ABO疑難血型鑒定中應(yīng)用PCR—SSP法的探討

鐘勝英

[摘要]目的 對ABO疑難血型鑒定中應(yīng)用PCR-SSP法的臨床價值進(jìn)行探討。方法 選取2015年1月～2016年12月我院收治的225例ABO疑難血型受試者，分別給予PCR-SSP法和血清學(xué)定型方法進(jìn)行檢測，對比相關(guān)數(shù)據(jù)差異。結(jié)果 PCR-SSP法與血清學(xué)定型方法的檢測結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 PCR-SSP法在ABO疑難血型鑒定中臨床應(yīng)用價值高，值得臨床輸血工作者關(guān)注。

[關(guān)鍵詞]ABO血型；血清學(xué)定型；聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物法

[中圖分類號] R457.11 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）07（c）-0113-03

Application of PCR-SSP method in the identification of suspicious ABO blood group

ZHONG Sheng-ying

Department of Blood Transfusion，Xingning People′s Hospital of Guangdong Province，Xingning 514500，China

[Abstract]Objective To explore the clinical value of PCR-SSP in the identification of suspicious ABO blood group.Methods 225 cases of suspicious ABO blood type subjects admitted by our hospital from January 2015 to December 2016 were selected and respectively tested by the PCR-SSP and serological typing methods.The relevant data differences were compared.Results The results of PCR-SSP and serological typing methods were compared and the differences were statistically significant （P<0.05）.Conclusion The PCR-SSP method has high clinical value in the identification of suspicious ABO blood group and it is worth the attention of clinical transfusion workers.

[Key words]ABO blood group；Serological typing；PCR-SSP

早在1900年ABO血型系統(tǒng)對于臨床輸血治療過程中所具有的重要指導(dǎo)意義就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，并得到廣泛性的認(rèn)可。ABO血型的標(biāo)準(zhǔn)血清學(xué)正反定型方法，在實(shí)際應(yīng)用過程中由于其具有操作方法、簡單、實(shí)用的特點(diǎn)，在臨床上被廣泛應(yīng)用。但是，需要注意的是，血清學(xué)試驗(yàn)的局限性已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，它受生理學(xué)、病理學(xué)等諸多因素影響的可能性較大，使正反定型不符情況發(fā)生[1]。近幾年經(jīng)大量研究與實(shí)踐證實(shí)，基因分型手段，在某一程度上能夠充分地克服血清學(xué)試驗(yàn)在實(shí)際應(yīng)用中所具有的上述弱點(diǎn)，其作為血清學(xué)補(bǔ)充方法之一，為臨床輸血治療、親子鑒定、個體識別提供了依據(jù)[2]。本次研究中，筆者以225例ABO疑難血型受試者作為考察對象，分析探討ABO疑難血型鑒定中應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物法（PCR-SSP）的臨床價值，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2015年1月～2016年12月我院收治的225例ABO疑難血型受試者作為研究對象，其中男性117例，女性108例；年齡6個月～78歲，平均（45.6±10.3）歲；均符合ABO疑難血型受試者診斷標(biāo)準(zhǔn)；研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核及同意；本人或家屬均知曉本研究情況并簽署同意書；排除存在血液系統(tǒng)疾病者，依從性較差者，罹患系統(tǒng)性疾病者。

1.2研究方法

血清學(xué)：篩選紅細(xì)胞、抗A、抗B標(biāo)準(zhǔn)血清、ABO試劑紅細(xì)胞、譜細(xì)胞均由上海市血液中心提供?？贵w篩選以及抗體鑒定采取間接抗人球法，ABO血型鑒定經(jīng)試管法鹽水正反定型。

DNA經(jīng)鹽酸胍提取。鹽酸胍溶液可以對細(xì)胞產(chǎn)生一定的裂解作用，使蛋白質(zhì)在短時間內(nèi)發(fā)生變性，使DNA與硅膠模之間的結(jié)合速度加快，經(jīng)過清洗、洗脫等處理之后，可以最終獲得相應(yīng)的DNA。

采用PCR-SSP法檢測，PCR反應(yīng)體系10 μl，其中0.1 μl Taq酶（5 U/μl），0.9 μl DNA（30 ng/μl），9 μl dNTP-Buffer工作液。PCR擴(kuò)增，選擇美國PE9700型PCR擴(kuò)增儀，擴(kuò)增的基本條件設(shè)定為：96℃ 2 min；96℃ 20 s，68℃ 60 s，循環(huán)5次；96℃ 20 s，65℃ 45 s，72℃ 30 s，循環(huán)10次；96℃ 20 s，62℃ 45 s，72℃ 30 s，循環(huán)15次；72℃ 3 min；4℃條件下進(jìn)行保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：將PCR反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至2.5%瓊脂榶凝膠孔中，在140～150 V的條件下，實(shí)施電泳處理，處理時間控制在15～20 min，觀察結(jié)構(gòu)，判斷有無特異性條帶，與結(jié)果分型表進(jìn)行比對之后得出具體的血型檢測結(jié)果。

1.3觀察指標(biāo)

觀察對比經(jīng)PCR-SSP法與血清學(xué)定型方法檢測出的結(jié)果差異。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對兩種方法血清學(xué)定型檢測結(jié)果差異進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

采用血清學(xué)方法，定型結(jié)果為A型的受試者63例；采用PCR-SSP法，受試者的具體基因型結(jié)果為：A1O1型42例，A1O2型48例，A2O1型12例，A2O1型15例，A1A2型6例，A1A1型3例。兩種方法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.021，P=0.000）；采用血清學(xué)方法，定型結(jié)果為B型的受試者66例；采用PCR-SSP法，受試者的具體基因型結(jié)果為：BO1型15例，BO2型21例，BB型9例。兩種方法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.854，P=0.002）；采用血清學(xué)方法，定型結(jié)果為O型的受試者12例；采用PCR-SSP法，受試者的具體基因型結(jié)果為：O1O1型3例，O1O2型0例。兩種方法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.672，P=0.043）。采用血清學(xué)方法，定型結(jié)果為AB型的受試者84例；采用PCR-SSP法，受試者的具體基因型結(jié)果為：A1B型27例，A2B型24例。兩種方法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.304，P=0.000）。

3討論

輸血前標(biāo)本采集的正確性、規(guī)范化操作是保證ABO血型鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性、輸血安全有效的根本保證。血液標(biāo)本會受到生理、病理、采集、治療等諸多因素的影響，進(jìn)而造成ABO血型鑒定出現(xiàn)困難[3]。

ABO疑難血型多表現(xiàn)出以下幾點(diǎn)：①正定型與反定型結(jié)果不符；②弱凝集，+/-判斷困難；③血型“改變”，兩次定型的結(jié)果不符；④與ABO“同型血”，交叉配血不匹配；⑤與ABO“同型血”交叉配血“相合”，在輸血過程中卻發(fā)生了輸血反應(yīng)；⑥與ABO“同型血”交叉配血相合，在輸血過程中無反應(yīng)，但是Hb升高值并未達(dá)到預(yù)期效果[4-7]。曾有學(xué)者指出，針對疑難血型標(biāo)本，進(jìn)一步展開不規(guī)則抗體篩查、吸收放散、唾液血型物質(zhì)凝集抑制試驗(yàn)的意義重大，經(jīng)上述手段多可以對抗-M、抗-P1以及非特異性冷凝集等意外抗體產(chǎn)生ABO血型鑒定困難等諸多問題[8-9]。遇到特殊情況，譬如說紅細(xì)胞被自身抗體致敏、ABO亞型、表型被疾病等因素干擾等在應(yīng)用血清學(xué)方法的檢測血型結(jié)果出現(xiàn)困難時，開展分子生物學(xué)基因分型檢測，能夠?qū)ρ团袛嗵峁┛煽康膮⒖家罁?jù)，為一項(xiàng)不可或缺的輔助手段，目前已經(jīng)引起人們的重視。近期有學(xué)者指出，對ABO疑難血型進(jìn)行鑒定的過程中，在傳統(tǒng)血清學(xué)鑒定技術(shù)基礎(chǔ)上，與ABO基因分型檢測技術(shù)相結(jié)合，可以快速、簡便、準(zhǔn)確地對疑難ABO血型進(jìn)行鑒定，并且不會受到自身抗體的干擾，不需要重復(fù)采取，無家系調(diào)查必要，可不考慮是否是分泌型，能夠順利解決疑難血型鑒定等問題，對傳統(tǒng)血清學(xué)鑒定技術(shù)的缺陷有彌補(bǔ)作用，值得關(guān)注[10-12]。

相關(guān)領(lǐng)域近年來所進(jìn)行的研究結(jié)果證實(shí)，采用血清學(xué)方法對ABO血型進(jìn)行鑒定的過程中，主要利用血型抗原和抗體，針對實(shí)際工作中所遇到的一些疑難的血型鑒定者，可以根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)?shù)卦黾舆M(jìn)行吸收放散試驗(yàn)、唾液定型檢測等，抗原、抗體在不同亞型或一些疾病中，通常情況下會表現(xiàn)出一定的強(qiáng)化狀態(tài)，使血型判斷的難度增加，使結(jié)果判斷具有較大主觀性，且鑒定結(jié)果還有可能受到試劑質(zhì)量的影響。經(jīng)研究與實(shí)踐證實(shí)，DNA不會受到以上因素的影響，實(shí)驗(yàn)顯示，ABO基因座位由7個外顯子組成，其中第4、7外顯子編碼的氨基酸序列對A、B轉(zhuǎn)移酶特異性產(chǎn)生了決定性作用，目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ABO亞型基因序列達(dá)到30種以上，具有序列多態(tài)性的等位基因構(gòu)成了ABO血型分子生物學(xué)分型的基礎(chǔ)[13-15]。

曾有文獻(xiàn)報道，造成ABO血型鑒定不相符的影響因素包括：①血型鑒定技術(shù)因素。定性試劑血清失效，或者是紅細(xì)胞懸液、試劑血清、鹽水被細(xì)菌污染，或者是加血標(biāo)本的過程中發(fā)生交叉污染，技術(shù)人員并沒有嚴(yán)格的按照操作規(guī)程展開相應(yīng)試驗(yàn)，如：試管中未加入定型試劑血清，加錯血標(biāo)本；患者紅細(xì)胞懸液濃度過低；離心操作時間過短；沒有進(jìn)行反定型，僅通過肉眼對結(jié)果進(jìn)行觀察；在血型抗原性減弱的情況下，微弱細(xì)小凝集并未被發(fā)現(xiàn)；試管沒有進(jìn)行標(biāo)記，在離心完成后，試管拿錯，造成張冠李戴現(xiàn)象的發(fā)生；沒有正確對血型鑒定結(jié)果進(jìn)行解釋和記錄，將ABO定型試劑血清的“抗A或者是抗B血清”被誤認(rèn)為是A型或者是B型血清，并未認(rèn)識到在試驗(yàn)過程中，溶血現(xiàn)象同樣是陽性反應(yīng)，進(jìn)而造成結(jié)果判斷失誤。②患者血清或者是紅細(xì)胞因素。血型抗體減弱或缺乏會造成ABO血型正反定型不符情況，如：老年人群的血清抗體效價相對較低，新生兒的血清中ABO抗體一般呈現(xiàn)為陰性或者是很弱，因此，多不會對嬰兒展開ABO反定型。對于白血病患者而言，其多合并低病種球蛋白血癥，淋巴瘤患者會合并出現(xiàn)低丙種球蛋白血癥，免疫抑制劑的應(yīng)用會造成低丙種球蛋白血癥的出現(xiàn)，一些免疫缺陷患者，血清中ABO抗體與紅細(xì)胞抗原不一致，因此會對血型鑒定結(jié)果產(chǎn)生影響。曾有研究指出，紅細(xì)胞抗原性減弱或者是缺乏會造成ABO血型正反定型不符情況發(fā)生，譬如說A或者是B亞型。白血病患者以及一些惡性腫瘤患者的紅細(xì)胞A或者是B抗原性減弱[16]。

采用PCR-SSP技術(shù)對ABO血型的具體基因型情況進(jìn)行監(jiān)測，主要是利用ABO基因中所存在的突變位點(diǎn)上，所攜帶的核苷酸具有一定的差異性，設(shè)計(jì)一序列具有較強(qiáng)特異性的引物，對ABO血型基因的DNA片段進(jìn)行直接的擴(kuò)增處理，對ABO血型以及亞型進(jìn)行檢測。本次研究發(fā)現(xiàn)，相對于血清學(xué)方法，PCR-SSP能夠使血清學(xué)鑒定只能鑒定表現(xiàn)型的局限性得到克服，研究結(jié)果提示，PCR-SSP法與血清學(xué)定型方法的檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這一結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)[17-18]報道結(jié)果相似。

綜上所述，PCR-SSP法在ABO疑難血型鑒定中的應(yīng)用價值較高，在臨床輸血工作中可對其給予廣泛應(yīng)用，不僅能夠明確ABO血型，還能準(zhǔn)確診斷A1O1、A1O2、A2O1、A2O2、A1A2、A1A1、BO1、BO2、BB、O1O1、 O1O2、A1B、A2B等分布情況，經(jīng)基因檢驗(yàn)均可以對血型進(jìn)行確定，同型輸血效果較為理想。

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（收稿日期：2017-05-11 本文編輯：任 念）