，在動(dòng)物血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上更進(jìn)一步。

1.3 指標(biāo)選擇

西藥0期臨床藥效試驗(yàn)根據(jù)藥物成分及作用特點(diǎn)，對(duì)起效靶點(diǎn)及能夠反應(yīng)療效的生物標(biāo)記物，采用芯片、放射元素跟蹤等方式進(jìn)行作用機(jī)制通路內(nèi)的敏感指標(biāo)檢測(cè)[8，9]。中藥藥效作用相互交叉，故本研究采取復(fù)雜問題簡(jiǎn)單化的處理方式，將中藥按照其效應(yīng)成分的主要功能分類進(jìn)行體外損傷誘導(dǎo)，再利用損傷后的血液樣本及靶向細(xì)胞，進(jìn)行較為公認(rèn)的體外藥效指標(biāo)檢測(cè)和全序列轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序，以此完成對(duì)多組分、多靶點(diǎn)的中藥療效的微觀的、全面的探討。

2 示范性試驗(yàn)

舒血寧注射液是從銀杏葉中提取并制備的滅菌水溶液包括內(nèi)酯類（銀杏內(nèi)酯A，B，C，白果內(nèi)酯）和黃酮類成分，具有較為明確的抗氧化、抗血小板聚集等作用，臨床常用于缺血性心腦血管疾病[10,11]。本文以低劑量舒血寧注射液的健康受試者含藥血清干預(yù)H2O2誘導(dǎo)損傷的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，并與臨床給藥劑量組對(duì)照，比較其療效趨勢(shì)，探索中藥開展早期臨床藥效學(xué)評(píng)價(jià)的可行性[12]。

2.1 材料與方法

2.1.1 試驗(yàn)受試者與細(xì)胞

8名健康志愿者，男女各半，年齡20-45歲，體重指數(shù)19-24（BMI=體重kg/身高cm2）；心電圖、血尿常規(guī)、凝血、肝腎功能等檢查指標(biāo)均在正常范圍；無煙、酒嗜好；獲取知情同意并志愿受試。人主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株（HAEC）由中國醫(yī)科大學(xué)提供。

2.1.2 主要儀器與試藥

JEM-1200EX透射電鏡（日本電子株式會(huì)社）；激光共聚焦掃描顯微鏡（德國Leica公司）。

舒血寧注射液（黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，5 mL/17.5 mg，批號(hào)：B20140907）；1640培養(yǎng)基、PAN胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗（美國Hyclone公司）；細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽、Fluo-3/AM（美國Sigma公司）；酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法試劑盒（瑞士羅氏公司）。

2.2 含藥血清制備

8名受試者分為低劑量試驗(yàn)組和臨床劑量對(duì)照組，每組4人。分別將臨床給藥劑量的1/6.25（11.2 mg）和臨床給藥劑量（70 mg）的舒血寧注射液添加至250 mL葡萄糖注射液中，每天早晨用藥前1 h統(tǒng)一進(jìn)食，隨后按一定滴速靜脈滴注，2 h靜點(diǎn)完畢，每天1次，連續(xù)給藥7天。末次給藥結(jié)束時(shí)從肘靜脈取血10 mL，置于促凝試管中，離心得血清，56℃水浴滅活，微孔濾膜過濾除菌后，裝凍存管-80℃冰箱保存。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株（Human Aorta Endothe?lial Cells,HAEC）常規(guī)復(fù)蘇，90%貼壁時(shí)進(jìn)行1：2傳代。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組（細(xì)胞+空白血清）、模型組（細(xì)胞+空白血清+H2O2）、低劑量試驗(yàn)組（細(xì)胞+低劑量含藥血清+H2O2）、臨床劑量試驗(yàn)組（細(xì)胞+臨床劑量含藥血清+H2O2）。以0%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、50%的血清體積分?jǐn)?shù)考察最佳空白血清添加量，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

2.4 過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HAEC細(xì)胞，2×108/L的密度100 μL接種于96孔板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，不同的96孔板分別加入濃度為100、200、300、400、500、600 μmol·L-1的H2O2共同培養(yǎng)24 h。終止培養(yǎng)后，每孔加入MTT溶液10 μL，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄液加DMSO 100 μL，避光搖床10 min，于酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔A492處的OD值。

2.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)樣本處理

以2×108/L的密度種板，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，以含相應(yīng)濃度的空白及含藥血清的條件培養(yǎng)基預(yù)處理2 h，加入相應(yīng)濃度H2O2，再次孵育24 h，按照檢測(cè)試劑要求，對(duì)細(xì)胞及細(xì)胞上清液進(jìn)行收樣。

2.6 增殖能力測(cè)定

終止培養(yǎng)后，每孔加入MTT溶液10 μL，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄液加DMSO 100 μL，避光搖床10 min，于酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔A492處的OD值。

2.7 細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)

6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，終止后胰酶消化收集，離心后PBS清洗，100 μL 1×binding buffer避光染色15 min（含Annexin V和PI各5 μL），作單染和空白對(duì)照，加入400 μL 1×bindingbuffer，過濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移至流失管中待測(cè)。

2.8 吖啶橙染色

96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，終止后PBS清洗，將AO和EB溶液按1∶1混合制備工作液，2%比例PBS稀釋后，每孔加入100 μL，5 min后鏡下觀察染色情況。

2.9 鈣離子濃度測(cè)定

終止培養(yǎng)后HBSS溶液3次清洗，每孔加入稀釋的Fluo 3-AM工作液以覆蓋細(xì)胞為度；細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min，去液并用HBSS溶液清洗以充分去除工作液。每孔加入HBSS溶液以覆蓋細(xì)胞，培養(yǎng)箱孵育約20 min后，用激光共聚焦或熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞，激發(fā)波長(zhǎng)480-500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525-530 nm。

2.10 細(xì)胞骨架鬼筆環(huán)肽染色

96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，終止后PBS清洗，每孔加入100 μL 4%多聚甲醛覆蓋，室溫固定30 min；PBS洗3遍，加入100 μL打孔液5 min；熒光洗液清洗、封閉；1∶1 000稀釋Alexa Fluor 546 phalloidin染色，清洗4次；1∶600稀釋DAPI染色劑，清洗4次；棄液，加入50 μL防熒光猝滅封片劑，封口膜封好，4℃保存待測(cè)。

2.11 透射電鏡檢測(cè)

6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，終止后胰酶消化收集，加2.5%戊二醛固定。經(jīng)漂洗，脫水，浸透，包埋，聚合，超薄切片，醋酸鈾檸檬酸鉛染色，于透射電鏡下觀察攝片。

2.12 細(xì)胞分泌功能測(cè)定

終止培養(yǎng)后，采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法（ELISA）對(duì)各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NO、SOD和MDA含量進(jìn)行檢測(cè)，采用放射免疫法檢測(cè)ET。ELISA過程嚴(yán)格按照試劑盒中說明書步驟進(jìn)行。

2.13 全轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序

對(duì)于低劑量試驗(yàn)組的空白血清和含藥血清進(jìn)行6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，終止后胰酶消化收集，加入裂解液后凍存待測(cè)

2.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和分析，計(jì)量資料用（xˉ±s）表示，多組間差異性比較采用ANOVA，兩兩比較采用LSD，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同添加量空白血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

結(jié)果顯示：15%的血清濃度對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖無明顯抑制或促進(jìn)作用，最接近常規(guī)培養(yǎng)，為理想條件（圖1）。

3.2 不同濃度過氧化氫誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞模型建立的結(jié)果

圖1 不同添加量血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞毒性損傷OD值變化

圖2 不同濃度過氧化氫對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞毒性損傷OD值變化

表1 各組血清對(duì)細(xì)胞增殖活性O(shè)D值的影響

由圖2可見，細(xì)胞活力隨H2O2濃度的升高而受到抑制，當(dāng)H2O2濃度為300 μmol/l，作用24 h時(shí)，細(xì)胞損傷率接近50%，考慮為理想造模條件。

3.3 舒血寧注射液含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

由表1結(jié)果顯示：與模型對(duì)照組相比，含藥血清組均能改善細(xì)胞的增殖能力，且隨藥物劑量的增加，呈遞增趨勢(shì)?？瞻讓?duì)照組與臨床劑量給藥組P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)

圖3顯示，模型組HAEC發(fā)生顯著凋亡，14.7%早凋，66.6%晚凋，凋亡發(fā)生率81.3%；低劑量試驗(yàn)組血清干預(yù)后，晚凋下降至27.9%；臨床劑量試驗(yàn)組早凋和晚凋均顯著減少，試驗(yàn)組凋亡發(fā)生率分別為54.4%和23.2%。

3.5 吖啶橙染色

由圖4可見，模型組出現(xiàn)明顯凋亡，其中綠色熒光聚集和染色增強(qiáng)，提示早凋發(fā)生，個(gè)別細(xì)胞核有橘紅色熒光，提示晚凋；在給予低劑量血清預(yù)先處理后，晚凋細(xì)胞明顯減少；臨床劑量試驗(yàn)組進(jìn)一步緩解了凋亡情況，表現(xiàn)為細(xì)胞核染色較淺，細(xì)胞間染色均勻。

3.6 鈣離子濃度測(cè)定

由圖5結(jié)果所示：與空白組比較，模型組鈣離子熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，舒血寧注射液含藥血清的干預(yù)，可以使鈣離子熒光強(qiáng)度降低，具有藥物濃度依賴性。

3.7 細(xì)胞骨架鬼筆環(huán)肽染色

由圖6結(jié)果所示：空白組細(xì)胞骨架呈絲網(wǎng)狀排列，清晰有序；模型組細(xì)胞形態(tài)皺縮排列紊亂，微絲減少或缺失；含藥血清干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)趨于規(guī)則，隨血清中藥物含量增加，細(xì)胞骨架呈絲網(wǎng)狀排列清晰可見。

圖3 細(xì)胞凋亡的流式檢測(cè)

圖4 吖啶橙染色

圖5 各組細(xì)胞鈣離子濃度測(cè)定（×400）

圖6 各組細(xì)胞鬼筆環(huán)肽染色（×400）

圖7 各組內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)（×15 000）

圖8 各組內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)（×30 000）

3.8 電鏡檢測(cè)

由圖7和圖8結(jié)果所示：空白組細(xì)胞核呈橢圓形，核膜核仁清楚，染色質(zhì)分布均勻，胞質(zhì)內(nèi)見溶酶體、線粒體、核糖體、高爾基復(fù)合體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及脂滴等細(xì)胞器。模型組細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核膜模糊，核內(nèi)染色質(zhì)凝聚，胞質(zhì)小面積溶解，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器減少。舒血寧注射液含藥血清干預(yù)后，細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)改善，隨著血清含藥量升高，細(xì)胞核逐漸清晰，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器逐漸增多。

3.9 細(xì)胞分泌功能測(cè)定

由表2可見，與模型組相比，試驗(yàn)組均能不同程度降低細(xì)胞內(nèi)ET和MDA含量，提高NO和SOD活性，且隨血清濃度的增加呈遞進(jìn)趨勢(shì)。

3.10 全轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序

由表3、表4可見，低劑量試驗(yàn)組含藥血清干預(yù)前后（較模型組而言），基因表達(dá)和基因表達(dá)趨勢(shì)均出現(xiàn)差異，與本藥物已有文獻(xiàn)對(duì)照，該差異符合藥物已知功能。

表2 不同組別血清作用下細(xì)胞MDA、SOD、NO、ET水平釋放

表3 試驗(yàn)組給藥前后轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)差異（Enrichment_Analysis）

表4 試驗(yàn)組給藥前后轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)差異趨勢(shì)（GREAT_Analysis）

4 討論

中藥在長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用中，已經(jīng)具備了明確的功效分類，大量的現(xiàn)代藥理研究也為中藥作用機(jī)制進(jìn)行了有力補(bǔ)充[13,14]。在中藥提取物的新藥研發(fā)過程中，利用基因、蛋白組學(xué)對(duì)差異性測(cè)序結(jié)果進(jìn)行解析，以及不為組分與靶點(diǎn)間錯(cuò)雜的對(duì)應(yīng)關(guān)系所牽制，選擇現(xiàn)代文獻(xiàn)中該味或類似中藥相關(guān)起效靶點(diǎn)作為檢測(cè)指標(biāo)，是中藥早期臨床評(píng)價(jià)中對(duì)于藥效機(jī)制判定的兩種候選方法[15,16]。

考慮到開展中藥早期臨床評(píng)價(jià)倫理審批的特殊性和療效評(píng)價(jià)指標(biāo)的敏感性，本研究以上市中藥舒血寧注射液為示范，將健康受試者的含藥血清作用于受損靶細(xì)胞，模擬疾病人群用藥后的細(xì)胞狀態(tài)，在前期的藥代動(dòng)力學(xué)探索基礎(chǔ)上，確定藥效試驗(yàn)的給藥劑量和采血時(shí)間，對(duì)藥物主要的效應(yīng)成分（黃酮類）的主要功能（抗氧化作用）進(jìn)行相應(yīng)的體外誘導(dǎo)（H2O2損傷），結(jié)合透射電鏡、放射免疫法、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等高敏感性檢測(cè)方法，對(duì)低劑量中藥的藥效學(xué)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，同時(shí)，兩個(gè)劑量組大致相同的藥效學(xué)趨勢(shì)表明，中藥早期臨床評(píng)價(jià)具有可行性。

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Abstract:Shu-Xue-Ning(SXN)injection was used as study subject in order to explore the feasibility of pharmacodynamics experiment of Phase 0 clinical trial in Chinese materia medica(CMM).This paper tried to establish key-technique standards which fit to the evaluation on CMM phase 0(early)clinical evaluations.According to the established research methods,this research selected volunteers and assured low dose SXN injection inside their body.And then,serum before and after medication were collected for the HAEC in vitro experiment.Blood sample of the clinical dosage was used as control to verify the tendency consistency of pharmacodynamics in low dose and clinical dose.The results showed that in the H2O2inducing HAEC damage experiment,low dose SXN injection can affect the cell proliferation,protect the shape of cells,reduce the release of ion owing to cell damages and influence the secretion in cells.Complete-sequence RNA gave differential multiterm expression before and after the low dose.It was concluded that compared with the clinical group,low dose medication had similar metabolic tendency.The pharmacodynamics experiment of phase 0 CMM clinical trial is feasible.

Exploratory on Phase 0 Clinical Pharmacodynamics Trial in Chinese Materia Medica

Liang Lizhe,Li Guoxin,Yu Xuefeng
(The Second Affiliated Hospital to Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110034,China)

Chinese materia medica,phase 0 clinical trial,pharmacodynamics Shu-Xue-Ning injection

10.11842/wst.2017.05.024

R969

A

（責(zé)任編輯：陳寧，責(zé)任譯審：王晶）

2017-05-12

修回日期：2017-05-20

＊科學(xué)技術(shù)部國家“十二五”重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目（2012ZX09303-017）：中藥新藥臨床評(píng)價(jià)研究技術(shù)平臺(tái)，負(fù)責(zé)人：李國信；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（2015225015）：肺系重大疾病中醫(yī)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)規(guī)范化研究，負(fù)責(zé)人：李國信。

＊＊通訊作者：李國信，博士，主任醫(yī)師，主要從事中藥新藥研究；于雪峰，碩士，主任醫(yī)師，主要從事肺病中藥研究。