天然生物活性N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯小分子抗原的化學(xué)合成及其抗體生成初探

付凱飛，王欲曉，李 軍，吳成林，周麗君

天然生物活性N-?；呓z氨酸內(nèi)酯小分子抗原的化學(xué)合成及其抗體生成初探

付凱飛，王欲曉，李 軍，吳成林，周麗君

目的人工合成N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acylated homoserine lactones，N-aHSLs)完全抗原并制備相應(yīng)單抗，建立N-aHSLs免疫檢測的新方法及海洋弧菌N-aHSLs動態(tài)監(jiān)測。方法以月桂酸和高絲氨酸內(nèi)酯為主要原料，通過多步系列化學(xué)反應(yīng)人工合成N-十二酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-lauroyl-homoserine lactone，N-C12-HSL)及含羧基活性交聯(lián)基團的半抗原衍生物12-羧基-N-十二酰高絲氨酸內(nèi)酯(12-carboxyl-N-decanoyl-L-homoserine lactone，12-CD-LHL)，用1H-磁共振、高壓/效液相色譜儀和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法確證合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，并用生物感應(yīng)法檢測合成N-aHSLs的天然生物活性；用N-羥基琥珀酰亞胺活潑酯法將12-CD-LHL半抗原衍生物連接到載體蛋白；將N-C12-HSL人工完全抗原通過傳統(tǒng)單抗制備技術(shù)，獲得抗N-aHSLs雜交瘤細胞株，用酶聯(lián)免疫吸附測定法鑒定其特異性和效價。結(jié)果質(zhì)譜、磁共振氫譜分析結(jié)果與理論預(yù)測相同，成功合成目標產(chǎn)物N-C12-HSL和12-CD-LHL半抗原衍生物；所合成的N-aHSLs能夠分別激活生物感應(yīng)菌株大腸桿菌MG4和紫色色桿菌026并使之顯色；紫外吸收光譜掃描結(jié)果顯示，半抗原已分別與牛血清白蛋白和卵清蛋白發(fā)生偶聯(lián)，成功制備完全抗原；共獲得3株抗N-C12-HSL單抗，均具有良好的免疫反應(yīng)性。結(jié)論N-aHSLs完全抗原和相應(yīng)的單抗制備為N-aHSLs動態(tài)監(jiān)測和后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

N-十二酰高絲氨酸內(nèi)酯；半抗原衍生物；單抗

菌群感應(yīng)(quorum sensing，QS)信號分子是細菌產(chǎn)生的一種菌體細胞與細胞間的通訊工具，即細菌通過可擴散的信號分子感知菌群的密度，從而引起一些特定基因在細菌群體中的表達。QS信號分子主要包括具有不同?；鶄?cè)鏈的N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯(N-acylated homoserine lactones，N-aHSLs)、一些小肽以及自體誘導(dǎo)子，其中N-aHSLs是大多數(shù)革蘭陰性細菌產(chǎn)生的QS信號分子，也是近年來的研究熱點。大量研究表明，細菌感染致病機制與QS系統(tǒng)的調(diào)控密切相關(guān)?；【撬h(huán)境中分布最多的細菌，課題組及前期研究的文獻資料表明，部分亞群可導(dǎo)致人類發(fā)生嚴重感染[1-3]。N-aHSLs是海洋弧菌產(chǎn)生的一類重要QS信號分子[4-6]，這些N-aHSLs可通過海洋弧菌QS系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)控作用，參與調(diào)控生物膜的形成、細菌毒力因子釋放等許多生理特性，抑制或干擾細菌產(chǎn)生N-aHSLs是目前緩解細菌耐藥、減弱細菌致病力等感染治療的重要途徑。因此，隨著對細菌QS領(lǐng)域研究的深入，對于信號分子N-aHSLs的檢測和分析研究也越來越引起人們的關(guān)注。

目前，關(guān)于檢測N-aHSLs信號分子的方法主要有物理學(xué)方法和生物傳感器測定法。物理學(xué)方法一般使用高效液相色譜技術(shù)來檢測，同時還可以通過連接質(zhì)譜、磁共振或紅外光譜來鑒定其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)[7]；生物傳感器測定法需構(gòu)建突變菌株，通過外源信號分子啟動其報告基因的轉(zhuǎn)錄表達，進而檢測其活性[8-9]。這2種方法操作復(fù)雜，重復(fù)性差，耗時、耗力，檢測費用昂貴，不適于連續(xù)測定和現(xiàn)場監(jiān)測?；趩慰棺鳛橐环N特異性強、靈敏度高、反應(yīng)快速的經(jīng)典生物醫(yī)學(xué)檢測試劑，目前已廣泛應(yīng)用于免疫組織化學(xué)、酶聯(lián)免疫吸附測定及流式細胞檢測等技術(shù)。因此，研制N-aHSLs的單抗，建立相應(yīng)的N-aHSLs快速免疫診斷方法，成為目前N-aHSLs分析測定的新選擇。

目前，已有研究制備出針對3-氧-N-癸酰高絲氨酸內(nèi)酯和N-辛酰高絲氨酸內(nèi)酯的單抗，并揭示了這些特異性抗體的潛在臨床免疫診治價值[10]。但現(xiàn)有針對N-aHSLs分子的單抗種類很少且尚局限于實驗室研究階段，故在N-aHSLs的免疫分析領(lǐng)域還有很大的探究空間，這也是課題組研究目前對接的方向。此外，由于N-aHSLs天然存在量極少，且不穩(wěn)定，故采用常規(guī)天然提取方法較難獲得；而既往采用人工方法合成N-aHSLs時，往往不能兼顧保留其天然生物活性，具備天然免疫活性又是獲得高親和力N-aHSLs抗體所必需的。因此，合成獲得具有天然活性的N-aHSLs，制備出高靈敏、特異的單抗，仍然具有很大的挑戰(zhàn)性，國內(nèi)外鮮見相關(guān)研究。

為此，本研究嘗試以有較長側(cè)鏈的N-十二酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-lauroyl-homoserine lactone，N-C12-HSL)為靶標，通過有機合成技術(shù)和單克隆制備方法，制備出針對N-aHSLs的單抗，為進一步建立簡便、快捷的N-aHSLs動態(tài)檢測方法開辟一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 Electron LCQ Deca液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Thermo公司)，DRX-400磁共振儀(德國Bruker公司)。

1.1.2 主要試劑 化學(xué)合成試劑月桂酸、L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽、草酰氯、月桂酰、二甲基甲酰胺、二甲基氯硅烷(美國Sigma公司)；完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑(北京賽馳生物技術(shù))，PEG 1500聚乙二醇(德國Merck公司)，HT supplement及HAT supplement細胞選擇性培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，洛斯維公園紀念研究所1640培養(yǎng)基(北京天潤善達生物技術(shù))，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標志的羊抗鼠免疫球蛋白G(美國Sigma公司)；溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)培養(yǎng)基(北京陸橋公司)，海生菌肉湯培養(yǎng)基(美國BD公司)；N-己酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-caproyl-L-homoserine lactone，N-C6-HSL)、N-丁酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-butyryl-L-homoserine lactone，N-C4-HSL)、完全抗原N-丁酰高絲氨酸內(nèi)酯-卵清蛋白(N-butyryl-L-homoserine lactone-ovalbumin，NC4-HSL-OVA)以及完全抗原N-己酰高絲氨酸內(nèi)酯-OVA(N-caproyl-L-homoserine lactone-OVA，N-C6-HSLOVA)由課題組前期合成[11]。

1.1.3 菌株 銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)ATCC 27853(美國菌種保藏中心)；異源QS菌株大腸桿菌MG4(escherichia coli，E.coli MG4)由美國蓋澤爾醫(yī)學(xué)院Deborah A.Hogan教授授權(quán)中國海洋大學(xué)宮倩紅實驗室饋贈；異源QS菌株紫色色桿菌026(chromobacterium violaceum 026，CV026)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院五所童怡剛實驗室饋贈。

1.1.4 動物 雌性BALB/c小鼠(8周齡)海軍總醫(yī)院動物中心，實驗動物質(zhì)量合格證SCXK-(軍) 2012-0004，實驗動物使用許可證SYXK-(軍)2012-0012。

1.2 方法

1.2.1 N-C12-HSL的合成 將2.00 g(10 mmol/L)月桂酸加入0.05 L二氯甲烷中，加入草酰氯5.00 g (39.4 mmol/L)，攪拌并濃縮至干，加入二氯甲烷和二甲基甲酰胺混合溶液0.025 L，加入L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽1.40 g(10.2 mmol/L)和三乙胺0.002 L，55℃反應(yīng)過夜并濃縮至干，經(jīng)二氯甲烷洗滌未溶解的部分為目的產(chǎn)物。產(chǎn)物進行1H-磁共振(1H-nuclearmagnetic resonance，1H-NMR)和高壓/效液相色譜儀(high pressure/performance liquid chromatography，HPLC)表征。合成路線見圖1。

圖1 N-C12-HSL合成路線

1.2.2 N-aHSLs生物活性鑒定 采用平板劃線法檢測[12]。以產(chǎn)生QS信號分子3-氧-N-十二酰高絲氨酸內(nèi)酯的PA驗證E.coli MG4敏感性，再分別用E.coli MG4和CV026驗證合成產(chǎn)物N-C12-HSL和N-C6-HSL的生物活性。將分別培養(yǎng)于LB培養(yǎng)液中的PA和 E.coli MG4菌液稀釋到光密度(optical density，OD)值600 nm即OD600＝0.5，并分別取30 μL菌液在LB培養(yǎng)基上呈“T”方式涂板(圖2A)，37℃培養(yǎng)12 h后觀察變化。同樣，將LB培養(yǎng)液中的E.coli MG4和CV026菌液稀釋到OD600＝0.5，并分別取30μL菌液在LB培養(yǎng)基上呈“i”方式涂板；將合成的N-aHSLs分別用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，各取5μL N-aHSLs溶液加于5 mm×5 mm無菌濾紙上，置于涂板的感應(yīng)菌液的一端，使兩者呈“i”字狀(圖2b)，設(shè)DMSO為空白對照組，30℃培養(yǎng)12 h后取出觀察。

圖2 N-aHSLs生物活性鑒定涂板

1.2.3 12-羧基-N-十二酰高絲氨酸內(nèi)酯的合成用N-羥基琥珀酰亞胺活潑酯法合成12-羧基-N-十二酰高絲氨酸內(nèi)酯(12-carboxyl-N-decanoyl-L-homoserine lactone，12-CD-LHL)。將4.60 g十二碳二酸加入到0.095 L二氯甲烷中，加入特戊酰氯2.40 g，然后加入三乙胺2.20 g，加熱至回流，攪拌4 h并濃縮至干，加入0.025 L二氯甲烷和二甲基甲酰胺的混合溶液，加入4-二甲基氨基吡啶0.24 g、L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽2.80 g及三乙胺0.002 L，55℃反應(yīng)過夜，濃縮至干，經(jīng)高壓液相制備目的產(chǎn)物，產(chǎn)品進行1H-NMR、HPLC和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectroscopy，LC-MS)確證。合成路線見圖3。

圖3 12-CD-LHL合成路線

1.2.4 N-C12-HSL完全抗原制備 參照文獻[13-14]活潑酯法制備完全抗原。獲得的偶聯(lián)產(chǎn)物用紫外光譜掃描法鑒定[15-16]，Bradford法測定蛋白濃度，分裝后-76℃保存。

1.2.5 動物免疫及雜交瘤細胞系的建立 采用常規(guī)雜交瘤單抗制備技術(shù)[17-18]，將人工合成的羧基-N-十二酰高絲氨酸內(nèi)酯-牛血清白蛋白(carboxyl-N-decanoyl-L-homoserine lactone-bovine serum albumin，CDLHL-BSA)完全抗原免疫BALB/c小鼠(每次每只100～150μg)，共腹腔注射4次，每次間隔21 d，第3次免疫后小鼠眼球取血，用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清抗體滴度，并于末次免疫后第3天取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0融合；羧基-N-十二酰高絲氨酸內(nèi)酯-OVA(carboxyl-N-decanoyl-L-homoserine lactone-OVA，CD-LHL-OVA)作為包被抗原，ELISA檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價，篩選陽性細胞孔，常規(guī)有限稀釋法篩選陽性克隆，重復(fù)3次，以便獲得的雜交瘤細胞能夠穩(wěn)定分泌單抗；常規(guī)腹水法制備大量單抗，同時凍存腹水中細胞。

1.2.6 血清抗體效價及抗C12-HSL單抗的特異性鑒定 用間接ELISA進行檢測[17-18]。先用包被緩沖液將包被抗原CD-LHL-OVA進行倍比稀釋，每孔0.1 mL，4℃過夜，棄去孔內(nèi)液體并洗滌、拍干，加封閉液每孔250μL，37℃放置2～3 h；重復(fù)洗滌后分別與免疫小鼠血清(1∶25 000～1∶50稀釋)或雜交瘤細胞培養(yǎng)上清(1∶1 280～1∶5稀釋)反應(yīng)(37℃放置1 h)，然后再與HRP標志的羊抗鼠免疫球蛋白G二抗(1∶2 000稀釋)反應(yīng)(37℃放置1 h)，鄰苯二胺方法顯色；全自動定量酶標儀測定其OD490值，若大于規(guī)定的陰性對照的2.1倍，即為陽性。同時，將N-aHSLs用磷酸緩沖鹽溶液倍比稀釋成系列標準濃度(1 600、400、100、25、6.25、1.56、0 ng/mL)，進行間接競爭ELISA檢測，比較其半抑制濃度(halfmaximal inhibitory concentration，IC50)，并計算抗C12-HSL單抗與其他N-aHSLs的交叉反應(yīng)率，即 IC50(CDLHL)/IC50(其他N-aHSLs)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0軟件，組間比較采用方差分析，Excel軟件作圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 N-C12-HSL的表征 LC-MS顯示所合成的化合物的分子離子峰[M+H]+為284，與N-C12-HSL的理論分子離子峰完全一致；所得產(chǎn)物1H-NMR鑒定圖譜數(shù)據(jù)與理論分析完全一致，即為目標化合物NC12-HSL。1H-NMR鑒定圖譜數(shù)據(jù)為[400 MHz，氘氯仿；多重峰(multi-peaks，m)；氫(hydrogen，H)；雙峰(doublet，d)]：0.882～0.915(m，3H)，1.276～1.315 (m，16H)，1.645～1.680(m，2H)，2.119～2.172(m，1H)，2.248～2.286(m，2H)，2.888(m，1H)，4.297～4.339(m，1H)，4.469～4.514(m，1H)，4.566～ 4.580(m，1H)，6.041(d，1H，偶合常數(shù)＝4)。

2.2 N-C12-HSL的生物活性 “T”涂板顯示，靠近PA處的E.coli MG4條帶有明顯顯色(圖4A)?！癷”涂板顯示，合成的 N-C12-HSL分子可與感應(yīng)菌株E.coli MG4結(jié)合并使之顯色，產(chǎn)生與PA相似的效果；同樣，N-C4-HSL和N-C6-HSL分子也可與感應(yīng)菌株CV026結(jié)合并使之顯現(xiàn)特征性的紫色(圖4B)。

圖4 N-aHSLs生物活性鑒定

2.3 CD-LHL的表征 LC-MS圖譜顯示化合物的分子離子峰[M+H]+為314，與CD-LHL的理論分子離子峰完全一致；1H-NMR鑒定圖譜數(shù)據(jù)與理論分析也一致，即為目標化合物CD-LHL。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)：1.235(m，12H)，1.474(m，4H)，2.089(m，2H)，2.177(m，2H)，2.357(m，1H)，4.197(m，1H)，4.327～4.332(m，1H)，4.494(m，1H)，4.566～4.580(m，1H)，8.290(d，1H，偶合常數(shù)＝8)。2.4 CD-LHL-OVA和CD-LHL-BSA鑒定 人工合成的完全抗原紫外吸收圖譜不同于原載體蛋白(BSA)和CD-LHL半抗原的紫外掃描圖譜(圖5)。

圖5 CD-LHL-BSA(OVA)紫外吸收光譜圖

2.5 抗N-C12-HSL單抗鑒定 以人工合成的CDLHL-BSA作為免疫抗原，經(jīng)反復(fù)間接ELISA檢測初篩后，獲得01A8、03F5和06F4共3株雜交瘤細胞克隆。

2.5.1 間接ELISA效價測定 CD-LHL-OVA包被酶標板濃度為1.5 mg/L，ELISA檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清單抗效價為10-2(圖6)，CD-LHL-BSA免疫小鼠血清效價可達10-4。

圖6 抗CD-LHL雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價檢測

2.5.2 單抗靈敏度測定 以CD-LHL的濃度常用對數(shù)為X軸，以CD-LHL的ELISA檢測OD值為Y軸，擬合標準曲線的回歸方程。根據(jù)標準曲線回歸方程：y＝-0.754 5x+3.401 5(R2＝0.992 1)，抗CDLHL單抗的IC50是190.98 ng/mL。

2.5.3 特異性鑒定 抗N-aHSLs抗體與N-C4-HSL和N-C6-HSL分子交叉反應(yīng)實驗見表1。單抗01A8與N-C4-HSL和N-C6-HSL抗原交叉反應(yīng)率均小于0.3%，單抗03F5、06F4分別與 N-C6-HSL及N-C4-HSL抗原交叉反應(yīng)率為8%～23%。

表1 N-C12-HSL單抗與其他HSL抗原的交叉反應(yīng)率檢測(%)

3 討論

N-aHSLs信號分子主要由革蘭陰性菌產(chǎn)生，其對于感染的重要性已廣為報道。自然環(huán)境中尤其在海洋中革蘭陰性菌也占主導(dǎo)優(yōu)勢，常見的如假單胞菌、弧菌、桿菌、非發(fā)酵菌等。當(dāng)這些細菌以群體形式存在時，N-aHSLs等信號分子與細菌受體結(jié)合，進而調(diào)控細菌生理功能，如形成生物被膜、產(chǎn)生毒力因子等，使細菌的生長模式、代謝狀態(tài)和耐藥性發(fā)生顯著的變化，往往造成難治性感染，引起極高的死亡率。如果能夠及時、快捷地識別菌群產(chǎn)生的信號分子，并能準確地定量分析，將有助于深入了解菌群的生理活性、感染能力及毒力特點，從而更有效地把握控制細菌感染的時機和措施，同時也可為深入研究QS及其調(diào)控機制提供有力工具。因此，制備N-aHSLs單抗可用于對QS信號分子進行免疫測定，較為便捷、靈敏，可作為現(xiàn)有常規(guī)分析技術(shù)和生物傳感器測定法的替代或補充。此外，制備的抗體也可應(yīng)用于N-aHSLs原位檢測、中和抗體及免疫化學(xué)測定、流式細胞檢測等技術(shù)的研究中。

由于人工合成的N-aHSLs是一種非天然存在的小分子酰胺類分子，在制備抗體前首先要對側(cè)鏈的水溶性和長度進行選擇。相關(guān)研究資料表明，N-aHSLs側(cè)鏈碳原子的數(shù)目與其免疫活性相關(guān)，?；鶄?cè)鏈較短時免疫活性較弱，而側(cè)鏈長度為11～14個碳原子時免疫活性較強[19]。故本實驗首先選擇具有較強免疫活性的N-C12-HSL為研究對象，以月桂酸、L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽及草酰氯等為原料，通過?；磻?yīng)大量合成了N-C12-HSL，解決了其來源緊張的問題。本研究對合成的N-C12-HSL進行了表征鑒定，1H-NMR和HPLC分析結(jié)果與理論預(yù)測相一致，表明目標產(chǎn)物N-C12-HSL合成成功。

對合成的信號分子生物活性的檢測采用敏感菌株信號感應(yīng)方法，用感應(yīng)菌株E.coli MG4和CV026分別檢測長鏈和短鏈的N-aHSLs。生物感應(yīng)菌株E. coli MG4以β-半乳糖苷酶基因為報告基因，對含有8～14個碳原子的外源性N-aHSLs敏感，有外源性N-aHSLs存在時，其β-半乳糖苷酶基因被激活并顯現(xiàn)藍色[20]。由于PA可產(chǎn)生特征性的3-氧-N-十二酰高絲氨酸內(nèi)酯分子[21]，本研究用PA標準菌株驗證E.coli MG4的敏感性；結(jié)果顯示E.coli MG4可以檢測到PA產(chǎn)生的QS信號分子，合成的N-C12-HSL分子也可與E.coli MG4結(jié)合并使之顯色，說明合成的N-C12-HSL分子具備與生理條件下產(chǎn)生的N-aHSLs分子相同的生物活性。而CV026為mini Tn5雙重突變株，本身不產(chǎn)生N-aHSLs，但經(jīng)外源短側(cè)鏈N-aHSLs(含4～8個碳原子)激活時可使產(chǎn)色素基因表達而顯示特征性的紫色[22]。本實驗結(jié)果顯示CV026能夠被人工合成的N-C4-HSL和N-C6-HSL分子激活顯色，證明這些合成的N-aHSLs分子具備天然分子的生物活性。這些合成N-aHSLs天然生物活性的驗證也從側(cè)面提示其天然免疫活性的存在可能性，為后續(xù)制備其高親和力抗體的可行性提供保障。

由于N-aHSL是小分子水溶性內(nèi)酯類化合物，無法直接誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗體。因此，必須將N-C12-HSL與載體蛋白進行化學(xué)交聯(lián)，使之成為具有免疫原性的完全抗原，才能通過動物免疫制備其特異性抗體。本實驗反復(fù)比較直接在N-C12-HSL分子上連接活性基團、構(gòu)建半抗原中間體等多種方法的效果后，最終選擇采用本身含有-COOH活性基團的十二碳二酸(C12H22O4)重新合成與N-C12-HSL結(jié)構(gòu)相似的半抗原衍生物CD-LHL。CD-LHL因其起始原料十二碳二酸的結(jié)構(gòu)特殊性，使用二氯亞砜、草酰氯等常規(guī)的生成酰氯的方法，然后和L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽反應(yīng)，都無法得到產(chǎn)物；采用生成酰胺鍵的常用縮合方法，例如碳二亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺的偶聯(lián)反應(yīng)，也無法得到預(yù)期的產(chǎn)物；經(jīng)過大量的實驗篩選，本實驗使用特戊酰氯生成活潑酸酐，然后用L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽在堿性條件下對活潑酯進行胺解，得到了CD-LHL。用LC-MS、HPLC和1H-NMR進行產(chǎn)物確證，CD-LHL的結(jié)構(gòu)和相對分子質(zhì)量與理論預(yù)測一致，表明化學(xué)合成CD-LHL成功。并根據(jù)羧基偶聯(lián)特點，選擇較為常用的N-羥基琥珀酰亞胺活潑酯法，將CD-LHL半抗原與BSA偶聯(lián)合成了人工抗原，前期的紫外吸收光譜掃描初步鑒定和后期小鼠免疫活性驗證均表明偶聯(lián)成功。此制備方法成本低廉，適用于大量合成。

而本研究在成功合成N-C12-HSL人工抗原的基礎(chǔ)上，利用成熟的單抗制備技術(shù)，制備了3株能穩(wěn)定分泌抗N-C12-HSL單抗的雜交瘤細胞系；抗體初步鑒定表明，雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中單抗效價為10-2，具有較好的免疫活性，單抗01A8與課題組前期合成的完全抗原N-C4-HSL-OVA和N-C6-HSL-OVA幾乎均不發(fā)生交叉反應(yīng)，單抗03F5、06F4分別與完全抗原N-C6-HSL-OVA及N-C4-HSL-OVA均有弱交叉反應(yīng)。據(jù)文獻報道，所制備的N-HSL同類單抗IC50值范圍為200～2 000 ng/mL，交叉反應(yīng)率則變動范圍很大，鮮見特異性高的抗HSL抗體[10]。本實驗中所得抗N-C12-HSL單抗IC50值相對較低，說明抗體親和力較好，其中01A8單抗與完全抗原N-C4-HSL-OVA和 N-C6-HSL-OVA交叉反應(yīng)率均小于0.3%，也顯示了較好的特異性。表明這3株單抗具有較好的特異性和免疫反應(yīng)性。但鑒于參與交叉反應(yīng)的同類分子種類欠充足，且不同N-aHSLs分子差異的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)主要在于酰胺側(cè)鏈上——長度不同或第3位碳原子上取代基團不同(氫、羥基或羰基)，故側(cè)鏈結(jié)構(gòu)在N-aHSLs抗體識別中擔(dān)任重要角色。而本實驗采用的N-aHSLs免疫抗原結(jié)構(gòu)較為單一，未考慮到側(cè)鏈第3位碳原子上取代基團的差異對現(xiàn)有抗體識別的影響，現(xiàn)有相關(guān)文獻資料也鮮有報道，在應(yīng)用中還需更進一步的鑒定。

雖然N-C12-HSL信號分子含量甚微，檢測困難，但目前應(yīng)用化學(xué)有機合成方法使充足N-aHSLs樣品的獲得成為可能，并通過雜交瘤技術(shù)成功制備了N-C12-HSL單抗，為進一步建立基于抗原抗體特異性反應(yīng)的N-aHSLs免疫學(xué)快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)，也為將來實時和現(xiàn)場大批量檢測提供了有力工具。

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Chemosynthesis of N-acylated homoserine lactones hapten derivant and the prelim inary study of its antibody formation

FU Kaifei1，WANG Yuxiao1，LIJun2，WU Chenglin1，ZHOU Lijun1
(1.Center for Basic Medical Science，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2.Department of Scientific Research and Training，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

ObjectiveTo synthesize the artificial holoantigen and correspondingmonoclonal antibodies of N-acylated homoserine lactones(N-aHSLs)，and to provide basis for establishment of a new immunodetection and monitoringmethod of N-aHSLs.MethodsLauric acid and homoserine lactone were used as the startingmaterials to synthesize N-lauroyl-homoserine lactone(N-C12-HSL) and the hapten derivantof12-carboxyl-N-decanoyl-L-homoserine lactone(12-CD-LHL)with chemical crosslinking active group by serial reactions.The target products were characterized by1H nuclearmagnetic resonance(1H-NMR)，high pressure/performance liquid chromatography(HPLC) and liquid chromatograph-mass spectrometer(LC-MS).The natural bioactivity of N-aHSLs was detected by biological response method.Holoantigen of N-C12-HSL was synthesized by the method of active ester.BALB/cmicewas immunized with N-C12-HSL holoantigen，and hybridoma cells against N-C12-HSL were produced by cell-fusion technique.The specificity and titers ofmonoclonal antibody against N-C12-HSL were screened by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsThe1H-NMR，HPLC and LC-MS results revealed that the obtained compound were the target product of N-C12-HSL and 12-CD-LHL，just as the prediction.The synthetical N-aHSLs could activate the biological response strains of escherichia coli and chromobacterium violaceum 026 seperately and color the strains.The ultraviolet absorption spectrum results revealed that hapten N-C12-HSL had crosslinked with bovine serum albumin and ovalbumin，N-C12-HSL holoantigen had been prepared well.Three strains of hybridoma against N-C12-HSL were obtained，and the identification results indicated which all have favourable immunoreactivity.ConclusionThe preparation of N-aHSLs whole antigen and correspondingmonoclonal antibody laid the foundation for N-aHSLs dynamic monitoring and subsequent research.

N-lauroyl-homoserine lactone(N-C12-HSL)；Hapten derivant；Monoclonal antibody

R344

A

2095-3097(2017)04-0207-07

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.04.004

2016-10-27 本文編輯：徐海琴)

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(31400107)；軍隊重點項目(BHJ14J004)；海軍總醫(yī)院創(chuàng)新培育基金(CX201201)

100048北京，海軍總醫(yī)院中心實驗科(付凱飛，王欲曉，吳成林，周麗君)，科訓(xùn)科(李 軍)

周麗君，E-mail：hzzhoulj＠126.com