黃芪保心湯對(duì)心肌缺血大鼠的血流動(dòng)力學(xué)和凋亡作用的研究*

潘勇軍方邦江俞志剛王佑華曹 敏△

（1.鄂東醫(yī)療集團(tuán)市中醫(yī)醫(yī)院 ，湖北 黃石 435000；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200000）

·研究報(bào)告·

黃芪保心湯對(duì)心肌缺血大鼠的血流動(dòng)力學(xué)和凋亡作用的研究*

潘勇軍1方邦江2俞志剛2王佑華2曹 敏2△

（1.鄂東醫(yī)療集團(tuán)市中醫(yī)醫(yī)院 ，湖北 黃石 435000；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200000）

目的觀察黃芪保心湯對(duì)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎大鼠的血流動(dòng)力學(xué)、凋亡及Bax、Bcl-2，Caspase-3蛋白表達(dá)的影響。方法雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、黃芪保心湯組，除空白組、假手術(shù)組外，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈造成大鼠心肌缺血損傷模型，假手術(shù)組只開胸不結(jié)扎，各組予相應(yīng)藥物干預(yù)4周后，觀察黃芪保心湯對(duì)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎大鼠心肌缺血血流動(dòng)力學(xué)、左室質(zhì)量指數(shù)、心肌細(xì)胞凋亡以及Bax、Bcl-2，Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果黃芪保心湯能改善心肌缺血大鼠血流動(dòng)力學(xué)、減少凋亡、降低Bax、Caspase-3水平，升高Bcl-2水平，具有顯著差異（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論黃芪保心湯具有良好的抗心肌缺血作用，其作用機(jī)理與減輕心肌細(xì)胞凋亡，降低Bax、Caspase-3表達(dá)，升高Bcl-2表達(dá)相關(guān)。

黃芪保心湯 血流動(dòng)力學(xué) 凋亡

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是由于冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生病變而引起血管腔狹窄或者阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病，是危害人們健康的常見疾病，而心肌缺血是其常見類型。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在改善血供、緩解心絞痛方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但如何預(yù)防心肌缺血的發(fā)生、發(fā)展，仍缺乏有效對(duì)策，中醫(yī)中藥在防治心絞痛方面有一定優(yōu)勢(shì)。本課題組在辨證論治的基礎(chǔ)上，運(yùn)用黃芪保心湯干預(yù)心絞痛，取得良好的效果［1-2］。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討黃芪保心湯對(duì)心肌缺血大鼠血流動(dòng)力學(xué)以及凋亡的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠48只，SPF級(jí)，體質(zhì)量（230±20）g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXY（京）2012-001。由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～24℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h/12 h明暗，自由進(jìn)水和進(jìn)食，6只/籠飼養(yǎng)。

1.2 試藥與儀器

黃芪保心湯（黃芪30 g，丹參15 g，蒲黃12 g，水蛭12 g，白芥子15 g等藥物。藥材煎煮后，制得含生藥含量相當(dāng)于1.5 g/mL的藥液備用）、凋亡試劑盒（南京建成生物工程有限公司）、戊巴比妥鈉（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司），配成3%水溶液。Powerlab 8導(dǎo)電生理記錄儀 （AD Instrument）、DH-150型動(dòng)物人工呼吸機(jī)（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠）。

1.3 模型制備

將48只SD大鼠隨機(jī)分為4組，即黃芪保心湯組、空白組、假手術(shù)組、模型組，每組12只。除空白組外，其余各組大鼠均進(jìn)行心肌缺血模型制備，具體操作步驟如下：以3%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，劑量為45mg/kg，麻醉后予18號(hào)針行氣管插管，連接呼吸機(jī)，參數(shù)設(shè)置為潮氣量20～22mL/min，吸呼比為1∶2。然后于SD大鼠胸骨左側(cè)剃毛，劍突上約1.0 cm，旁開約0.5 cm切開皮膚，分離皮下組織、肌肉，剪斷第3根肋骨，剝離心包膜，暴露心臟，于左心耳下方約1～2mm，0/5號(hào)線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，寬度為0.1～0.2 cm，深度0.1 cm左右，心尖部心肌呈灰白色為模型制備成功標(biāo)志?？p合胸腔，飼養(yǎng)1周后予相應(yīng)藥物干預(yù)，假手術(shù)組只穿線不接扎。

1.4 給藥方法

黃芪保心湯組以黃芪保心湯1mL/100 g灌胃，而空白組、假手術(shù)組和模型組均以1mL/100 g生理鹽水灌胃，各組大鼠每日給藥1次，共4周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 血流動(dòng)力學(xué)變化 將大鼠麻醉進(jìn)行氣管切開術(shù)并給予機(jī)械通氣，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈并做一切口，將連接PowerLab數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)的PE-50聚乙烯管插入頸動(dòng)脈，逐步進(jìn)入左心室，檢測(cè)左室內(nèi)壓最大上升速率（+dP/dtmax）、左室內(nèi)壓最大下降速率 （-dP/dtmax）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末期壓力（LVEDP）。

1.5.2 左室質(zhì)量指數(shù) 處死大鼠，摘取心臟，置于生理鹽水中漂洗去血液，剪去血管、左右心房、右心室及左右心耳，分別稱取各組SD大鼠左心室質(zhì)量（LVW）并記錄，并計(jì)算左心室質(zhì)量（LVW）/體質(zhì)量（BW）比值，此即為左心質(zhì)量指數(shù)（LVMI），計(jì)算出左心質(zhì)量指數(shù)后，將心肌組織采用4%中性甲醛固定。

1.5.3 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 取出固定的心肌組織，予梯度酒精脫水后，取左心室中部矢狀面切片，切片厚度約為5μm，石蠟包埋 ，然后進(jìn)行TUNEL法染色，記錄每個(gè)視野染色陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞所占百分比即為凋亡指數(shù)，計(jì)算各組病理切片凋亡指數(shù)。

1.5.4 Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá) 采用Western blot法，具體步驟簡(jiǎn)述如下：將提取好的心肌組織蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)膜后，分別加入 Bax、Caspase-3、Bcl-2一抗孵育過夜，完成二抗孵育后進(jìn)行顯示處理，分析光密度，最終結(jié)果以Bax、Caspase-3、Bcl-2和β-actin的光密度比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較

實(shí)驗(yàn)大鼠共48只，因手術(shù)意外死亡的有3只（結(jié)扎后嚴(yán)重心律失常或灌流過程中死亡），死亡率為6.25%。其中空白組、假手術(shù)組無死亡，模型組1只，死亡率為8.33%，黃芪保心湯組2只，死亡率為16.67%。2.2 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)變化比較

見表1。各組大鼠心率無明顯差異（P>0.05），與空白組、假手術(shù)組相比，模型組及黃芪保心湯組+dp/dt、-dp/dt、LVSP、LVEDP均有明顯差異（P<0.01），而空白組與假手術(shù)組比較無明顯差異（P>0.05），與模型組相比，黃芪保心湯組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)變化比較（±s）

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)變化比較（±s）

與空白組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。下同。

組 別HR（BPM） +dp/dtmax（mmHg/s） -dp/dtmax（mmHg/s）LVSP（mmHg）LVEDP（mmHg）空白組假手術(shù)組模型組340.72±36.58 4176.34±713.62 －3011.47±506.53 348.42±43.21 3946.52±682.77 －2901.35±561.79 352.35±54.26 2531.68±702.54▲▲**－2126.62±479.78▲▲**135.85±11.74 20.12±6.34 130.67±11.24 22.36±5.94 120.34±8.57▲▲**10.85±3.747▲▲**黃芪保心湯組347.62±39.87 3154.72±602.39▲▲**★★－2545.32±520.83▲▲**★★128.44±9.2▲▲**★16.42±6.08▲▲**★★

2.3 各組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)比較

見表2。各組大鼠體質(zhì)量無明顯差異（P>0.05），模型組左室質(zhì)量高于空白組和假手術(shù)組（P<0.05），其余各組無明顯差異 （P>0.05），模型組左心室質(zhì)量指數(shù)（LVWI=LVW/BW）高于空白組、假手術(shù)組和黃芪保心湯組（P<0.05或P<0.01）。

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞左心室質(zhì)量指數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞左心室質(zhì)量指數(shù)比較（±s）

組別BW（g） LVW（g） LVWI（mg/g）空白組假手術(shù)組模型組369.48±35.52 0.85±0.07 2.30±0.19 355.64±41.39 0.82±0.08 2.31±0.22 337.00±37.94 1.06±0.12▲*3.15±0.29▲▲**黃芪保心湯組362.42±38.74 0.96±0.08 2.65±0.16▲*★

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較

見表3。空白組與假手術(shù)組無顯著差異 （P> 0.05），模型組、黃芪保心湯組明顯高于空白組和假手術(shù)組（P<0.05或P<0.01），模型組高于黃芪保心湯組（P<0.05或P<0.01）。

表3 各組大鼠心肌組織凋亡指數(shù)比較（±s）

表3 各組大鼠心肌組織凋亡指數(shù)比較（±s）

組別 凋亡指數(shù)（%）空白組假手術(shù)組模型組3.62±0.75 3.41±0.67 23.46±6.43▲▲**黃芪保心湯組12.54±3.65▲▲**★★

2.5 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)水平比較

見表4。Bax空白組與假手術(shù)組無顯著差異（P>0.05），模型組、黃芪保心湯組組明顯高于空白組和假手術(shù)組（P<0.01），模型組高于黃芪保心湯組（P<0.01）。Bcl-2黃芪保心湯組明顯高于空白組、假手術(shù)組和模型組（P<0.01），空白組、假手術(shù)組和模型組3組之間無明顯差異 （P>0.05）。Caspase-3模型組明顯高于空白組、假手術(shù)組和黃芪保心湯組（P<0.01），空白組、假手術(shù)組和黃芪保心湯組3組之間無明顯差異（P>0.05）。

表4 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2，Caspase-3表達(dá)水平比較（±s）

表4 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2，Caspase-3表達(dá)水平比較（±s）

組別Bax Bcl-2 Caspase-3空白組假手術(shù)組模型組0.36±0.05 0.68±0.09 0.32±0.02 0.41±0.07 0.59±0.07 0.39±0.03 0.84±0.13▲▲**0.66±0.11 0.69±0.08▲▲**黃芪保心湯組0.67±0.11▲▲**★★1.56±0.25▲▲**★★0.37±0.03★★

圖1 各組Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白電泳圖

3 討 論

細(xì)胞凋亡是在細(xì)胞外部因素刺激下由基因調(diào)控的主動(dòng)性死亡過程，目前認(rèn)為心肌細(xì)胞凋亡參與心肌缺血過程，心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血損傷的重要形式［3-7］，因此干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡對(duì)缺血損傷中心肌細(xì)胞的保護(hù)具有重要的作用。凋亡的發(fā)生與基因調(diào)節(jié)有關(guān)，凋亡基因與抗凋亡基因的相互協(xié)調(diào)作用決定了凋亡的啟動(dòng)或抑制，常見的與凋亡有關(guān)的調(diào)控基因有Bcl-2、Bax和 Caspase-3基因。Bcl-2主要分布在線粒體外膜，Bcl-2高表達(dá)可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，阻止超氧化物的產(chǎn)生和作用，可以調(diào)節(jié)膜通透性，抑制細(xì)胞凋亡；Bax基因與Bcl-2基因具有高度的同源序列，二者可相互結(jié)合形成結(jié)合體，當(dāng)Bax高表達(dá)時(shí)，其可與Bcl-2結(jié)合形成異二聚體，抑制Bcl-2活性，改變線粒體膜的通透性，引起線粒體損傷，促進(jìn)凋亡［8］。Caspase作為一種特異天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑中居于重要位置，Caspase可通過死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡通路，參與凋亡過程。Caspase-3是Caspase家族中重要的亞型，Caspase-3表達(dá)增加、刺激激活是凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路中的重要環(huán)節(jié)，是參與調(diào)節(jié)和執(zhí)行細(xì)胞凋亡最重要的蛋白酶之一［9-10］。

黃芪保心湯由黃芪、生蒲黃、水蛭、丹參、白芥子等藥物組成，方中黃芪大補(bǔ)元?dú)?，用以為君，?shí)取“氣為血之帥，氣行則血行”之意。蒲黃、水蛭能行血祛瘀，丹參活血通脈，白芥子“能搜剔脅下及表里膜外之痰”，諸藥合用，共奏益氣活血、祛痰化濁之功效。前期研究表明，黃芪保心湯能顯著提高缺血心肌中降鈣素基因相關(guān)肽水平、清除自由基，改善心肌缺血后血管內(nèi)皮損傷，減輕缺血心肌超微結(jié)構(gòu)損傷，尤其是線粒體腫結(jié)構(gòu)損傷，從而起到保護(hù)心肌的作用［11-14］。且黃芪保心湯中之黃芪能改善心肌能量代謝，增強(qiáng)心肌收縮力，改善心肌缺血［15］。本實(shí)驗(yàn)通過冠狀動(dòng)脈結(jié)扎造成心肌缺血模型，從血流動(dòng)力學(xué)、病理學(xué)以及生物化學(xué)角度上綜合評(píng)價(jià)黃芪保心湯對(duì)大鼠心肌缺血的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，黃芪保心湯可改善心肌缺血大鼠+dp/dt、-dp/dt、LVSP、LVEDP，從而改善血流動(dòng)力學(xué)；黃芪保心湯能夠降低心肌缺血大鼠左室質(zhì)量指數(shù)，減少心肌細(xì)胞凋亡，其減少凋亡機(jī)制可能與降低心肌缺血大鼠心肌組織Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)，增加Bcl-2蛋白表達(dá)相關(guān)。

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Effect of Astragalus Heart-Protecting Decoction （AHPD）on Hemodynam ic and Apoptosis in M yocardial Ischem ia Rats

PAN Yongjun，F(xiàn)ANG Bangjiang，YU Zhigang，et al.Chinese Medicine Hospital of HubeiMed-ical Group，Hubei，Huangshi435000，China.

Objective：To investigate the effect of AHPD on hemodynamic，apoptosis and expression of Bcl-2，Bax and Caspase-3 inmyocardial ischemia induced by ligation of coronary artery（LCA）.M ethods：48 male SD rats were randomly divided into four groups：the blank group，the sham operation group，the model group and AHPD group.Except the blank group and the sham operation group，myocardial ischemia injury model was induced by ligation of coronary artery in rats.In the sham operation group，only thoracotomy was not performed.The effects of AHPD on myocardial ischemia，hemodynamics，left ventricular mass index，myocardial cell apoptosis，and expression of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 proteins in coronary artery ligated rats were observed 4 weeks after corresponding drug intervention.Results：AHPD could improve the hemodynamics，reduce apoptosis，decrease the levels of Bax and Caspase-3，and increase the level of Bcl-2 in ratswithmyocardial ischemia，which had significant difference（P<0.05，or P<0.01）.Conclusion：AHPD has a good effect on anti-myocardial-ischemia，and its mechanism is related to the reduce ofmyocardial apoptosis and the expression of BAX and Caspase-3，and the increase of the expression of Bcl-2.

Astragalus Heart-Protecting Decoction；Hemodynamic；Apoptosis

R285.5

A

1004-745X（2017）07-1175-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.013

2017-04-25）

上海中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合高原學(xué)科面上項(xiàng)目

△通信作者（電子郵箱：28679028@qq.com）