一種防治雞大腸桿菌病的中藥復方的篩選

曹禮靜 ， 袁麗花 ， 廖開燕

(1.重慶市榮昌區(qū)職業(yè)教育中心 ， 重慶榮昌 ， 402460 ； 2.重慶市榮昌初級中學 ， 重慶榮昌 ， 402460)

一種防治雞大腸桿菌病的中藥復方的篩選

曹禮靜1， 袁麗花1， 廖開燕2

(1.重慶市榮昌區(qū)職業(yè)教育中心 ， 重慶榮昌 ， 402460 ； 2.重慶市榮昌初級中學 ， 重慶榮昌 ， 402460)

為篩選出具有顯著效果的治療雞大腸桿菌病的中藥復方，本試驗擬定了5個中藥復方，通過進行體外體內(nèi)抑菌試驗來評價其抗菌效果。體外抑菌試驗主要通過牛津杯法測定單味藥及不同中藥復方的抑菌圈大小來評價大腸桿菌對藥物的敏感度，體內(nèi)試驗主要利用對人工建立的病雞模型的治療效果對5個中藥復方進行篩選。結果顯示，濃度為1.0 g/mL的提取液抗菌效果較0.5 g/mL的提取液抗菌效果好，當提取液濃度為1.0 g/mL時，大腸桿菌對大黃、地錦草高度敏感；對黃芩、十大功勞中度敏感；對中藥復方組方I、II、III、IV、V中度敏感。臨床試驗結果顯示，中藥復方III組治療效果較好，治愈率為71.4%，死亡率為14.3%，而模型組治愈率為11.1%，死亡率為66.7%，差異極顯著(P<0.01)。結論提示，中藥復方III組對雞致病性大腸桿菌病有較好的治療效果。

雞 ； 大腸桿菌病 ； 中藥

雞大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的，主要表現(xiàn)有胚胎和幼雛的死亡、急性敗血癥、氣囊炎、心包炎、輸卵管炎、全眼球炎和大腸桿菌性肉芽腫等[1]。致病性大腸桿菌感染雞后，雞主要表現(xiàn)為精神委靡不振、采食減少、離群呆立或蹲伏不動、冠髯呈青紫色、眼虹膜呈灰白色、視力減退或失明、羽毛松亂、肛門周圍羽毛粘有綠色或黃白色稀糞、關節(jié)腫大、不愿動或跛行[2]。由于致病菌株的血清型多樣、致病機理復雜，使用滅活疫苗和亞單位疫苗進行免疫接種易導致接種失敗，常給養(yǎng)禽業(yè)造成無法估量的經(jīng)濟損失[3-4]。

現(xiàn)代研究表明，中藥中抑菌或抗菌的成分很多，可作用于細菌繁殖的不同階段和多個代謝環(huán)節(jié)，且不容易產(chǎn)生耐藥性，具有改變、抑制，甚至消除細菌的耐藥性作用[5]。本試驗在中獸醫(yī)學理論指導下，以不同的藥物為主配伍組方，對所擬方劑進行篩選，以期得到有較好療效的治療雞大腸桿菌病的中藥復方。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 選用來自同一養(yǎng)殖場的同一批1周齡健康三黃雞80只，均按要求進行免疫接種，飼喂不含任何添加劑及藥物的飼料，適應性飼養(yǎng)觀察至18日齡，選用正常雞進行試驗。

1.2 單味中藥提取液抑菌試驗

1.2.1 單味中藥提取液的制備 將十大功勞、黃芩、大黃、馬齒莧、地錦草、鬼針草等6味中藥各50 g。分別加入1 L水，浸泡30 min，煎煮1.5 h，過濾，收集濾液，藥渣再加入1 L水，煎煮40 min，過濾，收集濾液，藥渣再加入1 L水，煎煮30 min，過濾，收集濾液，合并3次濾液，100 ℃下蒸發(fā)濃縮至100 mL，再取50 mL第一次的濃縮液濃縮至25 mL，即分別制得單味藥材的提取液，提取液以1 000 r/min離心15 min，取上清液，在105 ℃下滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的制備 將菌株用劃線法接種到普通瓊脂平板上，37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，勾取單個菌落，用滅菌的生理鹽水稀釋校正菌液濁度至0.5麥氏單位，即菌液濃度為1.5×108CPU/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用[6]。

1.2.3 藥敏試驗 采用牛津杯法及藥敏紙片法對大腸桿菌進行藥敏試驗，觀察并測量抑菌圈大小，根據(jù)表1[7]記錄試驗結果。牛津杯法：采取無菌操作將滅菌的不銹鋼小管，放在培養(yǎng)基上，輕輕地加壓，使其與培養(yǎng)基之間零空隙，每個平板放4個，分別向各牛津杯中滴加一定數(shù)量的各種藥液，勿使其外溢，并標記各種中藥的名稱。藥敏紙片法：自制直徑6 mm的濾紙片藥敏紙片，高壓滅菌烘干并浸泡于中藥濃縮液中過夜，60 ℃烘干，無菌保存。

表1 中藥敏感性試驗的結果評定標準

1.3 中藥復方抑菌試驗

1.3.1 中藥復方提取液的制備 按表2中各復方配比稱取相應藥材，其總重量為120 g，然后加入2.4 L水，浸泡30 min，煎煮1.5 h，過濾，收集濾液，藥渣再加入2.4 L水，煎煮40 min，過濾，收集濾液，藥渣再加入2.4 L水，煎煮30 min，過濾，收集濾液，合并3次濾液，100 ℃下蒸發(fā)濃縮至240 mL，再取120 mL第一次的濃縮液濃縮至60 mL，分別制得5種中藥組合物的提取液，提取液以1 000 r/min離心15 min，取上清液在105 ℃下滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 中藥復方組成

1.3.2 藥敏試驗 采用牛津杯法進行中藥復方的藥敏試驗，觀察并記錄試驗結果，方法同1.2.3。

1.4 自擬中藥復方對人工感染雞大腸桿菌病的防治作用

1.4.1 模型建立 試驗雞胸肌注射大腸桿菌菌液0.3 mL/只[8](菌液濃度為1.5×108CFU/mL)，若雞出現(xiàn)精神遲鈍、垂翅、呆立、食欲減少、拉稀和呼吸困難；雞尸體剖檢后，心包膜和肝臟有淡黃色纖維素薄膜，很容易從臟器表面剝離，心臟壁變薄，心包液增多，有纖維素滲出，氣囊混濁等典型的特異性病變，并分離出相應的大腸桿菌[9]，即證明模型建立成功。

1.4.2 試驗分組與處理[10]試驗雞飼養(yǎng)到18日齡，檢查體況無異常現(xiàn)象后，將其隨機分為模型組、空白對照組、中藥復方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組、氨芐西林鈉對照組，每組10只。除空白對照組外，其余各組按0.3 mL/只，胸肌注射菌液。待雞只出現(xiàn)大腸桿菌病的典型癥狀以后，模型組、空白對照組灌服生理鹽水、陽性藥物組肌肉注射氨芐西林鈉，各中藥復方組分別灌服相應中藥復方提取液0.5 mL/只，每天2次，連用7 d，具體見表3。每天定時觀察并記錄雞只的精神狀況、飲食、糞便、死亡等臨床表現(xiàn)等。若試驗雞精神、飲食、排糞恢復正常，癥狀完全消失，即為治愈；若出現(xiàn)精神、飲食、排糞有好轉，癥狀明顯減輕，則為有效；若癥狀無好轉甚至死亡，剖檢有明顯的心包炎、肝周炎等典型大腸桿菌病變，即為無效[11]。

2 結果

2.1 單味中藥提取液對雞致病性大腸桿菌的抑菌效果 由表3可知，本試驗所選中藥對致病性大腸桿菌均有一定的抑菌效果，牛津杯法抑菌效果優(yōu)于藥敏紙片法，且濃度為1.0 g/mL的提取液抗菌效果較0.5 g/mL的提取液抗菌效果好。當濃度為1.0 g/mL時，大黃、地錦草的抑菌圈直徑分別為24 mm、22 mm，黃芩、十大功勞的抑菌圈直徑均為16 mm，說明雞致病性大腸桿菌對大黃、地錦草高度敏感；對黃芩、十大功勞中度敏感。

表3 單味中藥提取液對雞致病性大腸桿菌的抑菌效果

2.2 中藥復方對雞致病性大腸桿菌的抑菌效果 由表4可知，當提取液濃度為0.5 g/mL時，中藥復方Ⅲ、Ⅳ組對大腸桿菌的抑菌圈為20 mm，中藥復方Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ組大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為18 mm、16 mm、16 mm，說明大腸桿菌對中藥復方Ⅲ、Ⅳ高度敏感；對中藥復方Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ中度敏感；當提取液濃度為1.0 g/ml時，中藥復方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ抑菌圈直徑分別為18 mm、18 mm、19 mm、19 mm、19 mm，說明大腸桿菌對中藥復方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ中度敏感。根據(jù)抑菌圈大小綜合考慮，當提取液濃度為1.0 g/mL時，對大腸桿菌的抑制效果更好。

表4 中藥復方對雞致病性大腸桿菌的抗菌效果

2.3 自擬中藥復方對人工感染雞大腸桿菌病的治療效果

2.3.1 造模結果 造模5 d后試驗雞出現(xiàn)精神遲鈍、垂翅、呆立、食欲減少、拉稀和呼吸困難；尸體剖檢發(fā)現(xiàn)心包膜和肝臟有淡黃色纖維素薄膜，很容易從臟器表面剝離，心臟壁變薄，心包液增多，有纖維素滲出，肝臟質(zhì)地變脆、易碎，氣囊混濁增厚有淡黃色滲出物等病變；革蘭染色鏡檢觀察到大腸桿菌，并從肝臟、心臟分離出大腸桿菌，證明試驗造模成功。

2.3.2 治療結果 由表5可知，中藥復方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組治愈率分別為40%、62.5%、71.4%、44.4%、55.6%，死亡率分別為20%、25%、14.3%、44.4%、33.3%；模型組治愈率為11.1%，死亡率為66.7%，與模型組相比中藥復方組均有一定的治療作用，且中藥復方III組治愈率最高，死亡率最低，說明中藥復方III組治療雞大腸桿菌病效果較好。

3 分析討論

根據(jù)中獸醫(yī)及雞大腸桿菌病的“六淫辯證”理論，雞大腸桿菌病為濕邪致病。濕邪侵入機體使脾陽受困、脾失健運，久之則化熱而成濕熱之邪。脾主運化，喜燥惡濕，具有消化、吸收、運輸水濕的功能，脾運化水濕功能失常就會導致水濕停滯形成內(nèi)濕，水濕停留于腸道形成腹瀉。雞大腸桿菌主要臨床癥狀中，熱邪結于腸可見拉黃色或綠色稀糞，熱邪傷肝可見肝臟表面散布多量針頭大的壞死點，熱邪侵害心臟包膜，表現(xiàn)為纖維素性心包炎。因此，濕熱壅積是雞大腸桿菌病的主要病機和基本證候類型。

根據(jù)雞大腸桿菌病的中獸醫(yī)辨證，治療時宜采用清熱解毒、燥濕止痢藥為主藥，所以方中選用黃芩、大黃、十大功勞、馬齒莧、地錦草、鬼針草等具有清熱解毒、清熱燥濕、涼血止痢的藥物。本試驗結果表明，黃芩、大黃、十大功勞、馬齒莧、鬼針草、地錦草等清熱解毒藥均有一定的抗大腸桿菌作用，其中大黃、地錦草抗菌效果較好。此外，患病雞抵抗力較差，下痢后易脫水，加之前面使用大苦大寒類的清熱藥易傷脾胃，耗損津液，所以在清熱的同時應輔以健脾胃、養(yǎng)陰涼血的藥物，所以添加白術、地黃作為輔藥，白術的主要功效是健脾益氣，燥濕利水；地黃的主要功效是清熱涼血，生津潤燥。試驗結果顯示，各中藥復方組在體外均有一定的抗菌效果，但Ⅲ組、Ⅳ組的抗菌效果最好。因此，清熱藥、祛濕藥、補虛藥是治療雞大腸桿菌病時遣方用藥的關鍵，認為在實際應用中這些藥能取得良好的治療效果。所以試驗將上述中藥按不同比例組成五個中藥復方組，分別給雞灌服進行體外抑菌試驗，期望為臨床治療該病提供良好的理論基礎。

根據(jù)前人研究表明，不同品種、不同日齡的雞對雞大腸桿菌的敏感性不一樣，國內(nèi)常用1～28日齡的海藍褐蛋雞、三黃雞、AA肉雞等用于試驗，本試驗選用18日齡的三黃雞作為試驗動物。蔡玉梅等[12]通過皮下注射的方式將O1、O2、O78菌種混合液接種于12日齡雛雞，發(fā)現(xiàn)在菌液、接種途徑、雞日齡等不變的情況下，1.5×108CFU/mL和1.8×108CFU/mL 2個劑量組能夠引起雞發(fā)病率達到100%，死亡率分別為83%和93%。當前，國內(nèi)外學者主要攻毒途徑有腹腔注射、胸肌注射、氣囊接種。周秀紅等[13]研究了不同接種途徑對人工誘發(fā)雞大腸桿菌病的影響，結果發(fā)現(xiàn)，胸肌注射的致病性最強，其次是皮下注射。結合前人研究結果，將分離到的雞大腸桿菌復壯后按1.5×108CFU/mL的濃度給雞進行胸肌注射，注射第5天時，發(fā)現(xiàn)雞只拉稀，精神極度沉郁，并出現(xiàn)死亡，證明造模成功。在造模成功的基礎上，給試驗雞灌喂試驗所選中藥復方，試驗結果表明，與模型組比較，各給藥組均有一定的治療效果，但中藥復方Ⅲ組治愈率為71.4%，死亡率為14.3%，效果較其他組好。

中藥復方Ⅲ組中十大功勞瀉熱退火，地錦草清熱解毒，利濕退黃，鬼針草清熱解毒，共為君藥。黃芩清肺，肺清則通調(diào)水道，而濕熱下逐，腸肺復其燥金之氣；大黃取其清熱瀉火、解毒作用，并借通便作用，使熱毒下泄，共為臣藥。白術的主要功效是健脾益氣，燥濕利水；地黃的主要功效是清熱涼血，生津潤燥，共為佐使藥。諸藥合用體現(xiàn)中獸醫(yī)整體觀念，辨證論治的基本原則，使遣方用藥更有依據(jù)可循，也為中獸藥治療雞大腸桿菌病提供了一定的理論基礎。

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《中國獸醫(yī)雜志》編輯部

Screening of Chinese medicine compound for preventing and treating colibacillosis in chicken

CAO Li-jing1， YUAN Li-hua1， LIAO Kai-yan2

(1.Rongchang Vocational Education Center of Chongqing，Chongqing 402460，China; 2.Rongchang junior school of Chongqing，Chongqing 402460，China)

In order to obtain a better curative effect of traditional Chinese medicine compound for treating colibacillosis of chicken.Based on the theory of veterinary medicine, this test developed five Chinese medicine prescriptions and the antibacterial effect would be evaluated in vivo and in vitro. In vitro,the method of Oxford cup was used to measure the diameter of antibacterial circle of the single herb and Chinese herbal compound to evaluate the antimicrobial effect. in vivo, the five traditional Chinese medicine compound were screened by chicken colibacillosiscaused by artificial Infection.The Results showed that the antibacterial effect of 1.0 g/mL was better than 0.5 g/mL, when the concentration of the extract was 1.0 g/mL, Escherichiacoliwas highly sensitive to Rhubarb and Humifusa Euphorbia, and was mild sensitive to Scutellaria and Chinese Mahonia, and traditional Chinese medicine compound I, II, III, IV and V. The clinical test results showed that the traditional Chinese medicine compound group III had better effect to chicken，its cure rate and mortality rate were 71.4% and 14.3%,while the model group，s cure rate was 11.1% and mortality rate was 66.7%,between them the difference was significant(P<0.01). It concluded that the traditional Chinese medicine compound group III had a better therapeutic effect on Chicken Colibacillosis.

chicken ; colibacillosis ; traditional Chinese Medicine

2017-02-17

曹禮靜(1972-)，男，研究員，碩士，從事中職畜牧獸醫(yī)教學和研究及教育管理研究， E-mail：caoLij888@126.com

S853.72

A

0529-6005(2017)07-0066-04