雷帕霉素延緩老年小鼠脊柱退變的實驗研究

譚清梅 張從新 廖堅文 楊誠*

1．深圳市福田區(qū)第二人民醫(yī)院，廣東 深圳518049

2．廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院荔灣醫(yī)院，廣東廣州510145

3．南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院(廣東省骨科醫(yī)院)，廣東廣州510630

隨著老齡化社會的到來，脊柱退變性病變例如骨質疏松和腰椎間盤退變等疾病越來越常見。存在證據(jù)表明50歲以上人群的椎間盤變性接近90%［1］。在歐洲，估計在50歲以上人群中，每8人就有1人曾因骨質疏松患過脊椎骨折。但目前老年性脊柱退變的發(fā)病機制未明確，尋找相關治療靶點藥物是研究熱門。

臨床前期的許多研究表明mTOR信號參與骨重塑［2-8］。動物模型表明抑制mTOR途徑會減少骨吸收作用，例如，老鼠的mTOR信號途徑受抑制后會出現(xiàn)破骨細胞的成熟減少和破骨細胞凋亡增加［3］。依維莫司不但抑制破骨細胞和成骨細胞在體外分化，而且通過切除卵巢的老鼠模型實驗顯示，依維莫司改善骨質疏松與雌激素不足［4］。進一步的臨床研究也表明除了能延緩骨疾病進展，依維莫司可能有助于保護骨骼健康［9］。還有研究發(fā)現(xiàn)mTOR抑制劑雷帕霉素(Rapamycin)可減輕關節(jié)軟骨的退變，從而延緩骨關節(jié)炎(OA)的病理進程［10］。Jiang等［11］通過Ca2+依賴AMPK/mTOR途徑激活自噬使老鼠的髓核細胞能適應高滲的壓力環(huán)境。還有研究發(fā)現(xiàn)在退變椎間盤內(nèi)AMPK表達和激活增加，而mTOR的表達顯著減少，提示在椎間盤內(nèi)AMPK通過對mTOR的調(diào)節(jié)導致基質分泌減少、細胞數(shù)量下降［12］。這些研究表明，mTOR信號通路在體內(nèi)和骨、軟骨和及髓核細胞的代謝密切相關。但以往研究均采用的模型為切卵巢模型，與老年性骨質疏松有區(qū)別，而且該模型無法觀察椎間盤退變情況。本研究采用自發(fā)性老年脊柱退變小鼠模型，觀察雷帕霉素對脊柱退變導致的骨質疏松和椎間盤退變的作用，為今后治療老年性脊柱退變提供靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

20只27月齡C57B6雌性小鼠，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證:SCXK(粵)2011-0074。隨機分為2組:10只喂雷帕霉素3個月(30 m+Rap組)，另10只喂生理鹽水3個月作為對照組(30 m組)。

1.2 實驗材料

Olympus光學顯微鏡照相系統(tǒng)，日本Olympus公司;PM30自動顯微照相裝置，日本Olympus公司;顯微斷層掃描儀(Micro-CT)，瑞士Scanco公司;伊紅粉劑，美國Sigma公司;阿爾新藍粉劑，美國Sigma公司;COLⅡ抗體，英國Abcam公司;TRAP試劑盒，美國Sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 影像學檢查:3個月后麻醉處死小鼠，取脊柱胸12-腰2椎體固定后使用顯微CT成像系統(tǒng)進行斷層掃描成像。選用小視野成像掃描，校正CT值，設定空氣CT值為－1000，骨的CT值為1000，調(diào)定掃描電壓70 kV，功率30 W，電流為429μA，掃描層厚為5 μm。用3D-MED 3.0三維重建脊柱。

1.3.2 組織學染色:獲得標本后，制作組織切片HE和阿爾新藍染色椎體和椎間盤結構。染色方法:A、烤片:65℃恒溫箱中烤片20 min;B、脫蠟(二甲苯置換石蠟):二甲苯 I，10 min;二甲苯 II，10 min;C、水化(乙醇置換二甲苯):100%乙醇I，5 min;100%乙醇 II，5 min;95% 乙醇，2 min;80% 乙醇，2 min;70%乙醇，2 min;50%乙醇，2 min;D、清洗:PBS沖洗3次，每次5 min;E、蘇木素著色30 s或阿爾新藍著色30 min;F、自來水沖洗2 min;G、伊紅著色1 min或0.1%核固紅溶液復染核5 min;H、自來水沖洗2 min;I、95%乙醇，2 min ×2;J、100%乙醇 3 min ×2;K、二甲苯10 min;L、封片。

1.3.3 組織學染色免疫組化和TRAP染色:COLⅡ免疫組化實驗步驟:A-G同前;然后按照標準免疫組化程序進行操作。釆用圖像分析軟件Image-Pro Plus，分別選定各組圖片中褐色區(qū)域，計算出占整個圖片的面積百分比。進行統(tǒng)計分析。TRAP方法與步驟:孵育液A液:0.2 mol/L醋酸緩沖液8 mL;B液:六偶氮副品紅1 mL;C液:取萘酚AS-BI磷酸酯20 mg加入1 mL N，N-二甲基甲酰胺溶解。將A、B液按比例混勻，調(diào)pH至5.0，加入C液再加酒石酸鉀鈉141 mg，充分溶解過濾后配成TRAP孵育液。玻片或骨片上的破骨細胞經(jīng)2.5%戊二醛4℃固定7 min后，雙蒸水清洗3次，浸入孵育液內(nèi)，37℃孵育50 min，雙蒸水清洗1次，甘油明膠封片，光鏡觀察。染色結果顯示破骨細胞胞漿陽性，呈酒紅色，核呈陰性。然后在高倍視野下，在兩組切片上隨機選取個不同的區(qū)域，在骨質表面、骨內(nèi)血管通道周選取多核、緊貼骨小梁、底部有四陷、近似三角形的多核細胞為破骨細胞進行計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 雷帕霉素能緩解老年小鼠脊柱退變導致的骨量降低

首先對27 m齡C57小鼠喂雷帕霉素3 m的各10個脊柱胸腰段進行Micro-CT檢測量，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能緩解脊柱椎體骨皮質變薄和骨小梁減少，統(tǒng)計結果主要表現(xiàn)在BV/TV，Tb．N及 Tb．Sp的t值，分別為 －11.442、－16.939和10.484，P均 ＜0.001，說明30 m組和30 m+Rap組比較BV/TV，Tb．N及Tb．Sp有統(tǒng)計學差異，Tb．Th的 P=0.167 ＞0.05，說明30 m組和30 m+Rap組比較Tb．Th無統(tǒng)計學差異(見表1)。即BV/TV及骨小梁數(shù)量的增加，骨小梁分離度減少，但骨小梁厚度無明顯改變。從1 A可見雷帕霉素能緩解脊柱椎體骨皮質變薄和骨小梁減少，從1B、C、E統(tǒng)計結果看主要表現(xiàn)在BV/TV骨小梁數(shù)量的增加，骨小梁分離度減少，但骨小梁厚度無明顯改變。這進一步提示，給予雷帕霉素可以緩解老年小鼠脊柱退變導致的骨量的減少。

圖1 A 30 m和30 m+Rap脊柱Micro-CT三維重建結果，B，C，D，E為骨小梁CT分析結果*P＜0.05Fig．1 A:Spine Micro-CT scan and 3 D reconstruction results of the 30 m and 30 m+Rap groups;B，C，D and E:CT analysis results of the trabeculae

表1 各組骨小梁分析(±s，n=10)Table 1Trabeculae analysis of each group(±s，n=10)

表1 各組骨小梁分析(±s，n=10)Table 1Trabeculae analysis of each group(±s，n=10)

注:兩獨立樣本t檢驗顯示BV/TV，Tb．N及Tb．Sp的P＜0.05，說明30 m組和30 m+Rap組比較BV/TV，Tb．N及Tb．Sp有統(tǒng)計學差異，Tb．Th的P=0.167＞0.05，說明30 m組和30 m+Rap組比較Tb．Th無統(tǒng)計學差異

group BV/TV Tb．N Tb．Th Tb．Sp 30 m 0.279±0.009 3.638±0.009 0.063±0.002 0.2＜0.001 ＜0.001 0.167 ＜0.001 56±0.013 30 m+Rap 0.351±0.011 5.298±0.198 0.065±0.003 0.179±0.012 t值 －11.442 －16.939 －1.505 10.486 P值

2.2 雷帕霉素能緩解老年小鼠椎間盤退變

為了解雷帕霉素除了可以緩解老年小鼠脊柱退變導致的骨量的減少外，對椎間盤退變是否存在影響，我們?nèi)?組小鼠其腰椎行切片HE染色和阿爾新藍染色進行細微觀察椎體和椎間盤改變。從圖2、3看30 m+Rap組小鼠椎體骨小梁較30 m組多，這與Micro-CT結果一致。30 m+Rap組小鼠椎間隙較30 m組大，30 m組纖維環(huán)結構紊亂，向髓核內(nèi)生長替代部分髓核組織，生長板和軟骨終板軟骨退變明顯，表現(xiàn)為阿爾新藍染色淺藍色，軟骨終板與髓核分界不清。以上均提示雷帕霉素能緩解老年小鼠椎間盤退變。

圖2 30 m和30 m+Rap腰椎HE切片染色Fig．2 HE staining of lumbar vertebral body slice of mice in the 30 m and 30 m+Rap groups

圖3 30 m和30 m+Rap腰椎切片阿爾新藍染色Fig．3 Alcian blue staining of lumbar vertebral body slice of mice in the 30 m and 30 m+Rap groups

2.3 雷帕霉素通過抑制mTOR信號通路調(diào)節(jié)破骨細胞和軟骨細胞影響老年小鼠脊柱退變

為了解雷帕霉素如何緩解老年小鼠脊柱退行性變，首先將30 m+Rap組和30 m組腰椎切片進行通過TRAP染色檢測不同組小鼠破骨細胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)30 m+Rap組破骨細胞減少(P ＜0.05)(見圖4)。上述結果提示，雷帕霉素可能通過抑制破骨活性以改善老年小鼠的骨量從而延緩退變。同時，還進行兩個小組的COLⅡ免疫組化檢測，圖5結果顯示COLⅡ在30 m組小鼠的軟骨終板和生長板的表達明顯較30 m+Rap組減少(P＜0.05)，說明雷帕霉素通過影響了軟骨細胞的功能，從而延緩椎間盤退變。

3 討論

圖4 30 m組和30 m+Rap組腰椎切片TRAP染色及計數(shù)*P＜0.05Fig．4 TRAP immunohistochemical staining and osteoclast count of lumbar vertebral body slice of mice in the 30 m and 30 m+Rap groups*P＜0.05

圖5 30m組和30 m+Rap組腰椎切片COLⅡ免疫組化*P＜0.05Fig．5 COL Ⅱ immunohistochemical staining of lumbar vertebral body slice of mice in the 30 m and 30 m+Rap groups*P＜0.05

mTOR是整合細胞內(nèi)外各種信號調(diào)節(jié)細胞生長與代謝的中心信號分子，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、存活及凋亡等。人類很多重大疾病均涉及mTOR信號通路的失調(diào)，mTOR信號通路成為近年基礎與臨床研究的熱點［13］。雷帕霉素，又名西羅莫司(Sirolimus)，它在體內(nèi)作為mTORC1特異性抑制劑，最早雷帕霉素被當著抗真菌藥使用，后來發(fā)現(xiàn)，它具有免疫抑制和抑制細胞增值作用，因而被當著免疫抑制劑使用，主要用于器官移植后的抗免疫排斥反應。隨著研究的不斷深入，逐漸發(fā)現(xiàn)雷帕霉素許多新作用，在骨代謝中也具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)給關節(jié)不穩(wěn)誘導的OA模型的小鼠灌胃雷帕霉素，可特異性抑制關節(jié)軟骨細胞mTORC1通路活性，促進關節(jié)軟骨細胞的自噬功能，維持關節(jié)軟骨細胞存活，從而延緩 OA 的發(fā)?。?4］。而 Kneissel等［4］通過行大鼠卵巢切除造模骨質疏松，然后予依維莫司處理，發(fā)現(xiàn)骨小梁減少、骨吸收和破骨細胞上表達的組織蛋白酶K受到抑制。而臨床脊柱退行性病變很常見，主要表現(xiàn)包括骨質疏松和椎間盤退變，而且腰椎間盤退變與原發(fā)性骨質疏松存在顯著的相關關系［15］。我們課題組最新研究成果［16］顯 示mTORC1通路影響脊柱發(fā)育，在軟骨特異性敲除TSC1基因后出現(xiàn)脊柱發(fā)育畸形，而雷帕霉素能部分逆轉椎體和椎間盤的發(fā)育畸形。既然雷帕霉素能影響關節(jié)軟骨、椎間盤和破骨細胞功能，那么它是否能應用于預防老年性脊柱退變呢?目前未見有相關報道。在本研究中首次采用老年性自發(fā)性脊柱退變小鼠模型，這與卵巢切除造模骨質疏松模型相比，它更接近臨床老年性骨質疏松生理病理過程，而且該模型還能同時觀察椎間盤退變情況。本研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能緩解老年小鼠脊柱退變導致的骨質疏松和椎間盤退變，說明mTORC1信號通路在老年脊柱退行性病變中發(fā)揮重要作用，它能同時調(diào)控脊柱椎體和椎間盤結構與功能改變。而且雷帕霉素對椎間盤保護作用國內(nèi)外未見相關報道，這個新發(fā)現(xiàn)為今后研究椎間盤退變增加新內(nèi)容。雷帕霉素通過特異性抑制mTORC1信號通路調(diào)節(jié)破骨細胞和軟骨細胞延緩脊柱退變，這也與目前的研究認為雷帕霉素可以減緩衰老一致［11］。

因此我們認為雷帕霉素可作為預防老年脊柱退行性病變靶點藥物，但雷帕霉素的免疫抑制、肝腎功能損傷等毒副作用影響其臨床應用，如何開發(fā)與應用以mTOR為靶點的雷帕霉素衍生物及替代藥物是未來延緩及治療脊柱退行性病變的熱點之一。