補(bǔ)腎調(diào)肝方對(duì)多囊卵巢模型大鼠血清TGF-β1、IGF-1、TNF-a及激素水平的影響

陳 英,梁 輝，王 娜

河北省保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科 (保定071000)

補(bǔ)腎調(diào)肝方對(duì)多囊卵巢模型大鼠血清TGF-β1、IGF-1、TNF-a及激素水平的影響

陳 英,梁 輝，王 娜

河北省保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科 (保定071000)

目的：探討補(bǔ)腎調(diào)肝方對(duì)多囊卵巢模型大鼠血清TGF-β1、IGF-1、TNF-a及激素水平的影響。方法：選取雌性大鼠(SD)45只，隨機(jī)分為PCO模型組36只和正常對(duì)照組9只。參照Poretsky法，將造模成功的36只模型隨機(jī)分為4個(gè)組，各9只。分別給予補(bǔ)腎調(diào)肝湯68.66 g/kg(中藥大劑量組)、17.17 g/kg(中藥小劑量組)，二甲雙胍250 mg/kg(二甲雙呱組)和蒸餾水1ml/100 g(對(duì)照組)體重灌胃，1次/d，連續(xù)用14 d。放射免疫法檢測T、E2、LH、FSH、INS水平；用ELISA法檢測TGF-β1、IGF-1、TNF-a水平。結(jié)果：中藥大劑量組與其他組比較，T水平明顯降低，E2水平、E2/T比值明顯升高，血清TGF-β1、IGF-1水平升高，TNF-a水平降低，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：補(bǔ)腎調(diào)肝方能降低PCO模型大鼠血清T水平，升高E2水平，也能夠調(diào)節(jié)垂體LH、FSH的分泌，同時(shí)能夠使PCO模型大鼠的血清TNF-a水平降低，TGF-β1、IGF-1水平升高，在一定程度上對(duì)恢復(fù)PCO模型大鼠的生殖功能有促進(jìn)作用。

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovarian syndrome,PCOS)屬于一種高度異質(zhì)性疾病，主要臨床特征為慢性無排卵和高雄激素血癥。具文獻(xiàn)證實(shí)[1-2]，PCOS發(fā)病和卵巢內(nèi)部的調(diào)節(jié)因子密切相關(guān)，特別是轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和腫瘤壞死因子-a(TNF-a)。本實(shí)驗(yàn)采用PCO模型，以觀察補(bǔ)腎調(diào)肝湯對(duì)大鼠血清TGF-β1、IGF-1、TNF-a及激素水平的影響。

材料與方法

1 材 料 雌性SD大鼠54只，購自上海加科生物有限公司。適應(yīng)環(huán)境1周，自由飲水?dāng)z食。補(bǔ)腎調(diào)肝湯由白芍、菟絲子、柴胡、龍膽草、仙靈脾等12味中藥組成，由本院中醫(yī)醫(yī)師提供，將其煎制濃縮成浸膏(生藥5.89 g/ml)；二甲雙胍由上海施貴寶有限公司提供，國藥準(zhǔn)字H20023370。血清睪酮(T)、雌二醇(E2)、促黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、胰島素(INS)、TGF-β1、IGF-1、TNF-a免疫試劑盒由北京華英生物有限公司生產(chǎn)。

2 方 法

2.1 制備模型和分組:雌性SD大鼠45只，體重252 g～275 g，隨機(jī)分為PCO模型組36只和正常對(duì)照組9只。參照Poretsky法[3]，PCO模型組大鼠給予人絨毛膜促性腺激素(HCG)1. 5 U皮下注射，2次/d，連用22 d，胰島素(INS)從第1 d～11 d內(nèi)從0.5 U/d劑量開始應(yīng)用，逐漸加大劑量至6.0 U/d，維持此劑量至第22 d，造模期間飲水用5%的葡萄糖溶液代替，造模最后1 d禁食食物過夜。所有大鼠每周稱1次體重，并每天行陰道涂片檢測，在第23 d時(shí)，進(jìn)行眼眶后靜脈取血，檢測血清INS、T水平。PCO模型組大鼠血清INS、T水平升高，且陰道涂片結(jié)果失去完整的動(dòng)情周期，表示造模成功。將造模成功的36只模型隨機(jī)分為對(duì)照模型組、二甲雙胍組、中藥大、小劑量組各9只。

2.2 用藥方法:中藥大、小劑量組分別給予補(bǔ)腎調(diào)肝湯(68.66 g/kg、17.17 g/kg)灌胃，二甲雙胍組給予250 mg/kg灌胃，正常對(duì)照組和對(duì)照模型組給予蒸餾水1 ml/100g體重灌胃，各組均1次/d，連續(xù)用14 d。

3 檢測指標(biāo) 在給大鼠用藥期間，陰道涂片每天檢測，最后一次給藥后禁止飲食，過夜，第2 d稱重，采腹股溝靜脈血，血清分離后，用放射免疫法檢測T、E2、LH、FSH、INS；用ELISA法檢測TGF-β1、IGF-1、TNF-a水平。

結(jié) 果

1 補(bǔ)腎調(diào)肝湯對(duì)PCO模型T、E2水平的影響 對(duì)照模型組與正常對(duì)照組比較，T水平明顯升高，E2水平、E2/T比值明顯降低(P<0.05)；中藥大劑量組與對(duì)照模型組比較，T水平明顯降低、E2水平、E2/T比值明顯升高(P<0.05)；小劑量組和對(duì)照模型組比較，T、E2水平也有改善，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 補(bǔ)腎調(diào)肝湯對(duì)PCO模型大鼠T、E2的影響

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與對(duì)照模型組比較，#P<0.05

2 補(bǔ)腎調(diào)肝湯對(duì)PCO模型大鼠FSH、LH、INS的影響 對(duì)照模型組與正常對(duì)照組比較，PCO模型大鼠FSH、LH、INS水平明顯升高(P<0.05)；中藥大劑量與對(duì)照模型組比較，PCO模型大鼠FSH、LH、INS水平明顯降低(P<0.05),見表2。

表2 補(bǔ)腎調(diào)肝湯對(duì)PCO模型大鼠FSH、LH、INS的影響

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與對(duì)照模型組比較，#P<0.05，△P<0.01

3 補(bǔ)腎調(diào)肝湯對(duì)PCO模型大鼠血清TGF-β1、IGF-1、TNF-a水平的影響 對(duì)照模型組與正常對(duì)照組比較，PCO模型大鼠血清TGF-β1、IGF-1水平降低，TNF-a水平升高(P<0.05)；中藥大劑量組與對(duì)照模型組比較，PCO模型大鼠血清TGF-β1、IGF-1水平升高，TNF-a水平降低(P<0.05)，見表3。

表3 補(bǔ)腎調(diào)肝湯對(duì)PCO模型大鼠血清TGF-β1、IGF-1、TNF-a水平的影響(pg/ml)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，△P<0.01；與對(duì)照模型組比較，#P<0.05

討 論

補(bǔ)腎調(diào)肝湯對(duì)PCO模型大鼠激素的影響 一般情況下，成熟女性生殖功能及月經(jīng)周期均受下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)和控制。下丘腦能夠分泌促性腺激素釋放激素，刺激垂體，釋放LH、FSH，卵巢由于LH、FSH的作用，合成并分泌雌激素和雄激素[4]。PCOS患者由于下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)失常，導(dǎo)致血FSH水平降低(或正常)，LH水平升高，LH/FSH≥2；雄激素增多，使卵巢發(fā)生包膜纖維化、卵泡閉鎖等；非周期性腺外轉(zhuǎn)化成的E1導(dǎo)致體內(nèi)雌激素水平E1高于E2，最終使下丘腦-垂體反饋功能失常。中醫(yī)理論認(rèn)為[5]，月經(jīng)后期、閉經(jīng)、不孕癥等疾病與多囊卵巢綜合征相似，并將其病因歸為：外感寒邪、情志失調(diào)、淤血、痰濕。其中痰濕和淤血是致病因素，又是病理產(chǎn)物，病機(jī)主要包括虛實(shí)兩類，實(shí)證為寒凝血瘀，氣滯血瘀，痰濕壅塞。虛癥為腎陰虧虛；氣血虛少，脾胃虛弱；腎陽虛衰，寒虛內(nèi)生；腎虛血燥。本實(shí)驗(yàn)大鼠所用處方中以補(bǔ)腎為主，如女貞子、仙靈脾、菟絲子等，起到補(bǔ)腎陽、補(bǔ)腎陰、補(bǔ)腎精等功效；其次為調(diào)肝藥，如柴胡、龍膽草、白芍、當(dāng)歸等起到了疏肝理氣、疏肝解郁、養(yǎng)血柔肝及清肝瀉火等功效。諸藥共奏補(bǔ)腎調(diào)肝之功效。從西醫(yī)理論研究證實(shí)[6]，其可以改善PCOS患者雌激素、雄激素水平，從而改善下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)失常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，補(bǔ)腎調(diào)肝湯大劑量能明顯使大鼠激素水平和對(duì)照模型組比較，有明顯改善。和上面的研究相符。

補(bǔ)腎調(diào)肝湯對(duì)PCO模型大鼠血清TGF-β1、IGF-1、TNF-a水平的影響 體外研究發(fā)現(xiàn)[7]，TGF-β以劑量依賴的形式促進(jìn)大鼠卵泡膜中間質(zhì)細(xì)胞的分化與增殖；在卵泡膜細(xì)胞內(nèi)占據(jù)優(yōu)勢，能夠使細(xì)胞色素P450c17酶活性受到抑制，減少雄激素合成。本研究結(jié)果顯示，PCOS大鼠和正常大鼠比較，TGF-β1水平明顯降低，而補(bǔ)腎調(diào)肝湯(中藥大劑量組)能明顯升高TGF-β1水平，且受劑量的影響。IGF-1主要由肝臟分泌的多肽，包括70個(gè)氨基酸殘基，在卵巢、脂肪等組織也可以合成。有研究顯示[8]，高IGF-1可以使細(xì)胞色素P450c17酶活性增強(qiáng)，刺激卵泡膜合成過量的雄激素，使高雄激素血癥加重。還可以促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的分化和增殖。在韓霞[9]的研究中也有相似結(jié)果。

[1] 鄭 君.瓜石湯對(duì)初老雌性大鼠卵巢儲(chǔ)備功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2011,5:15-34.

[2] 申可佳. 護(hù)卵湯對(duì)GnRHa超排卵大鼠卵泡發(fā)育的影響研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2012,5：4-38.

[3] 張艷紅. 補(bǔ)腎、調(diào)肝方對(duì)小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜修復(fù)機(jī)制影響的比較研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2016,4:24-44.

[4] 王 浩.益腎調(diào)周法干預(yù)卵巢早衰模型法術(shù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2012,5:15-36.

[5] 薛 方.調(diào)經(jīng)助孕方對(duì)DOR模型大鼠卵泡發(fā)育障礙影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2014,5:35-41.

[6] 王進(jìn)進(jìn)，王宏偉，談 勇.補(bǔ)腎活血法治療腎虛血瘀型不孕的研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)學(xué)雜志，2016,22(10)：1420-1422.

[7] 周嫻穎，周 莉，孫組越.用于治療多囊卵巢綜合征的中藥藥理學(xué)作用機(jī)制研究[J].中國中藥雜志，2016，41(20)：3715-3717.

[8] 韓燕青.中藥治療多囊卵巢綜合征文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫的建立及中藥療效的數(shù)據(jù)分析[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2011,5:4-25.

[9] 韓 霞.補(bǔ)腎安胎中藥對(duì)著床障礙小鼠子宮VEGF-MMP-9mRNA表達(dá)的影響[J].陜西中醫(yī)，2013,34(1)：497-499.

(收稿：2017-04-06)

The effect of Bushen Tiaogan decoction on serum TGF-β1 IGF-1,TNF-a and hormone levels in rats with polycystic ovary syndrome

Chen Ying,Liang Hui,Wang Na

Department of Reproductive Medicine,Baoding Maternal and Child Health Hospital (Baoding 071000)

Objective: To investigate the effects of Bushen Tiaogan decoction on serum TGF-β1 ,IGF-1,TNF-a and hormone levels in rats with polycystic ovary syndrome (PCOS). Methods: Female rats (SD),45 were randomly divided into 36 PCO model group and control group 9.Reference poretsky method,the successful model 36 models were randomly divided into 4 groups,each 9 were given the decoction of Bushen Tiaogan and the liver 68.66 g/kg (high-dose group),17.17 g/kg (small groups of Chinese medicine),250 mg/kg metformin (metformin Gung),1 ml/100g and distilled water (control group) weight loss prednisone 1/d,14 d in a row.RIA T,E2,LH,FSH,INS level;By ELISA method for detecting levels of TGF-beta 1,IGF-1,TNF-a.Results: The high-dose group compared to other groups,T levels were significantly lower E2,E2/T ratio increased significantly increased serum levels of TGF-beta-1,IGF-1,TNF-a levels,there was a significant difference (P<0.05). Conclusion: Bushen Tiaogan decoction can reduce the level of serum T in PCO model rats,and can increase the level of E2，can also regulate the secretion of pituitary LH,FSH,at the same time,the serum TNF-a level of PCO model rats is decreased,TGF- 1,IGF-1 levels are elevated,to some extent,it can promote the reproductive function of PCO ratsn.

Polycystic ovary syndrome/traditional Chinese medicine therapy @Bushen Tiaogan decoction Rats Animal experimentation

多囊卵巢綜合征/中醫(yī)藥療法 @補(bǔ)腎調(diào)肝湯 大鼠 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

R711.75

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.08.077