HPLC法測定玉米中的玉米赤霉烯酮含量

劉暢

摘 要：玉米赤霉烯酮又稱F-2毒素、ZEA，主要會污染玉米、小麥、大麥、小米、大米和燕麥等谷物。本文主要通過對國標(biāo)檢測方法的優(yōu)化，對濃縮重溶等方式建立分析方法，保證了上機(jī)檢測濃度，提高了檢測效率，使回收率和精密度均滿足國標(biāo)GB/T 27404-2008的要求。

關(guān)鍵詞：玉米赤霉烯酮 玉米 高效液相色譜法

玉米赤霉烯酮又稱F-2毒素、ZEA，主要會污染玉米、小麥、大麥、小米、大米和燕麥等谷物。ZEA具有和雌激素類似的結(jié)構(gòu)，可與雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮雌激素效應(yīng)，其作用強(qiáng)度為雌激素的十分之一。ZEA可引起卵巢病變，干擾動物排卵、延長發(fā)情間期、減少胎仔數(shù)或引起不孕等[1]。

我國規(guī)定谷物及其制品中的玉米赤霉烯酮限量指標(biāo)為小于等于60μg/kg[2]，一般采用液相色譜、氣相色譜和試劑盒等方法進(jìn)行檢測。

本文通過對國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.209-2016[3]/第一法進(jìn)行優(yōu)化，分別對方法檢出限濃度、定量限濃度、限量指標(biāo)濃度等進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，用HPLC法進(jìn)行ZEA質(zhì)量濃度的測定，回收率和精密度均滿足GB/T 27404-2008[4]的要求。

1 試劑和材料

超純水、乙腈（色譜級）、甲醇（色譜級）、ZEA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（PriboLab）、提取液（乙腈：水=84：16，v/v）[5]、PBS緩沖液（Hyclone）、吐溫-20、ZEA免疫親和柱（Romer）。

2 儀器

安捷倫1100高效液相色譜儀、熒光檢測器、離心機(jī)、氮吹儀。

3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.0001g），用乙腈溶解，配制成濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18℃以下避光保存。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液：用流動相稀釋，配制成10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃避光保存。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 提取

本次實(shí)驗(yàn)采用市售玉米碴，經(jīng)過高速粉碎機(jī)粉碎后，準(zhǔn)確稱取5g（0.001g）放于50mL離心管中，加入20mL提取液，渦旋振蕩2min后，置于離心機(jī)中，8000rpm離心10min。上清液通過玻璃纖維濾紙過濾，棄去初濾液3mL，收集余下濾液。準(zhǔn)確吸取3mL濾液于50mL離心管中，加入25mL PBS緩沖液，混勻。

4.2 凈化

將免疫親和柱恢復(fù)至室溫后與固相萃取裝置連接，再將上樣器連接于小柱上端，加入樣品與PBS混合液，使混合液緩慢通過小柱，棄去流出液。待混合液完全流出小柱時(shí)，先向上樣器中加入10mL0.1%吐溫-20進(jìn)行淋洗，再加入10mL水繼續(xù)淋洗，棄去全部流出液。最后將小柱下方連接5mL收集管，用0.5mL甲醇洗脫3次，收集洗脫液。

4.3 濃縮

將收集到的1.5mL左右的洗脫液于低于45℃氮?dú)饩従彺蹈桑儆昧鲃酉嘀匦氯芙獠⒍ㄈ葜?mL，過0.22μmPTFE濾膜，待上機(jī)。

4.4 空白試驗(yàn)

不稱取樣品，按4.1～4.3的步驟做空白試驗(yàn)。

4.5 色譜條件

色譜柱：迪馬科技C18色譜柱，4.6mm×150mm，5μm；流動相：乙腈+水+甲醇=46+46+8，體積比；流速：1mL/min；檢測波長：激發(fā)波長274nm，發(fā)射波長440nm；進(jìn)樣量：40μL；柱溫：35℃。

5 結(jié)果與討論

5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5.1和5.2可以看出，在ZEA的濃度為10ng/mL～ 500ng/mL范圍內(nèi)，y=0.037x-0.059，r=0.99998。因此，可以用外標(biāo)法進(jìn)行ZEA質(zhì)量濃度的測定。ZEA的質(zhì)量濃度=（峰面積+0.059）/0.037。

5.2 回收率與精密度

本次實(shí)驗(yàn)中，空白試驗(yàn)與樣品中均未檢出ZEA。加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果見表5.1。

5.3 討論

本次實(shí)驗(yàn)較之國標(biāo)方法，減少了取樣量以及上機(jī)檢測的進(jìn)樣量，通過濃縮重溶等方式保證了上機(jī)檢測濃度，提高了檢測效率。加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果可達(dá)到國標(biāo)GB 5009.209-2016[3]/第一法的檢出限，并滿足GB/T 27404-2008對方法確認(rèn)的要求，證明本方法在實(shí)驗(yàn)室中檢測玉米中的ZEA含量是可行的。

參考文獻(xiàn)：

[1] 高爽，梁珍，鄧俊良，楊顏銥，陳蕓.玉米赤霉烯酮和脫氧血腐鐮刀烯醇對雌性動物的生殖毒性及作用機(jī)制，動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2016，28（4）：1042-1049.

[2] 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量，GB 2761-2011.

[3] 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測定，GB 5009.209-2016.

[4] 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測，GB/T 27404-2008附表F.1和F.2.

[5] 朱孟麗，彭聰，洪振濤.高效液相色譜法對飼料中玉米赤霉烯酮的測定，飼料工業(yè)，2007年第28卷第1期，37-38.