近紅外漫反射光譜結(jié)合相關(guān)系數(shù)法快速檢測制川烏中雙酯型生物堿的限量Δ

鞏曉宇，陸燕萍，邱鳳鄒，陳秋燕

(深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，廣東 深圳 518172)

近紅外漫反射光譜結(jié)合相關(guān)系數(shù)法快速檢測制川烏中雙酯型生物堿的限量Δ

鞏曉宇*，陸燕萍#，邱鳳鄒，陳秋燕

(深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，廣東 深圳 518172)

目的：建立快速檢測制川烏中雙酯型生物堿限量的近紅外漫反射光譜結(jié)合相關(guān)系數(shù)法。方法：選擇制川烏、生川烏，分析雙酯型生物堿的近紅外特征區(qū)間，同時測定每批次樣品中雙酯型生物堿的含量，采用OPUS軟件中相關(guān)系數(shù)法分析每批次樣品與生川烏的相關(guān)系數(shù)，確定方法閾值。結(jié)果：炮制充分的樣品，相關(guān)系數(shù)均≤25%；未炮制充分的樣品，相關(guān)系數(shù)均為60%～70%。當(dāng)定義閾值為40%時，能準(zhǔn)確地對樣品進(jìn)行初篩。結(jié)論：近紅外漫反射光譜結(jié)合相關(guān)系數(shù)法可以對制川烏樣品中雙酯型生物堿的限量進(jìn)行初篩，用于該類藥品的質(zhì)量控制，同時可以應(yīng)用于藥品監(jiān)管機構(gòu)進(jìn)行快速篩查和監(jiān)督抽樣。

制川烏； 近紅外漫反射光譜； 相關(guān)系數(shù)法； 雙酯型生物堿

制川烏是將川烏用水浸泡至內(nèi)無干心，取出，加水煮沸4～6 h(或蒸6～8 h)，切開內(nèi)無白心，口嘗微有麻舌感時，切片，干燥，即得。炮制主要是降低生品中單酯型生物堿(苯甲酰新烏頭原堿、 苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿)和雙酯型生物堿(新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿)的含量，以達(dá)到減毒的目的?！吨腥A人民共和國藥典》(2015年版)中采用高效液相色譜法對制川烏中雙酯型生物堿的限量進(jìn)行了規(guī)定[1]，但該方法專業(yè)性強，操作過程十分麻煩，不利于對炮制過程進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析，在醫(yī)院購進(jìn)品種的檢測和質(zhì)量控制上有局限性，使制川烏在臨床上的應(yīng)用存在很大的安全風(fēng)險。近紅外漫反射光譜能在不破壞樣品的情況下，綜合反映藥品的工藝、組成信息[2]，在藥物快速檢測中優(yōu)勢明顯，對植物、動物類藥材也有很好的適用性[3]。相關(guān)系數(shù)法是近紅外分析中常用的方法之一，通過比較未知樣品光譜與已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)光譜之間的相似系數(shù)來分析待測樣品的性質(zhì)。通過設(shè)定合理的閾值，能準(zhǔn)確快速判斷樣品中相關(guān)成分的含量是否符合要求，適用于限量檢測[4]。本研究建立了快速檢測制川烏中雙酯型生物堿限量的近紅外漫反射光譜結(jié)合相關(guān)系數(shù)法，現(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 儀器

MATRIX-F型近紅外光譜儀(德國Bruker公司)，配有光纖探頭測樣附件、銦鎵砷檢測器、OPUS 7.0光譜分析軟件；Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；HANGPING FA2004型分析天平(上海天平儀器廠)。

1.2 樣品與試劑

共收集18個批次制川烏樣品(其中5個批次用于方法的驗證)，1個批次生川烏作為參比對照物，見表1。乙腈、甲醇為色譜純；水為純化水；四氫呋喃為分析純；新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對照藥材購于中國藥品生物制品檢定所(批號分別為110799-200404、110798-200404、110720-200410)。

表1 18個批次制川烏樣品、1個批次生川烏信息表Tab 1 Sample information of 18 batches of radix aconitum preparata and 1 batch of radix aconitum

2 方法與結(jié)果

2.1 相關(guān)系數(shù)法原理

相關(guān)系數(shù)(r)為兩張光譜的協(xié)方差(Cov)除以兩張光譜標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ)的乘積，即r=Cov[y1(k)，y2(k)]/(σy1·σy2)。其中，r的取值范圍為-1～1，如果-1≤r≤0，則將其表示為0%；如果0

2.2 樣品近紅外漫反射光譜采集及特征譜段的選擇

將樣品粉碎，過三號篩(50目)后置于樣品瓶中，將近紅外光纖探頭與樣品緊密接觸，掃描區(qū)間12 000～4 000 cm-1，波數(shù)間隔8 cm-1，累積次數(shù)32次，每批次樣品測量3次，取平均光譜，背景光譜每小時重新校正1次，樣品光譜見圖1(A)。然后取生川烏粉末，分別加入混合對照品溶液0.5、1.0、2.0 ml，測定近紅外光譜，見圖1(B)。實驗發(fā)現(xiàn)，在雙酯型生物堿混合對照物光譜上(圖譜經(jīng)矢量歸一化處理)，在5 600～6 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，濃度與光譜有明顯的相關(guān)性(見圖2)，故選擇此譜段作為相關(guān)系數(shù)法分析的特征譜段，其他區(qū)域有一定的相關(guān)性，但有植物基底的干擾，不合適作為特征區(qū)間。

A.樣品； B.雙酯型生物堿混合對照物A.Sample； B.Diester-type alkaloids hybrid control圖1 樣品與雙酯型生物堿混合對照物的近紅外光譜Fig 1 Near-infrared spectroscopy of samples and diester-type alkaloid hybrid contro

圖2 雙酯型生物堿混合對照光譜特征Fig 2 Spectral characteristics of diester-type alkaloids hybrid control

2.3 樣品中雙酯型生物堿限量測定及相關(guān)系數(shù)法閾值的確定

首先測定每批次樣品中雙酯型生物堿的總含量，然后以生川烏為對照，在選定的特征譜段下，比較每個樣品與生川烏樣品近紅外光譜的相似系數(shù)，根據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015年版)規(guī)定的限量值(不得超過0.040%)，得到相關(guān)系數(shù)的閾值，從而確定方法的閾值。

2.3.1 色譜條件：安捷倫色譜柱(XDB-C18)(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相A為乙腈-四氫呋喃(V∶V=25 ∶15)，流動相B為0.1 mol/L醋酸銨溶液(每1 000 ml加冰醋酸0.5 ml)，進(jìn)行梯度洗脫(見表2)；流速為1 ml/min；檢測波長為235 nm。

表2 梯度洗脫流程Tab 2 Mobile phase gradients

2.3.2 對照品溶液的制備：精密稱取烏頭堿對照品0.6 mg、次烏頭堿對照品1.7 mg、新烏頭堿對照品1.7 mg，置于10 ml容量瓶中，加異丙醇-三氯甲烷(V∶V=1 ∶1)混合溶液定容至刻度(其中每1 ml含烏頭堿60 μg、次烏頭堿和新烏頭堿各0.17 mg)。

2.3.3 供試品溶液的制備：取本品粉末(過三號篩)約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加氨試液3 ml，精密加入異丙醇-乙酸乙酯(V∶V=1∶1)混合溶液50 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用異丙醇-乙酸乙酯(V∶V=1∶1)補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 min，40 ℃下減壓回收溶劑至干，殘渣加入異丙醇-三氯甲烷(V∶V=1∶1)混合溶液3 ml溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 相關(guān)系數(shù)及閾值的確定：吸取上述2種溶液，按高效液相色譜法測定；同時對測得的光譜，選擇OPUS軟件中相關(guān)系數(shù)方法，以生川烏光譜為參照，分別計算相關(guān)系數(shù)，各批次樣品中雙酯型生物堿的含量及相關(guān)系數(shù)見表3。以總雙酯型生物堿和相關(guān)系數(shù)作圖，結(jié)果顯示，相關(guān)系數(shù)與總雙酯型生物堿的含量并不呈線性關(guān)系(見圖3)，大致可以用多項式擬合：y=929.42x3-301.77x2+32.411x-0.169 3，其中x表示樣品中雙酯型生物堿的含量，y表示相關(guān)系數(shù)。由圖3可見，炮制充分的制川烏與生川烏的相關(guān)系數(shù)均≤25%，總雙酯型生物堿含量在0.040%的限量值時，相關(guān)系數(shù)大致在60%～70%，考慮到實際測量中的偏差，可以適當(dāng)提高預(yù)警值，便于完全涵蓋不合格的范圍，故定義閾值為40%，即當(dāng)待測樣品與生川烏標(biāo)準(zhǔn)對照物近紅外光譜相關(guān)系數(shù)>40%時，提示炮制不充分，雙酯型生物堿含量可能高于規(guī)定的限量。

表3 樣品中雙酯型生物堿的測定結(jié)果及相關(guān)系數(shù)Tab 3 Determination of diester-type alkaloids in samples and correlation coefficients

注：“—”表示未檢出
Note：“—” indicates not detected

圖3 相關(guān)系數(shù)與總雙酯型生物堿含量限量的對應(yīng)關(guān)系圖Fig 3 Correspondence graph of correlation coefficient and content limit of diester-type alkaloids

2.4 方法的驗證與應(yīng)用

對所建立的近紅外相關(guān)系數(shù)檢測制川烏中雙酯型生物堿限量的方法進(jìn)行了初步的驗證，即對醫(yī)院新購進(jìn)的制川烏樣品按照《中華人民共和國藥典》(2015年版)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行限量檢查，同時采用近紅外相關(guān)系數(shù)法預(yù)測，結(jié)果顯示，一致性良好，見表4。

表4 方法的驗證結(jié)果Tab 4 Verify results of method

注：“—”表示低于定量限，未檢出
Note: “—” stands for below the quantitative value,not detected

3 討論

近紅外光譜法具有快速、無損、無污染、無試劑消耗的優(yōu)點，能綜合反映樣本的物質(zhì)組成信息，可以很好地應(yīng)用于藥品的快速檢測[5-9]。通過分析制川烏樣品的近紅外漫反射光譜特征，選擇特征譜段，采用相關(guān)系數(shù)法，能快速預(yù)測樣品中雙酯型生物堿是否符合《中華人民共和國藥典》(2015年版)的規(guī)定，對于限量檢測提供了很好的研究思路。

相關(guān)系數(shù)法建立的模型，不同于定量分析，相關(guān)系數(shù)與含量大小不是簡單的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)建立的模型并不能準(zhǔn)確給出樣品中雙酯型生物堿的含量值[10]。方法給出的閾值，反映的是樣品炮制程度的指標(biāo)，是一個初步的篩查方法，具體的限量值還需要通過法定檢驗得出。

制川烏樣品與生川烏參照物的相關(guān)系數(shù)，不僅與樣品中雙酯型生物堿的含量對應(yīng)，與樣品炮制過程中整體變化也密切相關(guān)。準(zhǔn)確地說，相關(guān)系數(shù)的變化，是炮制過程中一系列化學(xué)變化和物理變化的綜合結(jié)果反映，雙酯型生物堿是其中的指標(biāo)之一。相關(guān)系數(shù)法對限量檢測的判斷，相對于單純的含量測定更有實際意義，同時，以上研究也提供了限量檢查的新思路。

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Rapid Determination of Diester-type Alkaloids in Radix Aconiti Preparata by Near Infrared Correlation Coefficient MethodΔ

GONG Xiaoyu,LU Yanping,QIU Fengzou,CHEN Qiuyan

(Dept.of Pharmacy,People’s Hospital of Shenzhen Longgang District,Guangdong Shenzhen 518172,China)

OBJECTIVE: To establish rapid identification on biogerm limit of diester-type alkaloids in radix aconiti preparata by near infrared diffuse spectroscopy combined with correlation coefficient method. METHODS: Samples of radix aconitum preparata and radix aconitum were selected to analyze the near-infrared characteristic range of diester-type alkaloids. The content of diester-type alkaloids in each batch was also determined. The correlation coefficient method was used to analyze the correlation coefficient between samples of each batch and standard control of radix aconiti,and the method threshold was determined. RESULTS: The correlation coefficient of fully processed samples were ≤25%; yet the correlation coefficient of not fully processed samples were 60%-70%. Samples could be accurately screened when the defined thresholds were set at 40%. CONCLUSIONS: Near-infrared diffuse reflectance spectroscopy combined with correlation coefficient method can be used to determine the limit of diester-type alkaloids in radix aconiti preparata for the quality control of drugs purchased in the hospital. Meanwhile,the method can be applied to screening and supervision of sampling in drug regulatory agencies.

Radix aconiti preparata; Near infrared diffuse reflection spectroscopy; Correlation coefficient method; Diester type alkaloids

深圳市龍崗區(qū)科技發(fā)展資金醫(yī)療衛(wèi)生(扶持類)項目(No.YLWS20150514153303078)

R927

A

1672-2124(2017)08-1036-03

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.08.011

2017-04-06)

*主管中藥師。研究方向：中藥資源與鑒定。E-mail：xiaoyu123126@163.com

#通信作者：主任中藥師。研究方向：中藥鑒定與中藥炮制。E-mail：luyanp317@163.com