基于ITS2序列鑒定白及與其偽品小白及＊

羅穎，趙之麗，陳科力，劉義梅

基于ITS2序列鑒定白及與其偽品小白及＊

羅穎，趙之麗，陳科力，劉義梅＊＊

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院教育部中藥資源和中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室武漢430065）

目的：通過分析白及與小白及的ITS2條形碼序列，鑒定白及與其偽品小白及。方法：以采集自云南、湖北、貴州、湖南、四川的38份白及和小白及葉片為實(shí)驗(yàn)材料，提取其總DNA，并PCR擴(kuò)增其ITS2序列，對(duì)序列進(jìn)行雙向測(cè)序，并從GenBank上下載2個(gè)物種共8條ITS2序列，用MAGA5.0進(jìn)行序列分析，計(jì)算種內(nèi)、種間遺傳距離，構(gòu)建鄰接樹。結(jié)果：白及與小白及的ITS2序列全長(zhǎng)均為259 bp，種間有14個(gè)變異位點(diǎn)；ITS2序列種內(nèi)最大遺傳距離0.008，種間最小遺傳距離0.040。由所構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹可以看出，不同來(lái)源的白及與小白及的樣本均分別聚為一支，兩者明顯分開。結(jié)論：利用ITS2序列可快速準(zhǔn)確地鑒別白及與小白及。

白及小白及ITS2序列鑒定

白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.和小白及Bletilla formosana（Hayata）Schltr.均為蘭科白及屬Bletilla Rchb.f.植物，是常用中藥材。兩者均以假鱗莖入藥，但僅白及一種被列入《中國(guó)藥典》作為藥用白及的正品基源植物。白及味苦、甘、澀，微寒，具有收斂止血、消腫生肌等功效，用于治療咯血吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂、肺結(jié)核咯血、潰瘍病出血等癥[1]。小白及性涼，味苦、微麻，有小毒，具有清熱化濕，祛風(fēng)止痛的功效，可用于治療消化不良，腹痛，癰瘡腫毒，風(fēng)濕痹痛等癥，在云南當(dāng)?shù)乇粡V泛用治療肺結(jié)核咳嗽[2]。白及與小白及在湖北、四川、陜西、貴州、云南等地都有分布[3]。由于白及與小白及的資源分布具有重疊性，而且原植物的形態(tài)在非花期較難區(qū)別，同時(shí)在假鱗莖形態(tài)上區(qū)別較小，經(jīng)加工處理為飲片、粉末時(shí)，藥材的真?zhèn)舞b別難度較大。隨著白及價(jià)格的上漲，白及野生資源受到極大沖擊，小白及充斥市場(chǎng)。但是兩者在藥效和藥性上存在差異，因此建立一種快速、準(zhǔn)確鑒定白及與小白及的方法，對(duì)于保證白及藥材的質(zhì)量及用藥安全具有重要意義。

DNA條形碼技術(shù)作為物種鑒定的新手段，具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。ITS2條形碼作為DNA條形碼候選序列之一，在植物近緣種親緣關(guān)系、藥材真?zhèn)舞b別等方面應(yīng)用廣泛[4-6]。目前有關(guān)白及屬植物的鑒定，已有其形態(tài)學(xué)、理化性質(zhì)、ISSR DNA分子標(biāo)記[7-9]，以及利用nrDNA ITS、LFY同源基因內(nèi)含子2及葉綠體ycf1基因的3條候選條形碼鑒定等方面的報(bào)道[10]，宋爽等[11]以ITS2序列條形碼對(duì)藥用白及和云南本地種白及進(jìn)行了分析研究，陳黎等[3]應(yīng)用ITS2條形碼序列對(duì)白及藥材及8種常見不同屬的混偽品進(jìn)行了鑒定研究。本研究運(yùn)應(yīng)用ITS2序列條形碼對(duì)采集自不同產(chǎn)地的白及和同屬偽品小白及進(jìn)行鑒定。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器與試劑

MM400臺(tái)式振動(dòng)混合球磨儀（德國(guó)萊馳公司）、HHS-4S數(shù)顯水浴鍋（上海虞龍儀器設(shè)備有限公司）、JY1000C電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、Prime5G PCR儀（英國(guó)Techne公司）、Ezup柱式植物基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）、β-巰基乙醇，Buffer PCB，瓊脂糖均購(gòu)于上海捷瑞生物工程有限公司。

表1 白及與小白及樣本信息表

1.2 樣品來(lái)源

從湖北、云南、貴州、四川、湖南5個(gè)省采集白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.、小白及Bletilla formo?sana（Hayata）Schltr.共2個(gè)物種38個(gè)樣本。新鮮葉片經(jīng)硅膠干燥保存，原植物材料經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定。另從GenBank下載2個(gè)物種ITS2序列共8條。46份植物材料來(lái)源及GenBank號(hào)詳表1。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品DNA提取用

分別取實(shí)驗(yàn)材料的干燥葉片50 mg，用球磨儀研磨2 min（30次/min）,加入600 μL 65℃預(yù)熱的Buffer PCB和12 μLβ-巰基乙醇，震蕩混勻，置于65℃水浴25 min，間或混勻。再采用Ezup柱式植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。

2.2 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

序列擴(kuò)增選用ITS2通用引物ITS2F（5′-AT GC? GATACTTGGTGTGAAT-3′）和ITS3R（5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′）。PCR反應(yīng)體系為25 μL，體系內(nèi)包含2×Tag PCR Mix 12.5 μL，引物（2.5 μmol·L-1）各1.0 μL、模板DNA 2μL，雙蒸水8.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性5 min，經(jīng)過40個(gè)循環(huán)（94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45s），最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將清晰、明亮、單一電泳條帶所對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司行雙向測(cè)序。

2.3 數(shù)據(jù)處理

測(cè)序峰圖應(yīng)用CodonCode Aligner V4.2.4（Codon?Code Co.，USA）校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量序列和引物區(qū)，46條序列的兩端5.8S和28S除去（采用基于隱馬爾可夫模型HMMer注釋方法）以獲得ITS2間隔區(qū)序列[12]。將所有序列用MEGA5.0軟件進(jìn)行分析比對(duì)，計(jì)算K2P遺傳距離值并建立NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 白及與小白及ITS2序列特征分析

不同來(lái)源白及和小白及樣本共46條序列，比對(duì)后長(zhǎng)度均為259 bp。白及種內(nèi)有3個(gè)位點(diǎn)變異，分別為86位處A-G變異，137位C-T變異，相對(duì)于HNBJ002號(hào)樣品其他白及樣品246位處有堿基G缺失。小白及種內(nèi)在137位存在A-G變異。白及與小白及種間有14個(gè)堿基變異位點(diǎn)，其中特征性位點(diǎn)10個(gè)，分別為第6、36、38、44、66、124、136、137、163、174、223位點(diǎn)。變異的位點(diǎn)及堿基變化有一定的規(guī)律，即在特定的位點(diǎn)變異，且變異相同，例如在38位處，白及的堿基全部為“T”，而小白及全部為“G”,因此這些變異位點(diǎn)都可作為鑒定的依據(jù)，將二者完全分開。白及種內(nèi)GC含量在62.2%-62.7%，平均GC含量為62.3%，小白及種內(nèi)GC含量61.4%-61.8%,平均GC含量為61.5%（表2）。

3.2 白及與小白及種內(nèi)與種間遺傳距離分析

白及ITS2序列種內(nèi)最小遺傳距離為0，最大遺傳距離為0.008，平均遺傳距離為0.003。小白及種內(nèi)最小遺傳距離為0，最大遺傳距離為0.004，平均遺傳距離為0.001 6。白及和小白及種間最小遺傳距離為0.040，最大為0.053,平均遺傳距離為0.044。兩者種間最小遺傳距離顯著大于兩者種內(nèi)最大遺傳距離，說明采用ITS2序列可以將白及與小白及準(zhǔn)確鑒別開（表3）。

3.3 白及與小白及聚類分析

從基于ITS2序列構(gòu)建的鄰接（NJ）聚類樹（圖1）可

以看出，不同來(lái)源的白及樣品聚為一支，不同來(lái)源的小白及樣品聚為另一支，兩者明顯分開，因此ITS2條形碼可以鑒定白及與小白及。

表2 白及與小白及ITS2序列特征

表3 白及與小白及的遺傳距離

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建的白及與小白及的NJ樹

4 討論

白及是中國(guó)常用中藥材，由于白及種子繁育困難，人工種植難度較大，導(dǎo)致產(chǎn)區(qū)私挖濫采現(xiàn)象嚴(yán)重，野生資源遭到破壞，白及藥用資源緊張，市場(chǎng)上白及藥材的混偽現(xiàn)象嚴(yán)重，其中白及屬混偽現(xiàn)象較為常見。中國(guó)分布的白及屬有4個(gè)種，其中華白及分布范圍狹窄，極為罕見，市場(chǎng)用藥少見。黃花白及因花色為黃色，顯著區(qū)別于其他3個(gè)物種的粉紅至紫紅色。而白及和小白及在分類學(xué)上特征差異很小，區(qū)別僅在于小白及的唇瓣褶片從基部至唇瓣的中裂片均為波狀，而白及的唇瓣褶片僅中裂片為波狀，從植物形態(tài)上進(jìn)行鑒別困難。同時(shí)，白及與小白及都以假鱗莖入藥，藥材經(jīng)加工切制后，已經(jīng)失去原有的性狀，從藥材性狀上也很難區(qū)分開。白及與小白及在植株形態(tài)，藥材性狀，顯微特征方面都有高度相似性，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行鑒定非常困難且繁瑣[13]。二者在藥效和藥性上具有一定差異，藥材的混用將直接影響到白及臨床用藥的安全和療效。因此，對(duì)白及和小白及進(jìn)行深入的鑒定研究，對(duì)白及的準(zhǔn)確引種栽培，規(guī)范商品市場(chǎng)以及臨床用藥有重要意義。

本研究從5個(gè)省份收集38份實(shí)驗(yàn)樣品，通過Ezup柱式植物基因組DNA提取試劑盒提取植物的總DNA，具有快速、方便，不受有機(jī)試劑污染的特點(diǎn)。所提取的DNA經(jīng)檢測(cè)，質(zhì)量均較好。其PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)均可出現(xiàn)單一、明亮的條帶，純化后雙向測(cè)序成功率達(dá)100%，說明ITS2序列在白及與其偽品小白及的鑒定中是有效的DNA區(qū)段，ITS2序列引物及其反應(yīng)條件針對(duì)白及和小白及鑒定的穩(wěn)定性好。

本研究從GenBank上共下載了8條白及與小白及的ITS2序列片段，與實(shí)驗(yàn)采集的樣品進(jìn)行對(duì)比鑒別。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，通過相似性搜索法、最小距離法以及基于ITS2序列構(gòu)建的NJ樹均能將白及與其偽品小白及很好的區(qū)分開，說明采用ITS2序列鑒定白及與小白及有較高的可靠性。

由此可見，基于ITS2序列的DNA條形碼技術(shù)能夠有效地鑒定白及與其偽品小白及，為保障白及的臨床用藥安全和療效提供了參考依據(jù)。

1中國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部).北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:103.

2馬正,馬宏坤.中藥材白及與小白及的區(qū)別.農(nóng)業(yè)與技術(shù),2016,36 (4):250-250.

3陳黎.鄂西北白及產(chǎn)地適宜性與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究.武漢:湖北中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文,2014.

4朱英杰,陳士林,姚輝,等.重樓屬藥用植物DNA條形碼鑒定研究.藥學(xué)學(xué)報(bào),2010,45(3):376-382.

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Identification of Bletilla Striata(Thunb.)Reichb.f.and Bletilla Formosana(Hayata)Schltr.Based on ITS2 Sequence

Luo Ying,Zhao Zhili,Chen Keli,Liu Yimei
(Key Laboratory of Ministry of Education on Traditional Chinese Medicine Resource and Compound Prescription, College of Pharmacy,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

This study was aimed to identify Bletilla Striata(Thunb.)Reichb.f.and Bletilla Formosana(Hayata)Schltr.by ITS2 sequence.The leaves of 38 samples of Bletilla striata and Bletilla formosana from Yunnan,Hubei,Guizhou,Hunan and Sichuan province were used as experiment materials.The total DNA was extracted.Internal transcribed spacer 2 (ITS2)sequences were obtained by PCR.All of the ITS2 sequences were checked.The 8 ITS2 sequences from two species were downloaded from GenBank.The intraspecific and interspecific Kimura-2-parameter(K2P)distances of Bletilla striata and Bletilla formosana were calculated by MEGA5.0.And neighbor-joining(NJ)tree was constructed. The results showed that the full-length sequences of ITS2 from Bletilla striata and Bletilla formosana were 259 bp,with a total of 14 variable sites.The maximum intraspecific K2P distance of Bletilla striata and Bletilla formosana was 0.008, while the minimum interspecific K2P distance was 0.040.The ITS2 secondary structure showed that different origins of Bletilla striata were gathered together and could be distinguished obviously from Bletilla formosana by NJ tree.It was concluded that ITS2 sequence was able to identify Bletilla striata and Bletilla formosana quickly and accurately.

Bletilla striata,Bletilla formosana,ITS2 sequence,identification

10.11842/wst.2017.05.022

R282.5

A

（責(zé)任編輯：張娜娜，責(zé)任譯審：王晶）

2017-03-21

修回日期：2017-05-01

＊科學(xué)技術(shù)部重大新藥創(chuàng)制國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2014ZX09304307001）：中藥新藥安全性檢測(cè)技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)研究，負(fù)責(zé)人：肖紅斌。

＊＊通訊作者：劉義梅，教授，主要研究方向：中藥資源及其品質(zhì)研究。