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    扶脾化瘤飲對人胃癌裸鼠移植瘤生長及TNF、NK活性的影響*

    2017-08-16 09:31:06楊承祖宋延平姜姍姍
    陜西中醫(yī) 2017年8期
    關(guān)鍵詞:靶細(xì)胞荷瘤灌胃

    楊 潔,楊承祖,宋延平,姜姍姍

    陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003 )

    ·實(shí)驗(yàn)研究·

    扶脾化瘤飲對人胃癌裸鼠移植瘤生長及TNF、NK活性的影響*

    楊 潔,楊承祖,宋延平,姜姍姍

    陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003 )

    目的:觀察中藥復(fù)方扶脾化瘤飲對荷人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤生長及對荷瘤裸鼠TNF、NK活性的影響。方法:建立人胃癌SGC-7901細(xì)胞BALB/C裸小鼠皮下移植瘤模型,隨機(jī)分為5組,每組8只。荷瘤對照組予純凈水灌胃,扶脾化瘤飲大、中、小劑量組予扶脾化瘤飲煎劑灌胃,20ml/kg,1次/d;陽性對照組予環(huán)磷酰胺灌胃,20mg/kg,1次/d。觀察各組裸鼠移植瘤生長情況,采用L929細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)檢測TNF活性及NK細(xì)胞活性。結(jié)果:扶脾化瘤飲大、中劑量對荷人胃癌SGC-7901裸鼠具有顯著的抑瘤作用,抑瘤率為44.46%、35.79%(P<0.01,P<0.05),同時能顯著促進(jìn)產(chǎn)生TNF,細(xì)胞毒指數(shù)分別為55.53%、52.52%(P<0.01);扶脾化瘤飲大劑量對脾臟NK細(xì)胞活性也有提高作用,細(xì)胞殺傷率為30.59%(P<0.05)。結(jié)論:扶脾化瘤飲可以抑制人胃癌SGC-7901的生長,且能拮抗荷瘤所致的免疫功能的抑制。

    扶脾化瘤飲是治療中晚期胃癌及轉(zhuǎn)移性胃癌的經(jīng)驗(yàn)用方,臨床療效確切,臨床也用于放療、化療的輔助治療[1]。為研究其抗腫瘤作用及免疫學(xué)方面可能的機(jī)制,我們觀察了該方對荷人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤生長及對腫瘤壞死因子TNF及脾臟NK細(xì)胞活性的影響。

    材料與方法

    1 動物和瘤株 BALB/C裸鼠,SPF級,4~6周齡,實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量許可證號:SCXK(湘)2009-0004;人胃癌SGC-7901細(xì)胞株,從解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購入。

    2 試 藥 扶脾化瘤飲,由陜西省中醫(yī)醫(yī)院藥劑科生產(chǎn),批號1210801;陽性藥環(huán)磷酰胺,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn),批號:12080321。

    3 試驗(yàn)條件 室溫22~28℃,相對濕度40~60%,空調(diào)調(diào)溫,排氣扇通風(fēng)換氣每天2次,每次1 h。試驗(yàn)小鼠雌雄分籠喂養(yǎng),水(純凈水)、標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料自由攝取。鼠舍保持整潔衛(wèi)生。光/暗時間為12/12 h。

    4 儀 器 電子天平,型號:BS210S,精確度:0.1 mg,北京賽多利斯天平廠;普通光學(xué)顯微鏡,日本olympus;SW-CJ-IF型超凈工作臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司;酶標(biāo)儀,美國伯樂(Bio-Rad);CO2恒溫培養(yǎng)箱,美國SHELDON公司。

    5 腫瘤動物模型制作 細(xì)胞培養(yǎng)及接種[2-3]:將人胃癌細(xì)胞株SGC-7901在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞長滿后用胰酶消化,收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),將細(xì)胞懸液濃度調(diào)至1×107個細(xì)胞/ml。取3只BALB/C無胸腺裸鼠,以0.2 ml/只的劑量將瘤液接種于背部。待裸鼠背部腫瘤長至體積約為1000 mm3時進(jìn)行移植。

    腫瘤移植:脫頸椎處死裸鼠,消毒后將背部皮膚切開,取出腫瘤,置于放入少許細(xì)胞培養(yǎng)液的無菌平皿內(nèi),清除外周血管及結(jié)締組織后切成小塊,用無菌玻璃勻漿器進(jìn)行研磨,磨勻后放入無菌容器內(nèi),加生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個細(xì)胞/ml。取40只BALB/C無胸腺裸鼠,以0.2 ml/只劑量分別接種于裸鼠右前肢腋窩皮下。接種過程須在30 min內(nèi)完成。

    6 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 待荷瘤裸鼠的瘤塊體積長至約100~300 mm3后,將其隨機(jī)分為五組: 荷瘤對照組、陽性對照組、扶脾化瘤飲大、中、小劑量組,每組8只。荷瘤對照組灌胃純水,陽性對照組灌胃環(huán)磷酰胺(20 mg/kg),扶脾化瘤飲大、中、小劑量分別灌胃劑量為6.0 g/kg、3.0 g/kg、1.5 g/kg。各組灌胃體積均為20 ml/kg,接種次日起每天給藥1次,連續(xù)給藥14 d。

    7 觀察指標(biāo)

    7.1 腫瘤抑制率:末次給藥1 h后,稱重、脫頸椎處死裸鼠,剝離瘤塊稱重,按公式計(jì)算抑瘤率:腫瘤抑制率=[(模型對照組瘤重-給藥組瘤重)/模型對照組瘤重]×100%。

    7.2 腫瘤壞死因子(TNF)活性測定[2-3]:末次給藥1 h后,稱重、脫頸椎處死裸鼠,摘取并研磨脾臟,裂解紅細(xì)胞,將離心得到的淋巴細(xì)胞沖洗1次,離心,用培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為5×106/ml,即為脾細(xì)胞備用液。用培養(yǎng)液將部分備用液細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml,接種于24孔培養(yǎng)板,500 μl/孔,再加入5 μg/ml的ConA,500 μl/孔,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后,吸出細(xì)胞培養(yǎng)上清,1500 r/min離心15 min,取上清液備用。

    將生長良好的靶細(xì)胞L929經(jīng)胰酶消化后,用培養(yǎng)液配制成4×105/ml的濃度,接種于96孔培養(yǎng)板。每只小鼠脾細(xì)胞懸液均設(shè)5復(fù)孔,加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各100 μl,另設(shè)1孔為效應(yīng)細(xì)胞對照,加入效應(yīng)細(xì)胞和RPMI-1640(含10%小牛血清)各100 μl。于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后,吸去上清液100 μl,加入MTT(1 mg/ml)試液 100 μl,CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h后,2000 r/min離心5 min,吸棄上清液,每孔加DMSO 100 μl,作用30 min,用酶標(biāo)儀測570 nm處的OD值。按公式計(jì)算TNF 細(xì)胞毒指數(shù)。TNF 細(xì)胞毒指數(shù)=[(靶細(xì)胞OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/ 靶細(xì)胞OD值]×100%。

    7.3 NK細(xì)胞活性測定[2-3]:將制備的脾細(xì)胞備用液濃度調(diào)為3.0×106/ml,靶細(xì)胞L929濃度調(diào)為1.2×105/ml,兩種細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板。每只小鼠脾細(xì)胞懸液均設(shè)5復(fù)孔,加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各100 μl,另設(shè)1孔為效應(yīng)細(xì)胞對照,加入效應(yīng)細(xì)胞和RPMI-1640(含10%小牛血清)各100 μl。同時設(shè)靶細(xì)胞對照,加入靶細(xì)胞和RPMI-1640各100 μl。于37 ℃、 5%CO2條件下殺傷20 h后,棄上清,每孔加入MTT(5 mg/ml)試液10 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清,每孔加入DMSO 100 μl,振蕩10 min,用酶標(biāo)儀測定570 nm處OD值,按公式計(jì)算NK細(xì)胞殺傷率。NK細(xì)胞殺傷率=[(靶細(xì)胞OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/ 靶細(xì)胞OD值]×100%。

    結(jié) 果

    1 體內(nèi)抑瘤作用 扶脾化瘤飲6.0 g/kg、3.0 g/kg劑量能明顯抑制荷人胃癌SGC-7901裸鼠瘤體的生長(P<0.01,P<0.05),抑瘤率分別達(dá)到44.46%、35.79%;陽性藥環(huán)磷酰胺平均抑瘤為71.35%。提示扶脾化瘤飲對荷人胃癌SGC-7901裸鼠腫瘤生長具有明顯的抑制作用,見表1。

    表1 扶脾化瘤飲對荷人胃癌SGC-7901裸鼠腫瘤生長的影響

    注:與荷瘤對照組相比,*P<0.05 ; △P<0.01

    2 TNF活性測定結(jié)果 扶脾化瘤飲6.0g/kg、3.0g/kg與荷瘤對照組比較TNF明顯升高 (P<0.01),環(huán)磷酰胺組與荷瘤對照組比較,具有降低TNF活性的作用。提示扶脾化瘤飲具有增強(qiáng)小鼠脾臟TNF活性的作用,見表2。

    表2 扶脾化瘤飲對荷胃癌SGC-7901裸鼠TNF活性的影響

    注:與荷瘤對照組相比,△P<0.05

    3 NK細(xì)胞活性測定結(jié)果 扶脾化瘤飲6.0g/kg與荷瘤對照組比較NK明顯升高(P<0.05),環(huán)磷酰胺組與荷瘤對照組比較NK有所降低。提示扶脾化瘤飲具有增強(qiáng)NK細(xì)胞活性作用,見表3。

    表3 扶脾化瘤飲對荷胃癌SGC-7901裸鼠NK細(xì)胞活性的影響

    注:與荷瘤對照組相比,*P<0.05

    討 論

    腫瘤患者多處于免疫抑制狀態(tài),免疫調(diào)節(jié)功能水平顯著低下。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后和患者的免疫狀態(tài)關(guān)系十分密切,加之手術(shù)、放化療等常規(guī)治療使免疫功能受損愈加嚴(yán)重,骨髓抑制影響療效。近年來中醫(yī)藥治療胃癌研究取得一定進(jìn)展,在西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上配合中醫(yī)藥治療能有效提高患者生存期,抑制瘤體生長及提高免疫功能[4-6]。扶脾化瘤飲以益氣健脾、化痰散結(jié)為法,全方重用炙黃芪、黨參、炒白術(shù)、半夏、枳殼、厚樸等藥材,主治由脾氣虛弱、濕滯中焦、痰瘀互結(jié)所致的胃癌。與單純西醫(yī)常規(guī)治療相比,本方能有效提高患者生存期及生活質(zhì)量、提高機(jī)體免疫功能、改善臨床癥狀[1]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方還具有抑制S180瘤體生長,明顯改善術(shù)后及放化療患者臨床癥狀,提高外周血白細(xì)胞減少情況的療效[7]。

    本實(shí)驗(yàn)采用人胃癌SGC-7901裸鼠皮下移植瘤模型動態(tài)觀察扶脾化瘤飲對胃癌腫瘤生長的影響,結(jié)果顯示經(jīng)扶脾化瘤飲作用后,SGC-7901胃癌生長受到明顯抑制,與對照組比較具有明顯差異,提示益氣健脾、化痰散結(jié)中藥制劑扶脾化瘤飲可以有效抑制胃癌生長。L929細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)檢測TNF活性及NK細(xì)胞活性結(jié)果顯示:扶脾化瘤飲能顯著促進(jìn)產(chǎn)生TNF,同時對脾臟NK活性也有提高作用,能拮抗荷瘤所致的免疫功能的抑制,推測扶脾化瘤飲通過激活體內(nèi)巨噬細(xì)胞,釋放出細(xì)胞因子而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的功效。

    [1] 屈小元,楊承祖.扶脾化瘤飲治療脾胃虛弱型中晚期胃癌32例[J].陜西中醫(yī),2010,31(1):9-10.

    [2] 張曉雙,孫建寧,宋延平,等.復(fù)方烏骨藤膠囊對Lewis肺癌小鼠TNF-α,NK活性的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(6):220-223.

    [3] 郭建華.胡桃楸提取物的抑瘤作用及其抑瘤機(jī)理的研究[C].吉林大學(xué),2005.

    [4] 沈克平,王海永,胡 兵,等.健脾解毒中藥胃腸安對人胃癌裸鼠皮下移植瘤生長及ERK1/2表達(dá)作用[J].遼寧中醫(yī)雜志,2012,39(2):215-217.

    [5] 駱 殊,邵 佳,沈 洪,等.黃芪莪術(shù)配伍抑制MKN-45裸鼠人原位胃癌模型腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及COX-2表達(dá)的增效研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(5):1164-1165.

    [6] 黃 黧,黃 黛,邢邯英,等. 復(fù)方中藥牛黃天龍膠囊的體內(nèi)抗腫瘤作用的機(jī)制[J].河北醫(yī)藥,2013,35(15):2247-2249.

    [7] 楊 潔,趙林濤,楊 瑞,等.扶脾化瘤飲抑瘤及延長生命的實(shí)驗(yàn)研究[J].陜西中醫(yī),2012,3(8):1092-1093.

    (收稿:2017-03-15)

    Effect of Fupi Hualiu decoction on subcutaneously implanted human gastric cancer in nude mice

    Yang Jie,Yang Chengzu,Song Yanping,et al

    Shannxi Academy of Traditional Chinese Medicine (Xi’an 710003 )

    Objective: To investigate the effects of Fupi Hualiu decoction,a Chinese herbal formula,on tumor growth and the activity of TNF and NK. Methods: Forty BALB/C nude mice transplanted with SGC-7901 cells were randomly divided into five groups(8 mice per group),and intragastric administered with normal saline or Fupi Hualiu decoction(20ml/kg),or cyclophosphamide(20mg/kg) daily.Tumor volume were observed.Activity of TNF、NK were detected by L929 cell killing test. Results: Fupi Hualiu decoction of high and media groups had obvious inhibition to the tumor volume compared with controls,the tumor inhibition rate was 44.46%(P<0.01) and 35.79%(P<0.05).The production of TNF in mice bearing tumor was also enhanced significantly,Fupi Hualiu at the dose as above had cytotoxicity index of 55.53%、52.52%(P<0.01).The activity of NK cell could be increased by Fupi Hualiu at high dose,the killing ratio was 30.59%(P<0.05). Conclusion: Fupi Hualiu decoction has inhibitory effects on tumor growth in SGC-7901 gastric carcinoma,and has antagonism action to the immunosuppressive caused by tumor.

    Stomach neoplasms/traditional Chinese medicine therapy @Fupi Hualiu decoction Tumor necrosis factors Mice,nude

    *陜西省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2010K14-03-12)

    胃腫瘤/中醫(yī)藥療法 @扶脾化瘤飲 腫瘤壞死因子 小鼠,裸

    R735.2

    A

    10.3969/j.issn.1000-7369.2017.08.074

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