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天香丹干預(yù)冠心病穢濁痰阻證病人血漿miR-126表達水平變化研究
郭龍龍,安冬青,劉偉,孫龍飛
目的研究血漿miR-126在冠心病穢濁痰阻證病人的變化及天香丹的干預(yù)作用。方法收集冠心病病人40例及非冠心病病人20例,采集入院后24 h內(nèi)的清晨空腹靜脈血標本,冠心病病人口服天香丹28 d后清晨采集空腹靜脈血標本,以miR-39為參照基因,miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒提取血漿總microRNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并用SYBR Green I實時熒光定量PCR反應(yīng)檢測血漿中microRNA-126的相對表達量,分析microRNA相對表達量各組中的變化及其臨床應(yīng)用價值。結(jié)果非冠心病組血清中miR-126相對表達量0.86(0.81~0.90);冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療組血清中miR-126相對表達量1.10(0.99~1.20);冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹組血清中miR-126相對表達量0.71(0.61~0.81)。與非冠心病組比較,冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療組miR-126表達量顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(Z=-4.166,P=0.001);冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹組miR-126表達量差異無統(tǒng)計學意義(Z=-1.880,P=0.06);與基礎(chǔ)治療組比較,冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹組miR-126表達量明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(Z=-4.139,P=0.001)。依據(jù)miR-126在冠心病穢濁痰阻證病人與非冠心病血清中表達量的不同,利用受試者工作特征受試工作特征(ROC)曲線分析,曲線下面積(AUC)=0.886(95%CI:0.796~0.976,P=0.001),敏感性為72.5%,特異性為95.0%。結(jié)論在冠心病穢濁痰阻證病人血清中miR-126呈現(xiàn)高表達,根據(jù)ROC分析結(jié)果達到臨床應(yīng)用價值,是冠心病穢濁痰阻可選的診斷分子標志物,MiR-126在天香丹干預(yù)后表達量下降,說明miR-126有可能在冠心病發(fā)病過程中具有保護作用。天香丹可能通過干擾microRNA,繼而影響靶mRNA的降解和翻譯,治療冠心病。
冠心??;穢濁痰阻證;天香丹;miR-126;胸痹
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病,CAD)是世界上發(fā)病率和病死率最高的疾病之一,尤其是近年來冠心病呈現(xiàn)年輕化的趨勢[1],因此,應(yīng)更加深入地了解其發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后,從而為其早期診斷及治療提供有效的解決辦法。冠心病是動脈粥樣硬化導致器官病變的最常見類型,故冠心病的發(fā)生與動脈粥樣硬化(AS)的形成過程密切相關(guān)。冠心病形成機制有多種,現(xiàn)公認的是在各種危險因素(高血壓、高血脂、高血糖、肥胖、吸煙、感染等)的影響下,血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞產(chǎn)生過度的慢性炎性增生,導致動脈粥樣硬化,發(fā)生心血管事件[2]。microRNA(miRNA)是一組生物進化過程中高度保守的小RNA,不參與編碼,但在基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后起到調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等作用[3-4]。通過降解 mRNA 或抑制蛋白質(zhì)翻譯而調(diào)控基因的表達。大量研究表明:miRNA與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。miRNA可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)及功能,抑制炎癥反應(yīng)及內(nèi)皮細胞增殖、遷移、凋亡等參與動脈粥樣硬化,預(yù)防冠心病[7]。
miRNA作為疾病診斷及治療的研究已經(jīng)成為近期研究的熱點,近年來大量相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-1-2、miR-208、miR-499、miR-126等都有可能成為心肌梗死的生物學標志物,有研究表明miR-126為血管內(nèi)皮細胞表達最豐富的microRNA[8]。本研究觀察冠心病穢濁痰阻證病人血漿miR-126的表達水平變化以及天香丹的干預(yù)作用。
1.1 一般資料 選取新疆醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院收治的40例病人,按病人癥狀、體征心電圖、心肌酶譜、心臟超聲、冠狀動脈造影結(jié)果以及中醫(yī)四診合參,冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療病人20例,年齡(57±11)歲;冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹治療病人20例,年齡(55±12)歲。使用促凝管收集40例病人血液標本,分別定為冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療組和冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹組。另選取我院同期非冠心病病人20例血液樣本作為對照組,男9例,女11例,年齡(52±10)歲。3組年齡比較無統(tǒng)計學意義(P=0.079)。所有血液樣本均在收集后3 h內(nèi)處理,處理方法:于低溫離心機中以 4 ℃,1 200 r/min 離心 10 min。為進一步去除細胞碎片,離心后將上層血清移至一個新的 EP 管,再次進行離心,4 ℃條件下以12 000 r/min離心 5 min。將再次離心后的上清液進行分裝后(500 μL/管)保存于-80 ℃冰箱。保存待用。
1.2 主要試劑與儀器 miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒miScript II RT Kit和miScript SYBR?Green PCR Kit試劑盒均購置于德國QIAGEN公司,特異性反轉(zhuǎn)錄引物均由北京天根生化科技有限公司合成。分光光度計Nanodrop ND-1000購于美國ABI公司,無水乙醇、羥基乙醇等其他常規(guī)試劑和常規(guī)儀器均由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院實驗室提供。
1.3 血清總RNA提取 按miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒說明書操作提取血清中總RNA。通過分光光度計測定提取的RNA純度和濃度,以RNA在260 nm處吸光值與在280 nm處吸光值的比值(A260/A280)來表示RNA純度,A260/A280=1.9~2.1則認為提取的RNA純度較滿意。
1.4 反轉(zhuǎn)錄 miR-126及miR-39引物序列。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒MiScript II RT Kit合成cDNA,根據(jù)說明書要求分別加入總RNA、10x Nucleics Mix和5x miScript HiSpec Buffer和RNA酶抑制劑等,混合成總體積20 μL反應(yīng)液進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件:37 ℃ 60 min,95 ℃ 5 min,1個循環(huán),最后維持4 ℃。新合成的cDNA放置于-20 ℃保存待用。
1.5 實時熒光定量PCR 使用miScript SYBR?Green PCR Kit試劑盒進行定量,按試劑盒說明書分別加入融化2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix、10x miScript Precursor Assay、template cDNA,和 RNase-free water以及上游引物、下游引物,最后混合成總體積為20 μL反應(yīng)液 。定量PCR反應(yīng)條件:變性95 ℃3 min;退火58 ℃10 s,延伸65 ℃ 30 s,進行40個循環(huán)。每個樣本每種miRNA均重復(fù)2次,最后取平均值,并同時使用陰性對照(反應(yīng)液20 μL中,除2 μL的cDNA用2 μL的無RNA酶水代替外,其他成分均相同并同時進行定量PCR擴增)。用SDS 1.4軟件計算每個樣本的CT值。相對基因表達分析采用等式2-△△CT法,條件是目標基因和內(nèi)參基因的擴增效率均接近100%,且相互間的效率偏差<5%。
△△CT=△CT實驗組-△CT對照組
△CT實驗組 =CT目標基因?qū)嶒灲M-CT內(nèi)參基因?qū)嶒灲M
△△CT對照組 =CT目標基因?qū)φ战M -CT內(nèi)參基因?qū)φ战M
2-△△CT表示實驗組相對于對照組目的基因的表達倍數(shù)。選用miR-39作為內(nèi)參基因,對目的基因進行歸一化處理。
2.1 血清miR-126與內(nèi)參基因miR-39的CT值 非冠心病組、冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療組和冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹組miR-126的CT值分別為31.860±0.302,32.879±0.228,32.779±0.495,差異有統(tǒng)計學意義(F=48.78,P<0.001);內(nèi)參基因miR-39的CT值分別為22.957±0.371,23.378±0.876,23.398±0.972,差異無統(tǒng)計學意義(F=0.468,P=0.628)。miR-39將作為本研究的內(nèi)參基因來對目標基因標化處理。
2.2 血清miR-126相對表達量 非冠心病組血清中miR-126相對表達量0.86(0.81~0.90);冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療組血清中miR-126相對表達量1.10(0.99~1.20);冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹組血清中miR-126相對表達量0.71(0.61~0.81);與非冠心病組比較,冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療組表達量顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(Z=-4.166,P=0.001);冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹組表達量差異組無統(tǒng)計學意義(Z=-1.880,P=0.06);與基礎(chǔ)治療比較,基礎(chǔ)治療+天香丹組表達量明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(Z=-4.139,P=0.001)。
2.3 繪制受試者工作特征曲線 依據(jù)MiR-126在冠心病穢濁痰阻證病人與非冠心病血清中表達量的不同,利用受試者工作特征受試工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析,曲線下面積(area under the curve,AUC)=0.886(95%CI:0.796~0.976,P=0.001),敏感性為72.5%,特異性為95.0%。
血脂代謝相關(guān)microRNA的發(fā)現(xiàn)為心血管和代謝性疾病研究提供新的視野。最新的研究表明miRNA在冠心病的發(fā)生進展中起著重要的調(diào)控作用[9],microRNA與冠心病形成的重要基礎(chǔ)炎癥、脂代謝、動脈粥樣硬化等密切相關(guān)[10]。Harris等[11]發(fā)現(xiàn),miR-126 可以抑制血管黏附細胞因子1(VCAM-1)的表達和減少白細胞與內(nèi)皮細胞的相互作用從而參與到血管炎癥反應(yīng)之中;MicroRNA-125a-5p參與巨噬細胞對致動脈粥樣硬化脂質(zhì)的炎癥應(yīng)答[12];microRNAs17-5p-20a-106a[13]是通過調(diào)控AML-1以及M-CSF受體而調(diào)控單核細胞的生成,它與AML-1的mRNA3′UTR結(jié)合后,mRNA降解,阻礙了AML-1的翻譯,表明microRNA可通過其靶標以及靶標介導的通路參與調(diào)節(jié)單核細胞系的發(fā)育、分化,進而調(diào)控單核細胞參與炎癥反應(yīng)。miR370和miR122分別下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP-1c)和酶甘油二酯?;D(zhuǎn)移酶2(DGAT2)、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶1(Acc1)[14]減少血漿膽固醇水平,增加肝臟脂肪酸的氧化,減少肝臟脂肪酸和膽固醇合成率[15]。miRNA可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、細胞間黏附分子和各種炎癥因子的表達[16]、細胞周期進程和細胞增殖、內(nèi)皮細胞的功能、血管生成、斑塊形成和破裂氧化應(yīng)激、血小板活化,而直接或間接參與AS的病理生理過程[10,17-18],通過microRNA的各種靶標調(diào)控各種參與AS的細胞和各種炎性細胞分子等進而影響AS的進程。在機體發(fā)生冠心病后,往往會伴有miRNA表達異常,其調(diào)節(jié)“保護”基因或“破壞”基因的作用,且循環(huán)miRNA在血清/血漿中穩(wěn)定性較好,循環(huán)miRNA反映冠心病中的miRNA表達水平。作為生物檢測樣本,血清具有取材方便、相對無創(chuàng),并可連續(xù)體外檢測的優(yōu)點,使得miRNA作為冠心病生物學標志表現(xiàn)出極大應(yīng)用前景[19-20]。對microRNA與冠心病關(guān)系的研究將促進其診斷水平的提高,對尋找其特異性診斷指標和促進新藥開發(fā)的進展有一定幫助。前期研究表明miRNA-126對冠心病的發(fā)生發(fā)展有保護性作用,本研究在其基礎(chǔ)上使用天香丹治療,為中醫(yī)藥治療冠心病的治療靶點及作用提供分子生物學標志物。
[1] 中華醫(yī)學會心血管病學分會介入心臟病學組.中國經(jīng)皮冠狀動脈介入治療指南2012(簡本)[C].2012長安國際心血管病論壇,2012:1-5.
[2] Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease[J].N Engl J Med,1999,340(2): 115-126.
[3] Zheng L,Xu CC,Chen WD,et al.MicroRNA-155 regulates angiotensin Ⅱ type 1 receptor expression and phenotypic differentiation in vascular adventitial fibroblasts[J].Biochemical & Biophysical Research Communications,2010,400(4):483-488.
[4] Zhao Y,Samal E,Srivastava D.Serum response factor regulates a muscle-specifie microRNA that targets Hand2 during Cardiogenesi.Nature,2005,436(7048):214-220.
[5] Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions[J].Cell,2009,136(2):215-233.
[6] Rao PK,Toyama Y,Chiang HR,et al.Loss of cardiac microRNA-mediated regulation leads to dilated cardiomyopathy and heart failure[J].Circulation Research,2009,105(6):585.
[7] Horie T,Baba O,Kuwabara Y,et al.MicroRNAs and lipoprotein metabolism[J].J Atheroscler Thromb,2014,21:17-22.
[8] Kuehbacher A,Urbich C,Zeiher AM,et al.Role of Dicer and Drosha for endothelial microRNA expression and angiogenesis [J].Circ Res,2007,101:59-68.
[9] Ding XQ,Ge PC,Liu Z,et al.Interaction between microRNA expression and classical risk factors in the risk of coronary heart disease[J].Scientific Reports,2015,5(2):14925.
[10] Zhu N,Zhang D,Chen S,et al.Endothelial enriched microRNAs regulate angiotensin Ⅱ-induced endothelial inflammation and migration[J].Atherosclerosis,2011,215(2):286-293.
[11] Harris TA,Yamakuchi M,F(xiàn)erlito M,et al.MicroRNA126 regulates endot helial expression of vascular cell adhesion molecule 1[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(5):1516-1521.
[12] 楊蕾,張國兵.MicroRNA和動脈粥樣硬化的關(guān)系[J].中國動脈硬化雜志,2010,18(11):916-918.
[13] Fontana L,Pelosi E,Greco P,et al.MicroRNAs 17-5p-20a-106a control monocy topoiesis through AML-1 targeting and M-CSF receptor up regulation[J].Nat Cell Biol,2007,9(7):775-787.
[14] Dumont I,Peri KG,Abran D,et al.MicroRNA-370 controls the expression of microRNA-122 and Cpt1alpha and affects lipid metabolism.[J].Journal of Lipid Research,2010,51(6):1513-1523.
[15] Esau C,Davis S,Murray SF,et al.miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting[J].Cell Metabolism,2006,3(2):87-98.
[16] Watanabe S,Mu W,Kahn A,et al.Role of JAK/STAT pathway in IL-6 Induced activation of vascular smooth muscle cells[J].Am J Nephrol,2004,24(4):387-392.
[17] Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions[J].Cell,2009,136(2):215-233.
[18] 智宏,任利群,馬根山,等.冠心病合并代謝綜合征者炎癥因子水平與冠脈病變程度的研究[J].東南大學學報(醫(yī)學版),2009(1):10-12.
[19] Lawrie CH,Gal S,Dunlop HM,et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma[J].British Journal of Haematology,2008,141(5):672-675.
[20] Fichtlscherer S,De Rosa S,F(xiàn)ox H,et al.Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease[J].Circ Res,2010,107(5):677-684.
R541.4 R256.2
B
10.3969/j.issn.1672-1349.2017.22.015
1672-1349(2017)22-2850-03
新疆維吾爾自治區(qū)重點實驗室開放課題(No.2015KL016)
新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院(烏魯木齊 830000)
安冬青,E-mail:326468701@qq.com
信息:郭龍龍,安冬青,劉偉,等.天香丹干預(yù)冠心病穢濁痰阻證病人血漿miR-126表達水平變化研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2017,15(22):2850-2852.
2017-03-21)
(本文編輯 郭懷印)