Keggin型硅鎢酸鹽K4[α—SiW12O40]·17H2O體外抗腫瘤活性研究

陳夢+高瑩雪++于娜+王曉曉++范美田++薛瑩雪

[摘要]目的 合成Keggin型硅鎢酸鹽K4[α-SiW12O40]·17H2O（簡稱KSiW12），研究其體外抗腫瘤活性。方法 通過IR、UV等表征手段對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽（3-[4，5-dimethylthiazo-2-y]-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）比色法分析KSiW12對人肝癌細(xì)胞（HepG2）以及人肺癌細(xì)胞（A549）的增殖抑制活性。采用光學(xué)顯微鏡觀察兩種腫瘤細(xì)胞在不同濃度藥物作用后的形態(tài)變化。結(jié)果 Keggin型硅鎢酸鹽KSiW12對兩種腫瘤細(xì)胞均有增殖抑制作用，具有藥物濃度依賴性，對兩種腫瘤細(xì)胞的IC50值分別為（7.5×10-5±3.2）mol/L和（1.7×10-4±3.8）mol/L。光學(xué)顯微鏡下經(jīng)藥物作用后的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、縮小等形態(tài)變化。結(jié)論 硅鎢酸鹽KSiW12具有體外抗腫瘤活性，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

[關(guān)鍵詞]Keggin型；硅鎢酸鹽；抗腫瘤；體外研究

[中圖分類號] R961 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）07（c）-0081-05

Study of anti-tumor activity in vitro of Keggin-type Silicotungstate K4[α-SiW12O40]·17H2O

CHEN Meng1 GAO Ying-xue2 YU Na1 WANG Xiao-xiao1 FAN Mei-tian1 XUE Ying-xue1▲

1.College of Pharmacy，Jilin Medical University，Jilin Province，Jilin 132013，China；2.College of Inspection，Jilin Medical University，Jilin Province，Jilin 132013，China

[Abstract]Objective To synthesize Keggin-type silicotungstate K4[α-SiW12O40]·17H2O （abbreviated form：KSiW12），and to study the in vitro anti-tumor activity.Methods The structure of KSiW12 was characterized by IR and UV.The inhibitory effect of KSiW12 on the growth of human hepatoma HepG2 cells and lung cancer A549 cells was studied by MTT（3-[ 4，5-dimethylthiazo-2-y]-2，5-diphenyltetrazolium bromide） assay.The morphological change in tumor cells affected by different concentration of drugs was observed by optical microscopes.Results KSiW12 could inhibited HepG2 and A549 cells proliferation，showing dose-dependent，with IC50 value of （7.5×10-5±3.2）mol/L and （1.7±10-4×3.8）mol/L，respectively.The morphological changes in tumor cells showed shrinking of cells and round cells under an optical microscope after treating with different concentrations of KSiW12.Conclusion KSiW12 can inhibit tumor cells growth.

[Key words]Keggin-type；Silicotungstate；Anti-tumor；Study in vitro

惡性腫瘤是危害人類生命健康的一種疾病，藥物治療在惡性腫瘤的治療中占有重要地位。目前臨床使用的多數(shù)抗腫瘤化學(xué)藥物具有效率低、選擇性差、毒副反應(yīng)大及腫瘤細(xì)胞耐藥等缺點(diǎn)，因此，研究開發(fā)高效、低毒的抗腫瘤藥物乃當(dāng)務(wù)之急。

多酸又稱為聚金屬氧酸鹽（POM），由含氧酸鹽經(jīng)縮合脫水形成，是一類金屬-氧簇合物，是由d0組態(tài)的過渡金屬離子，如鉬（MoⅥ），鎢（WⅥ），釩（VⅤ），鈮（NdⅤ），鉭（TaⅤ）等與氧原子高度聚合形成的具有空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的無機(jī)高分子聚合物[1]。由于多酸具有許多特殊的性質(zhì)，如體積大，熱穩(wěn)定性高，能傳遞并儲存電子，分子量較高，晶格氧可以遷移以及電子結(jié)構(gòu)多樣性，使得其在催化、光學(xué)、磁學(xué)、醫(yī)藥、材料科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[2-5]。近年來，多酸在抗病毒[6-7]、抗腫瘤[8-11]、抗菌[12]等方面的研究迅速地發(fā)展起來并取得顯著成就，其中Keggin型結(jié)構(gòu)的雜多酸鹽因其特異的結(jié)構(gòu)特征和較強(qiáng)的接受和轉(zhuǎn)移電子能力，具有較好的抗腫瘤、抗病毒作用[13-14]。本研究參照文獻(xiàn)[15]合成Keggin型結(jié)構(gòu)的硅鎢酸鹽化合物K4[α-SiW12O40]·17H2O，選擇人肝癌細(xì)胞（HepG2）以及人肺癌細(xì)胞（A549）對其增殖抑制活性進(jìn)行研究。

1資料與方法

1.1儀器和試劑

IMPACT 400 FTIR型紅外光譜儀（KBr壓片）（美國NICOLET公司）；UV-1601PC型紫外分光光度計(jì)（日本SHIMADZU公司）；TDZ5-WS型低速離心機(jī)（湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；HF90型CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；XDS1C型倒置生物顯微鏡（上海萬衡精密儀器有限公司）；SW-CJ-1B型超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣有限公司）；680型酶標(biāo)儀（美國BIORAD公司）；MH-2型微量振蕩器（其林貝爾儀器制造有限公司）。

胰蛋白酶、DMSO、MTT（美國Sigma公司），胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基（GIBCO公司），雙抗（青霉素鈉、硫酸鏈霉素）（西安制藥公司）。K4[α-SiW12O40]·17H2O采用1640培養(yǎng)液溶解，配制成濃度為10-2 mol/L的母液，0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后-20℃保存。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌細(xì)胞（HepG2）以及人肺癌細(xì)胞（A549）（美國ATCC細(xì)胞庫）培養(yǎng)于含10%小牛血清及青霉素（100 U/ml）和鏈霉素（100 U/ml）的RPMI 1640培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法分析細(xì)胞增殖力

取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度為105個/ml，按200 μl/孔加入到96孔培養(yǎng)板中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將腫瘤細(xì)胞分成空白對照組和實(shí)驗(yàn)組，吸出培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組每孔加入藥物溶液200 μl（藥物的終濃度為10-5、10-4、2.5×10-4、5×10-4、10-3、2.5×10-3 mol/L），空白對照組每孔加入200 μl的1640培養(yǎng)液。每個濃度及對照均設(shè)3個復(fù)孔，放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入MTT試劑20 μl/孔，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h使得MTT還原成為甲瓚。培養(yǎng)終止時，棄去上清液，加入DMSO 150 μl/孔，在微量振蕩器上振蕩10 min使甲瓚完全溶解，放入到酶標(biāo)儀中，測定570 nm處的吸光值（OD值）。藥物對腫瘤細(xì)胞增殖抑制率的計(jì)算公式為：增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對照組OD值）×100%，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

1.4腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，去上清液，將細(xì)胞分成空白對照組和實(shí)驗(yàn)組（藥物的終濃度為10-5、10-4、2.5×10-4、5×10-4、10-3、2.5×10-3 mol/L），培養(yǎng)24 h后，將實(shí)驗(yàn)組與空白對照組于倒置顯微鏡下觀察不同濃度藥物對腫瘤細(xì)胞的影響，從生長抑制、細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行評估。

2結(jié)果

2.1紅外光譜

利用傅立葉紅外光譜儀對硅鎢酸鹽KSiW12進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，圖1為KSiW12的紅外譜圖。從圖中可以看出，KSiW12在1020、980、925、892、878、780、553、538、474、413 cm-1處有吸收峰。

圖1 KSiW12的紅外譜圖

2.2紫外光譜

利用紫外分光光度計(jì)對硅鎢酸鹽KSiW12的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步確定，圖2為KSiW12的紫外譜圖，從圖中可以看出，KSiW12在200、260 nm處有吸收峰。

2.3不同濃度的KSiW12對腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

分別采用不同濃度10-5、10-4、2.5×10-4、5×10-4、10-3、2.5×10-3 mol/L的KSiW12處理腫瘤細(xì)胞，研究不同濃度的KSiW12對腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。處理24 h后，空白對照組的腫瘤細(xì)胞緊貼瓶底，生長密集，細(xì)胞間連接緊密，呈現(xiàn)規(guī)則的多邊形，圓形細(xì)胞少。而經(jīng)過藥物KSiW12處理的腫瘤細(xì)胞，隨著藥物濃度的升高，由平滑的、有規(guī)則的形狀逐漸變圓，出現(xiàn)皺縮、縮小等形態(tài)變化，并且增殖數(shù)目明顯減少，細(xì)胞密度降低（圖3、圖4）。

2.4 MTT比色法分析腫瘤細(xì)胞增殖抑制率

由于活細(xì)胞的線粒體具有還原MTT形成紫色化合物的能力，該化合物在570 nm波長下有強(qiáng)吸收。細(xì)胞死亡或增殖功能下降時，還原MTT的能力下降，570 nm波長下吸光度值會降低。研究不同濃度的KSiW12對兩種腫瘤細(xì)胞（人肝癌細(xì)胞HepG2以及人肺癌細(xì)胞A549）的增殖抑制效果，MTT比色法檢測的結(jié)果如圖5、圖6所示。

從圖中可以看出，硅鎢酸鹽KSiW12對HepG2和A549細(xì)胞均有明顯的增殖抑制作用，并且隨著藥物濃度的增加，抑制率也相應(yīng)地有所增大，具有藥物濃度依賴性。隨著藥物作用時間的增長，KSiW12對HepG2和A549細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，藥物作用12 h時，最高抑制率分別為（84.0±2.2）%和（80.5±3.4）%；24 h時，最高抑制率分別為（89.0±2.5）%和（89.8±2.8）%；在藥物作用48 h時，最高抑制率達(dá)到最大，分別為（90.1±3.3）%和（94.2±2.4）%，IC50值分別為（7.5×10-5±3.2）mol/L和（1.7×10-4±3.8）mol/L，提示硅鎢酸鹽KSiW12具有體外抗腫瘤活性。

3討論

多酸的組成元素多樣，從Mo、W、V等基本組成元素拓展到涵蓋周期表中的70多種元素，并且結(jié)構(gòu)種類繁多，主要有Keggin型、Dawson型、Silverton型、Ande？鄄rson型等結(jié)構(gòu)，形成了結(jié)構(gòu)多樣的化合物，其對體內(nèi)外病毒和腫瘤均表現(xiàn)出較高的抑制活性[16]。

本研究利用紅外光譜和紫外光譜對KSiW12進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，從紅外表征結(jié)果可以看出，KSiW12的紅外吸收峰與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，并且在1000～700 cm-1范圍內(nèi)，980、925、878、780 cm-1處的吸收峰分別歸屬于W=Od鍵、Si-O鍵、W-Ob-W鍵和W-Oc-W鍵的特征峰[17]，是Keggin型結(jié)構(gòu)雜多酸鹽的紅外特征吸收峰。從紫外表征結(jié)果可以看出，KSiW12的紫外吸收峰200 nm和260 nm分別歸屬于W=O鍵和W-O-W鍵的特征吸收峰，是Keggin型結(jié)構(gòu)雜多酸鹽的紫外特征吸收峰[17]。以上結(jié)果說明KSiW12具有Keggin型結(jié)構(gòu)，為所要合成的目標(biāo)化合物。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及光學(xué)顯微鏡下腫瘤細(xì)胞形態(tài)變化結(jié)果均說明，不同濃度的KSiW12作用于腫瘤細(xì)胞后，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，在光學(xué)顯微鏡下，腫瘤細(xì)胞逐漸出現(xiàn)變圓、皺縮等形態(tài)變化，細(xì)胞密度逐漸減少，并呈藥物濃度依賴性；而Keggin型雜多陰離子的抗腫瘤機(jī)制主要基于氧化還原反應(yīng)，即腫瘤細(xì)胞表面一部分區(qū)域?qū)VI還原為WV，同時，腫瘤細(xì)胞表面的另一部分區(qū)域再氧化WV到WVI，腫瘤細(xì)胞在氧化還原的循環(huán)過程中被殺死[18-19]。由于腫瘤細(xì)胞和硅鎢酸鹽的作用過程比較復(fù)雜，抗腫瘤作用的具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，KSiW12對人肝癌細(xì)胞（HepG2）以及人肺癌細(xì)胞（A549）均有增殖抑制作用，具有藥物濃度依賴性，IC50值分別為（7.5×10-5±3.2）mol/L和（1.7×10-4±3.8）mol/L，半數(shù)有效濃度較小，具有進(jìn)一步研究價值。光學(xué)顯微鏡下觀察到，隨著藥物濃度的增加，腫瘤細(xì)胞逐漸出現(xiàn)變圓、皺縮、縮小等形態(tài)變化，并且細(xì)胞密度逐漸減少，提示硅鎢酸鹽KSiW12具有體外抗腫瘤活性，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，這為今后多酸藥物在腫瘤治療方面的研究應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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（收稿日期：2017-05-24 本文編輯：祁海文）