芎芷地龍湯不同時(shí)間預(yù)防給藥對(duì)偏頭痛動(dòng)物模型PKCγ、PKCεmRNA的影響*

胡 坤王永麗趙永烈，2△岳廣欣

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100053）

·研究報(bào)告·

芎芷地龍湯不同時(shí)間預(yù)防給藥對(duì)偏頭痛動(dòng)物模型PKCγ、PKCεmRNA的影響*

胡 坤1王永麗1趙永烈1，2△岳廣欣3

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100053）

目的觀察芎芷地龍湯不同時(shí)間預(yù)給藥對(duì)偏頭痛動(dòng)物模型PKCγ、PKCεmRNA表達(dá)的影響。方法將健康雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為生理鹽水組、模型組、舒馬普坦組、芎芷地龍湯1 d、3 d、7 d預(yù)給藥組，每組6只。按照預(yù)定給藥，造模結(jié)束后2 h取材，real-time PCR法測(cè)定三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核丘腦、硬腦膜PKCγ、PKCεmRNA表達(dá)情況。結(jié)果與生理鹽水組比較，模型組PKCγmRNA在三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核、硬腦膜表達(dá)水平明顯升高，在丘腦表達(dá)水平明顯降低（P<0.01），給藥干預(yù)后，三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核、硬腦膜PKCγmRNA表達(dá)水平均降低，其中以預(yù)防給藥7 d組和舒馬普坦組降低明顯（P<0.01）；丘腦PKCγmRNA表達(dá)水平有所升高，以1 d組、3 d組、舒馬普坦組明顯（（P<0.05或P<0.01）。與生理鹽水組比較，模型組PKCεmRNA在硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核表達(dá)水平明顯升高（P<0.01），在丘腦表達(dá)水平降低（P<0.01）；給藥干預(yù)后，PKCεmRNA在三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核表達(dá)水平降低，以預(yù)防給藥7 d組和舒馬普坦組降低明顯（P<0.01），在硬腦膜表達(dá)水平降低，以3 d組和舒馬普坦組（均P<0.01）較1 d組和7 d組（均P<0.05）明顯；PKCεmRNA在丘腦表達(dá)水平升高，各組升高水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論芎芷地龍湯預(yù)防給藥可以減少NTG誘發(fā)的三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核PKCγmRNA、PKCεmRNA表達(dá)，而以預(yù)防給藥7 d效果好于預(yù)防給藥3 d、1 d。

偏頭痛 芎芷地龍湯 預(yù)防給藥 PKCγmRNA PKCεmRNA

偏頭痛是一種常見(jiàn)的神經(jīng)血管性疾病，其病情特征為反復(fù)發(fā)作、一側(cè)或雙側(cè)搏動(dòng)性的劇烈頭痛且多發(fā)生于偏側(cè)頭部，可合并自主神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙如惡心、嘔吐、畏光和畏聲等癥狀，約1/3的偏頭痛患者在發(fā)病前可出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)先兆癥狀［1］。藥物治療包括頭痛發(fā)作期治療和頭痛間歇期預(yù)防性治療［2］，對(duì)患者進(jìn)行預(yù)防性治療的目的是降低發(fā)作頻率、減輕發(fā)作程度、減少失能、增加急性發(fā)作期治療的療效［3］。本課題組前期研究了應(yīng)用芎芷地龍湯預(yù)防給藥對(duì)偏頭痛模型痛閾及血管活性物質(zhì)的影響［4］，為更深入探討相應(yīng)機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)擬研究芎芷地龍湯不同時(shí)間點(diǎn)預(yù)防給藥后，三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)中三級(jí)神經(jīng)元中PKCγ、PKCεmRNA表達(dá)情況?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20)g；由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥物與試劑

芎芷地龍湯（川芎、白芷、生石膏、地龍、延胡索）由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑室提取 （每毫升含生藥2.0 g）；硝酸甘油注射液，5mg/mL，北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；琥珀酸舒馬普坦片，25 mg/片，海南先聲藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；DEPC（焦碳酸二乙酯），購(gòu)于北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；氯仿（三氯甲烷），購(gòu)于北京化工廠；異丙醇，購(gòu)于無(wú)錫縣化學(xué)試劑廠；TRIZOL Reagent（Invitrogen）；High Pure RNA Tissue Kit（Roche REF12033674001）；Go Taq 2-Step RT-qPCRsystem（Promega A6010）；Go TaqqPCR Master Mix（Promega A6002）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

手持電動(dòng)勻漿器，KONTES；分光光度計(jì)，Nano Vue plus；三用電子恒溫水箱，SHH.W21，北京中興偉業(yè)器儀有限公司；高速低溫離心機(jī)，SIGMA 3K15；恒溫震蕩金屬浴，Bioer，MB-102；PCR儀，Bio-RAD CFX96 Real-Time System。

1.4 造模及給藥

SD大鼠隨機(jī)分為6組：生理鹽水組、模型組、舒馬普坦組、芎芷地龍湯1 d預(yù)給藥組（1 d XZDLT）、芎芷地龍湯3 d預(yù)給藥組（3 d XZDLT）、芎芷地龍湯7 d預(yù)給藥組（7 d XZDLT）。生理鹽水組：給予10mL/（kg·d）生理鹽水灌胃7 d，普通飼養(yǎng)，末次灌胃30min后頸背部皮下注射2mL/kg生理鹽水。模型組：給予10mL/（kg·d）生理鹽水灌胃7 d，末次灌胃30 min后頸背部皮下注射10mg/kg（5mg/mL）硝酸甘油。芎芷地龍湯組：給予10.8 g/（kg·d）芎芷地龍湯灌胃（1 d，3 d，7 d），末次灌胃30min后頸背部皮下注射10 mg/kg（5mg/mL）硝酸甘油。舒馬普坦組：給予琥珀酸舒馬普坦6 mg/（kg·d）灌胃7 d，末次灌胃30min后頸背部皮下注射10mg/kg（5mg/mL）硝酸甘油。

1.5 標(biāo)本采集

于造模結(jié)束后2 h，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行深度麻醉（40 mg/kg），迅速斷頭，在超凈臺(tái)內(nèi)冰上取腦，分別剝離出丘腦，三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核、硬腦膜分別放入1.5mL滅菌的離心管中，埋入液氮中迅速冷凍，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 大鼠組織總RNA的提取和含量的測(cè)定

1.6.1 總RNA的提取 按試劑盒 （High Pure RNA Tissue Kit）說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作：盛有標(biāo)本組織的離心管中各加400μL Trizol裂解細(xì)胞，之后依次加入適量氯仿、異丙醇、75%的預(yù)冷乙醇、DEPC水，分別純化、沉淀、洗滌、溶解總RNA。微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。根據(jù)A260的值計(jì)算RNA濃度（μg/μL），并根據(jù)A260/A280比值計(jì)算其純度，要求為1.8～2.0，比值低于1.6者棄去。

1.6.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT)步驟 按試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，20μL反應(yīng)體系，步驟如下：取1.5 mL離心管配制模板，加入：RNA 11μL，引物（Random Primer）1μL，加入總RNA量1.1μg；放入震蕩型恒溫金屬浴，70℃5min，迅速轉(zhuǎn)至冰上至少1min；離心使液體收集于管底，加入：5×Reaction buffer 4μL，MgCl225mM 2μL，PCR，Nucleotide Mix 10 mmol/L 1μL，RNase Inhibitor 0.5μL，GoScrpt RT 0.5μL；RNA引物混合液12μL與逆轉(zhuǎn)錄混合液8μL充分混合，放入震蕩型恒溫金屬浴，25℃5min，放入三用恒溫電子水箱，42℃1 h，放入震蕩型恒溫金屬浴，70℃15min，冷卻；立即PCR反應(yīng)，放入-20℃冰箱保存。

1.6.3 PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genebank的序列和文獻(xiàn)參考，設(shè)計(jì)PKCγ、PKCε、GAPDH的引物序列。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下：PKCγ-F：5’TGTGGAACGAGACCTTCGTG 3’，PKCγ-R：5’CCCATCCGCACTCTCTCATAC3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度：289bp。PKCε-F：5’GAATGTTCACCGTCGATGCG 3’，PKCε-R：5’GTTCCTGGTCACAAGGGGAG 3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度：233 bp。GAPDH-F：5’GTTACCAGGGCTGCCTTCTC 3’，GAPDHR：5’GATGGTGATGGGTTTCCCGT3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度：177bp。1.6.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time PCR）等量的RT反應(yīng)產(chǎn)物，分別擴(kuò)增PKCγ、PKCε、GAPDH基因。5倍稀釋RT反應(yīng)產(chǎn)物cDNA：Nuclease-FreeWa ter 40μL，cDNA原液 10μL；real-time PCR體系（20μL反應(yīng)體系）：cDNA稀釋液 4μL，primer F（20 pmol/μL）0.5μL，primer R （20 pmol/μL）0.5μL，Mix 10μL，加Nuclease-Free Water至20μL；輕輕混勻，2000 r/min離心20 s后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；在95℃30 s，95℃10 s，60℃30 s，15℃30 s下擴(kuò)增共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，讀取每份樣品中的相應(yīng)目的基因的Ct值，減去GAPDH的Ct值，得出相對(duì)Ct值作為n值，再作1/2n運(yùn)算，得到每份樣品中目的基因的相對(duì)表達(dá)量即Quantity（目的基因/GAPDH），校正后得到每份樣品中目的基因PKCγ、PKCε的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核、丘腦、硬腦膜的pPKCγmRNA的表達(dá)

見(jiàn)表1。與生理鹽水組比較，模型組pPKCγmRNA在三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核、硬腦膜表達(dá)水平明顯升高，在丘腦表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）。給藥干預(yù)后，三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核、硬腦膜pPKCγmRNA表達(dá)水平均降低，其中以預(yù)防給藥7 d組和舒馬普坦組降低明顯（P<0.01）；丘腦pPKCγmRNA表達(dá)水平有所升高，以1 d組、3 d組、舒馬普坦組明顯（P< 0.05或P<0.01）。

表1 各組大鼠不同組織中pPKCγmRNA表達(dá)水平比較（±s）

表1 各組大鼠不同組織中pPKCγmRNA表達(dá)水平比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與生理鹽水組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別 n生理鹽水組 6模型組 6芎芷地龍湯1d 6三叉神經(jīng)節(jié) 三叉神經(jīng)脊束核 丘腦 硬腦膜1.0050±0.0357**1.2183±0.1822**2.0000±0.1300**0.7333±0.0414**2.8933±0.0602△△2.5950±0.2166△△0.9167±0.1099△△1.3467±0.0324△△2.1683±0.0774**△△1.7117±0.1551**1.5683±0.1037**△1.2550±0.0170**△△芎芷地龍湯3d 6 2.0600±0.1001**△△1.5667±0.0931**1.2583±0.1388*△△1.1467±0.0382**△△芎芷地龍湯7d 6 1.2783±0.0468**△△1.2667±0.0660**1.0567±0.0371△△0.7167±0.0251**舒馬普坦組 6 1.0667±0.0548**1.2483±0.1338**1.3300±0.0478**△△0.6933±0.0204**

2.2 各組大鼠三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核、丘腦、硬腦膜的PKCεmRNA的表達(dá)

見(jiàn)表2。與生理鹽水組比較，模型組PKCεmRNA在硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核表達(dá)水平明顯升高（P<0.01），在丘腦表達(dá)水平降低（P<0.01）。給藥干預(yù)后，PKCεmRNA在三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核表達(dá)水平降低，以預(yù)防給藥7 d組和舒馬普坦組降低明顯（P<0.01），在硬腦膜表達(dá)水平降低，以3 d組和舒馬普坦組（均P<0.01）較1 d組和7 d組明顯（均P< 0.05）；PKCεmRNA在丘腦表達(dá)水平升高，各組升高水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

表2 各組大鼠不同組織中PKCεmRNA表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠不同組織中PKCεmRNA表達(dá)水平比較（±s）

組別 n生理鹽水組 6模型組 6芎芷地龍湯1 d 6三叉神經(jīng)節(jié) 三叉神經(jīng)脊束核 丘腦 硬腦膜0.9800±0.0686**0.9100±0.0423**0.9233±0.0581**0.5217±0.0542**1.7100±0.0772△△1.8067±0.0406△△0.6367±0.0570△△0.7833±0.0311△△1.4700±0.1302△△1.4650±0.0784**△△1.3067±0.0789**△△0.5833±0.0656*芎芷地龍湯3 d 6 1.2817±0.1189*1.1800±0.0901**△1.1567±0.0727**△0.4233±0.0327**芎芷地龍湯7 d 6 0.9667±0.1354**1.1600±0.0398**△△0.9983±0.0633**0.6017±0.0813*舒馬普坦組 6 0.5667±0.1198**△1.0400±0.0608**0.9800±0.0635**0.5483±0.0546**

3 討 論

偏頭痛發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前對(duì)三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)研究較多［5］。蛋白激酶C（PKC）是位于調(diào)節(jié)疼痛解剖部位的家族酶，在調(diào)節(jié)疼痛中發(fā)揮著重要的作用。PKC是一種磷脂依賴性的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，PKCγ對(duì)Ca2+和甘油二酯均依賴，屬于經(jīng)典型PKC，PKCε對(duì)Ca2+不依賴而對(duì)甘油二酯依賴，屬于新型PKC［6］。其中PKCγ亞單位為腦、脊髓所獨(dú)有，在疼痛信號(hào)處理及中樞敏感化誘導(dǎo)和維持中起重要作用［7-9］。

在PKC家族的各亞型中，PKCε被報(bào)道主要和特定的參與痛覺(jué)敏化過(guò)程，在初級(jí)傷害感受器和機(jī)械痛覺(jué)敏化中起重要作用［10-13］。研究表明，應(yīng)用PKC阻滯劑會(huì)抑制痛覺(jué)敏化和異常性疼痛［14］，同時(shí)也抑制硬腦膜PKCε和PKCγ的磷酸化表達(dá)的增加。在NO供體誘發(fā)的偏頭痛模型中，PKCγ、PKCε的表達(dá)增加，其磷酸化水平也在給予硝酸甘油或硝普鈉后大量升高［15］。

本實(shí)驗(yàn)研究觀察到，注射硝酸甘油后，PKCγ（Thr514）mRNA在硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)脊束核表達(dá)水平明顯升高，與既往研究結(jié)果［9］相一致。給藥干預(yù)后PKCγmRNA在硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)脊束核表達(dá)水平降低，以預(yù)防給藥7 d組和舒馬普坦組下降明顯。注射硝酸甘油后，PKCε（Ser729）mRNA在硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)脊束核表達(dá)水平明顯升高。給藥干預(yù)后PKCεmRNA在三叉神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)脊束核表達(dá)水平均降低，以預(yù)防給藥7 d組和舒馬普坦組下降明顯，而在硬腦膜處以預(yù)防給藥3 d組和舒馬普坦組下降最明顯。而PKCγmRNA和PKCεmRNA在丘腦部位的表達(dá)與在硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核部位的表達(dá)不一致，這可能和丘腦所介導(dǎo)的痛覺(jué)感知和調(diào)控中的重要作用有關(guān)。在生理狀態(tài)下，其調(diào)控作用為“非緊張性存在”，在病理生理狀態(tài)下其對(duì)痛覺(jué)內(nèi)源性下行易化和抑制作用的強(qiáng)弱并不是恒定、不變的［16］。因此丘腦可能在偏頭痛的痛覺(jué)傳遞過(guò)程中起著復(fù)雜的作用。本研究表明，芎芷地龍湯預(yù)防給藥可以減少硝酸甘油誘發(fā)的硬腦膜、三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)脊束核PKCγmRNA、PKCεmRNA表達(dá)，而且預(yù)防給藥7 d的效果好于預(yù)防給藥3 d、1 d。

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E ffects of Xiongzhi Dilong Decoction Preadm inistration on PKCγand PKCεm RNA in M igraine Animal at Different Time

HU Kun，WANG Yongli，ZHAO Yonglie，et al. The Third Hospital，Beijing University ofTraditional Chinese Medicine，Beijing 100029，China.

Objective：To study the effect of Xiongzhi Dilong Decoction predministration on PKCγand PKCε mRNA in migraine animal at different time.M ethods：36 healthy male SD rats were random ly divided into six groups：saline group（n=6），migrainemodel group（n=6），sumatriptan group（n=6），1 day preadministration group（n=6），3 day preadministration group（n=6），7 day preadministration group（n=6）.The drug was administered.Tissueswere collected 2 h after successfulmodeling.The expression of PKCγand PKCεmRNA in trigeminal ganglion，spinal trigeminal nucleus，thalamus and duramater were assayed with real-time PCR method.Results：Compared with saline group，the expression of PKCγmRNA in themodel group increased significantly in trigeminal ganglion，spinal trigeminal nucleus and duramater，and decreased significantly in thalamus（P<0.01）. After drug intervention，the expression of PKCγmRNA decreased in trigeminal ganglion，spinal trigeminal nucleus and dura mater，and the preadministration of 7 days group and sumatriptan group decreased significantly（P< 0.01）.The expression of PKCγmRNA increased in thalamus，and the preadministration of 1days group（P< 0.01），3 days group（P<0.05）and sumatriptan group（P<0.01）increased significantly.Compared with saline group，the expression of PKCεmRNA in the model group increased significantly in trigeminal ganglion，spinal trigeminal nucleus and duramater（P<0.01），and decreased significantly in thalamus（P<0.01）.After drug intervention，the expression of PKCεmRNA decreased in trigeminal ganglion and spinal trigeminal nucleus，and the preadministration of 7days group and sumatriptan group decreased significantly（P<0.01）.The expression ofPKCεmRNA decreased in duramater，and the preadministration of 3days group（P<0.01）and sumatriptan group（P<0.01）decreasedmore significantly than preadministration 1days group（P<0.05）and 7 days group（P<0.05）. The expression of PKCεmRNA increased in thalamus，and the increase of all groups was statistically significant（P<0.01）.Conclusion：Preadministration of Xiongzhi Dilong Decoction can reduce the expression of PKCγmRNA and PKCεmRNA in trigeminal ganglion，spinal trigeminal nucleus and dura mater which are induced by NTG.The prevention of 7days is better than thatof 3days and 1days.

Migraine；XiongzhiDilong Decoction；Preadministration；PKCγmRNA；PKCεmRNA

R285.5

A

1004-745X（2017）07-1134-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.002

2017-04-07）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81373591）

△通信作者（電子郵箱：yongy3@126.com）