飼料中添加干酪乳桿菌對(duì)鯉魚非特異性免疫力和抗病力的影響

張海朋 ， 谷 巍 ， 鞠安琪 ， 畢建飛 ， 曲 磊 ， 成 璐 ，陳 龍 ， 康元環(huán) ， 單曉楓 ， 錢愛(ài)東

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林長(zhǎng)春130118 ； 2.山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司 ， 山東泰安271000)

飼料中添加干酪乳桿菌對(duì)鯉魚非特異性免疫力和抗病力的影響

張海朋1， 谷 巍2， 鞠安琪1， 畢建飛1， 曲 磊1， 成 璐1，陳 龍1， 康元環(huán)1， 單曉楓1， 錢愛(ài)東1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林長(zhǎng)春130118 ； 2.山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司 ， 山東泰安271000)

為探討飼料中添加干酪乳桿菌對(duì)非特異性免疫力和抗病力的影響，在基礎(chǔ)飼料中分別添加3種不同濃度1×107CFU/g、1×108CFU/g、1×109CFU/g的干酪乳桿菌，養(yǎng)殖初始體重為(28±0.3)g的鯉魚6周。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，飼料中添加1×108CFU/g時(shí)超氧化物歧化酶(SOD)和抗體IgM含量顯著升高(P<0.05)，但1×109CFU/g的SOD活力和抗體IgM含量反而受抑制；在28 d時(shí)添加量為1×108CFU/g的溶菌酶(LZM)和過(guò)氧化物酶(POD)活力最高，1×107CFU/g、1×109CFU/g的低一些，均高于對(duì)照組；而試驗(yàn)各組中堿性磷酸酶(AKP)活力隨干酪乳桿菌濃度的增加而升高。飼喂后第42天以菌株維氏氣單胞菌TH0426攻毒，各組14 d后的累積死亡率差異顯著(P<0.05)，與對(duì)照組相比，添加1×108CFU/g的干酪乳桿菌免疫保護(hù)率最高為60%，1×107CFU/g、1×109CFU/g的次之。由此可見(jiàn)，在基礎(chǔ)飼料中添加1×108CFU/g的干酪乳桿菌能提高鯉魚的非特異性免疫力，且具有較高的免疫保護(hù)效果。

干酪乳桿菌 ； 鯉魚 ； 酶活力 ； 免疫效果

干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)屬于乳桿菌屬(Lactobacillus),革蘭陽(yáng)性菌,研究報(bào)道干酪乳桿菌對(duì)動(dòng)物宿主具有顯著益生作用，能夠排斥有害微生物,改善腸道微生物菌群和上皮細(xì)胞完整性，增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)等作用[1]，飼料中添加干酪乳桿菌有望能提高魚類的細(xì)胞免疫水平,改善腸道微生物環(huán)境。

在我國(guó)，鯉魚養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴(kuò)大，但病害的頻發(fā)制約了魚類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，由于抗生素的耐藥性以及疫苗的價(jià)格過(guò)高和使用不便等因素，致使其應(yīng)用受限[2]，而乳酸菌制劑因使用方便，價(jià)格合理，在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用，因而可能成為目前有效控制魚病的一種重要手段。魚類的非特異性免疫是魚類抵抗病原微生物感染的重要手段，其吞噬和免疫相關(guān)酶類起主要作用。堿性磷酸酶(AKP)廣泛存在于魚類的血液、組織和器官等部位，對(duì)魚類的生長(zhǎng)發(fā)育及免疫機(jī)制起到至關(guān)重要的作用；超氧化物歧化酶(SOD)是一種重要的抗氧化酶，能夠清除體內(nèi)多余的氧自由基；過(guò)氧化物酶(POD)能促進(jìn)細(xì)胞呼吸，提高粒細(xì)胞對(duì)外源異物的吞噬能力。抗體IgM是魚類特異性體液免疫應(yīng)答中最主要的介質(zhì),其含量的高低與機(jī)體的免疫能力密切相關(guān)。因此，探究魚體內(nèi)非特異性免疫和抗病力對(duì)魚類免疫機(jī)制的研究具有重要意義。本文選用鯉魚為試驗(yàn)動(dòng)物，以飼料中添加不同濃度的干酪乳桿菌進(jìn)行投喂飼養(yǎng)，分析其對(duì)LZM、AKP、SOD和POD酶活力變化和抗體IgM含量及抗病力的影響，為干酪乳桿菌在鯉魚飼料中的合理應(yīng)用提供理論應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株及動(dòng)物 干酪乳桿菌C20028株、維氏氣單胞菌TH0426株由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存。健康鯉魚，購(gòu)自長(zhǎng)春某養(yǎng)殖場(chǎng)，暫養(yǎng) 15 d，觀察健康無(wú)癥狀后用于試驗(yàn)。

1.2 主要試劑及器材 MRS瓊脂，購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)責(zé)任有限公司；30 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱，電熱鼓風(fēng)干燥箱，基礎(chǔ)飼料選自山東省原味寵糧源自天然公司生產(chǎn)的鯉魚全價(jià)配合粒狀飼料(粗蛋白34%、粗脂肪5.0%、粗纖維8.0%)。LZM、AKP、SOD以及POD和抗體IgM含量檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)TSZ生物公司；Sigma高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)及干酪乳桿菌飼料添加劑制備 干酪乳桿菌C20028在MRS平板劃線30 ℃厭氧過(guò)夜培養(yǎng)后，接種單菌落于MRS液體培養(yǎng)基30 ℃厭氧過(guò)夜培養(yǎng)。平板計(jì)數(shù)后用于飼料添加劑的制備。

干酪乳桿菌飼料添加劑的制備參考李卓佳等(2003)方法略有改動(dòng)制備干酪乳桿菌飼料添加劑。具體如下：干酪乳桿菌C20028接種在MRS液體培養(yǎng)基中 30 ℃過(guò)夜厭氧培養(yǎng)，菌懸液5 000 r/min(4 ℃)離心15 min,棄去上清，并加入等量無(wú)菌PBS，反復(fù)離心3次后平板計(jì)數(shù)干酪乳桿菌的菌液濃度，以無(wú)菌PBS調(diào)整菌液濃度為1×107、1×108、1×109CFU/g后將菌液均勻的噴灑到基礎(chǔ)飼料中，再將噴灑過(guò)干酪乳桿菌的飼料放到恒溫40 ℃的烘干箱中烘干，直至飼料變干，同時(shí)取少部分烘干的飼料進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，驗(yàn)證飼料中干酪乳桿菌的菌液濃度也為1×107、1×108、1×109CFU/g。放到4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 飼養(yǎng)管理 選擇240尾體重為(28±0.3)g，體態(tài)正常,健康無(wú)病的鯉魚，將240尾暫養(yǎng)后的鯉魚隨機(jī)分為4組，作為對(duì)照組和3種基礎(chǔ)飼料中添加干酪乳桿菌的濃度為1×107、1×108、1×109CFU/g的3個(gè)組，每組做3個(gè)重復(fù)組，每個(gè)重復(fù)組20尾魚，全程水溫為25℃±1℃，試驗(yàn)前兩周使用基礎(chǔ)飼料進(jìn)行馴化，待魚穩(wěn)定后開始以組為單位投喂添加不同濃度干酪乳桿菌的基礎(chǔ)飼料，每天投喂3次，試驗(yàn)各組投喂添加不同濃度的干酪乳桿菌飼料7 d后，投喂不添加干酪乳桿菌的基礎(chǔ)飼料7 d，然后再投喂含干酪乳桿菌的飼料，以此類推，其余時(shí)間均投喂不含干酪乳桿菌的基礎(chǔ)飼料，而對(duì)照組始終投喂基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)期為6周。

1.5 血清樣品采集 在養(yǎng)殖第0天、7天、14天、21天、28天、35天、42天時(shí)，每組隨機(jī)抽取3尾魚。用10%丁香油麻醉，采用尾靜脈采血法抽取鯉魚血液置于 5 mL滅菌離心管中，分組標(biāo)號(hào)，在室溫下放置1 h后，置于4 ℃冰箱中過(guò)夜，待血清充分析出后以3 500 r/min 離心15 min,制得血清，-40 ℃保存。

1.6 酶活力檢測(cè) 血清中LZM,AKP,POD和SOD酶活力和抗體IgM含量的測(cè)定，均采用美國(guó)TSZ生物公司提供的檢測(cè)試劑盒，相應(yīng)操作按說(shuō)明書進(jìn)行。酶活力單位各說(shuō)明書已標(biāo)明。

1.7 攻毒試驗(yàn) 試驗(yàn)用維氏氣單胞菌TH0426來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室保存，菌液用LB液體培養(yǎng)在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用滅菌生理鹽水清洗，集菌，6 000 r/min 離心15 min，收集沉淀細(xì)菌體，反復(fù)洗菌3次后，進(jìn)行梯度稀釋，確定適宜攻毒濃度(1×106CFU/mL)后，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，每組取20尾魚進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，每尾腹腔注射維氏氣單胞菌TH0426 0.2 mL，每組繼續(xù)投喂試驗(yàn)飼料飼養(yǎng)，計(jì)算14 d的累積死亡情況，計(jì)算存活率。

1.8 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 16.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析, 結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 血清中LZM、SOD、AKP、POD酶活力變化 從圖1可以看出，試驗(yàn)各組LZM活力與對(duì)照組相比，在飼喂后都逐漸上升，其中1×108CFU/g的LZM活力在28 d為最高，達(dá)到0.578 IU/L,差異極顯著(P<0.01)，并在35 d和42 d保持穩(wěn)定，而1×107CFU/g和1×109CFU/g組中LZM活力較低，但仍高于對(duì)照組水平。

從圖2可以看出，1×107CFU/g、1×108CFU/g組中SOD活力在28 d時(shí)活力最顯著，而在28、42 d時(shí)1×109CFU/g組對(duì)SOD的活力具有抑制作用。

從圖3可以看出，1×107CFU/g、1×108CFU/g和1×109CFU/g組中血清AKP活力顯著下降(P<0.05)，但在28 d～42 d時(shí)AKP活力都上升，其中1×109CFU/g組中AKP活力上升最高，隨后基本穩(wěn)定。

從圖4可以看出，試驗(yàn)各組POD活力在飼喂前后基本無(wú)變化，但在第14天時(shí)都趨于上升，且1×108CFU/g組POD活力均高于1×107CFU/g和1×109CFU/g組，各組在隨后第28～42天趨于穩(wěn)定。

圖1 飼喂后各組血清LZM活力變化

圖2 飼喂后各組血清SOD活力變化

圖3 飼喂后各組血清AKP活力變化

圖4 飼喂后各組血清POD活力變化

2.2 血清中抗體IgM含量的檢測(cè) 飼喂不同濃度的干酪乳桿菌后1×107CFU/g和1×108CFU/g組中IgM含量隨濃度增加而升高(P<0.05)，而1×109CFU/g組中IgM含量出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，可見(jiàn)飼喂過(guò)高濃度的干酪乳桿菌可抑制IgM的生成。

2.3 免疫保護(hù)力檢測(cè)結(jié)果 免疫后第42天以維氏氣單胞菌TH0426進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，對(duì)照組從第1天和第2天開始出現(xiàn)大量死亡，在第6天死亡率達(dá)到100%。1×107CFU/g、1×108CFU/g和1×109CFU/g組在攻毒后5 d死亡數(shù)量逐減，在第7天以后沒(méi)有死亡情況，觀察14 d后，根據(jù)公式計(jì)算出1×107CFU/g、和1×109CFU/g組的相對(duì)免疫保護(hù)率 RPS 為45%和35%，而1×108CFU/g組的相對(duì)免疫保護(hù)率 RPS 最高為60%，試驗(yàn)組及對(duì)照組在攻毒后鯉魚具體死亡數(shù)量可見(jiàn)圖6

3 討論

非特異性免疫系統(tǒng)是魚類的基本防御機(jī)制，在抗病力上比特異性免疫系統(tǒng)更重要。溶菌酶(LZM)可以協(xié)調(diào)其他免疫因子共同抵制病原的入侵，是衡量免疫功能及機(jī)體狀態(tài)的指標(biāo)[3]。本試驗(yàn)各組血清中LZM活力穩(wěn)定升高,均高于對(duì)照組水平，且1×108CFU/g組在第28天達(dá)到最高值，之后呈下降趨勢(shì)，這與王雷[4]報(bào)道的試驗(yàn)結(jié)果相似,表明干酪乳桿菌可以提高鯉魚血清中LZM活力，進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)外源微生物侵染的防御能力。

圖5 飼喂后各組血清IgM含量變化

圖6 菌株維氏氣單胞菌TH0426攻毒后的存活曲線

超氧化物歧化酶(SOD)是一種重要的抗氧化酶，能使動(dòng)物免除自由基造成的危害。本文中1×107CFU/g、1×108CFU/g組SOD活力顯著提升，而1×109CFU/g組的SOD活力受抑制，此結(jié)果與冼健安[5]等報(bào)道的基本一致，據(jù)此推測(cè)所用的干酪乳桿菌在低濃度時(shí)對(duì)SOD活力具有促進(jìn)作用。

堿性磷酸酶(AKP)是重要的解毒體系，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原的識(shí)別和吞噬能力，是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)之一。本試驗(yàn)各組AKP活力在早期階段呈下降趨勢(shì)，但在第28天，各試驗(yàn)組AKP活力出現(xiàn)上升趨勢(shì)，隨后趨于穩(wěn)定。這與譚初斌[6]等研究結(jié)果相似，表明飼喂干酪乳桿菌后可改善鯉魚血清中AKP活力。

過(guò)氧化物酶(POD)屬抗氧化酶類,在體內(nèi)分解H2O,對(duì)體內(nèi)氧自由基的清除具有重要作用，可以提高機(jī)體的解毒功能和防病抗病能力。本試驗(yàn)中，各組POD活力在7 d、14 d時(shí)基本無(wú)變化，但到28 d時(shí)POD活力上升，且1×108CFU/g組POD活力最高，到35 d、42 d時(shí)趨于穩(wěn)定。這可能是適當(dāng)濃度的干酪乳桿菌提高了POD活力。

在體液免疫中，抗體IgM的合成可抵御外源異物的入侵，因此抗體IgM含量可作為評(píng)價(jià)魚類免疫強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，1×107CFU/g、1×108CFU/g組的IgM含量上升，而1×109CFU/g組的IgM含量處于較低水平。因此，我們發(fā)現(xiàn)飼喂低濃度的干酪乳桿菌能促進(jìn)IgM生成，而高濃度反而抑制IgM生成。這與李春翠[7]試驗(yàn)結(jié)果相一致，表明適當(dāng)濃度的干酪乳桿菌能促進(jìn)鯉魚產(chǎn)生IgM免疫球蛋白。

攻毒試驗(yàn)顯示，1×108CFU/g組的相對(duì)免疫保護(hù)率最高為60%，表明飼喂添加1×108CFU/g的干酪乳桿菌能提供一定的保護(hù)力，充分證實(shí)干酪乳桿菌能顯著提高鯉魚的抗病能力。

綜上所述，飼料中添加1×108CFU/g的干酪乳桿菌能提高鯉魚血清中LZM、SOD、AKP、POD酶活力和IgM含量，并提供了一定的保護(hù)力，進(jìn)而增強(qiáng)了鯉魚的非特異性免疫，本研究結(jié)果為魚類口服疫苗的研制提供了重要參考。

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Effects of non-specific immunity and disease resistance of feeding Lactobacillus casei on common carp

ZHANG Hai-peng1， GU Wei2, JU An-qi1， BI Jian-fei1， QU Lei1， CHENG Lu1， CHEN Long1， KANG Yuan-huan1， SHAN Xiao-feng1， QIAN Ai-dong1

(1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China； 2.Shandong Baolai to Biological Engineering Co., Ltd，Taian 271000，China)

To investigate the effects of the feed of Lactobacillus casei on non-specific immunity and disease resistance in carp，three different concentrations of Lactobacillus casei (1×107CFU/g,1×108CFU/g,1×109CFU/g) were added to the basal diet for 6 weeks, and the initial culture weight of carp was 28±0.3g.The results showed that the contents of SOD and IgM increased significantly (P <0.05) at 1 × 108CFU / g, but the contents of SOD and IgM were inhibited at 1 × 109CFU /g.The LZM and POD activities (1 × 108CFU / g) were the highest at 28d, and 1 × 107CFU / g and 1 × 109CFU / g was lower than 1 × 108CFU / g, all the experimental groups were higher than the control group. While the activity of AKP in all experimental groups increased with the concentration of Lactobacillus casei. On the 42 day after feeding, the fishes were challenged with Aeromonas hydrophila strain TH0426, there were significant differences in the cumulative mortality after 14 days (P <0.05).Compared with the control group, the immune protection rate of Lactobacillus with 1 ×108CFU/g was 60%, followed by 1 × 107CFU/g, 1 ×109CFU/g. Thus, adding 1 × 108CFU / g of Lactobacillus casei to the basal diet could improve the non-specific immunity of carp and have higher immune protection effect.

Lactobacillus casei ; Carp ; Enzyme activity ; Immune effect

s: QIAN Ai-dong ; SHAN Xiao-feng

2016-12-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201927)；吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204065NY)

張海朋(1989-)，男，碩士生，從事動(dòng)物分子免疫學(xué)研究，E-mail：zhanghaipeng211@163.com

錢愛(ài)東，E-mail：qianaidong0115@163.com; 單曉楓，E-mail：sxf1997@163.com

TS2

A

0529-6005(2017)07-0085-04