天香丹干預(yù)冠心病穢濁痰阻證病人血漿miR-126表達水平變化研究

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天香丹干預(yù)冠心病穢濁痰阻證病人血漿miR-126表達水平變化研究

郭龍龍，安冬青，劉偉，孫龍飛

目的研究血漿miR-126在冠心病穢濁痰阻證病人的變化及天香丹的干預(yù)作用。方法收集冠心病病人40例及非冠心病病人20例，采集入院后24 h內(nèi)的清晨空腹靜脈血標本，冠心病病人口服天香丹28 d后清晨采集空腹靜脈血標本，以miR-39為參照基因，miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒提取血漿總microRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用SYBR Green I實時熒光定量PCR反應(yīng)檢測血漿中microRNA-126的相對表達量，分析microRNA相對表達量各組中的變化及其臨床應(yīng)用價值。結(jié)果非冠心病組血清中miR-126相對表達量0.86(0.81～0.90)；冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療組血清中miR-126相對表達量1.10(0.99～1.20)；冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹組血清中miR-126相對表達量0.71(0.61～0.81)。與非冠心病組比較，冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療組miR-126表達量顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-4.166，P=0.001)；冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹組miR-126表達量差異無統(tǒng)計學意義(Z=-1.880，P=0.06)；與基礎(chǔ)治療組比較，冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹組miR-126表達量明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-4.139，P=0.001)。依據(jù)miR-126在冠心病穢濁痰阻證病人與非冠心病血清中表達量的不同，利用受試者工作特征受試工作特征(ROC)曲線分析，曲線下面積(AUC)=0.886(95%CI：0.796～0.976，P=0.001)，敏感性為72.5%，特異性為95.0%。結(jié)論在冠心病穢濁痰阻證病人血清中miR-126呈現(xiàn)高表達，根據(jù)ROC分析結(jié)果達到臨床應(yīng)用價值，是冠心病穢濁痰阻可選的診斷分子標志物，MiR-126在天香丹干預(yù)后表達量下降，說明miR-126有可能在冠心病發(fā)病過程中具有保護作用。天香丹可能通過干擾microRNA，繼而影響靶mRNA的降解和翻譯，治療冠心病。

冠心??；穢濁痰阻證；天香丹；miR-126；胸痹

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病，CAD)是世界上發(fā)病率和病死率最高的疾病之一，尤其是近年來冠心病呈現(xiàn)年輕化的趨勢[1]，因此，應(yīng)更加深入地了解其發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后，從而為其早期診斷及治療提供有效的解決辦法。冠心病是動脈粥樣硬化導致器官病變的最常見類型，故冠心病的發(fā)生與動脈粥樣硬化(AS)的形成過程密切相關(guān)。冠心病形成機制有多種，現(xiàn)公認的是在各種危險因素(高血壓、高血脂、高血糖、肥胖、吸煙、感染等)的影響下，血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞產(chǎn)生過度的慢性炎性增生，導致動脈粥樣硬化，發(fā)生心血管事件[2]。microRNA(miRNA)是一組生物進化過程中高度保守的小RNA，不參與編碼，但在基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后起到調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等作用[3-4]。通過降解 mRNA 或抑制蛋白質(zhì)翻譯而調(diào)控基因的表達。大量研究表明：miRNA與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。miRNA可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)及功能，抑制炎癥反應(yīng)及內(nèi)皮細胞增殖、遷移、凋亡等參與動脈粥樣硬化，預(yù)防冠心病[7]。

miRNA作為疾病診斷及治療的研究已經(jīng)成為近期研究的熱點，近年來大量相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-1-2、miR-208、miR-499、miR-126等都有可能成為心肌梗死的生物學標志物，有研究表明miR-126為血管內(nèi)皮細胞表達最豐富的microRNA[8]。本研究觀察冠心病穢濁痰阻證病人血漿miR-126的表達水平變化以及天香丹的干預(yù)作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取新疆醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院收治的40例病人，按病人癥狀、體征心電圖、心肌酶譜、心臟超聲、冠狀動脈造影結(jié)果以及中醫(yī)四診合參，冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療病人20例，年齡(57±11)歲；冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹治療病人20例，年齡(55±12)歲。使用促凝管收集40例病人血液標本，分別定為冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療組和冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹組。另選取我院同期非冠心病病人20例血液樣本作為對照組，男9例，女11例，年齡(52±10)歲。3組年齡比較無統(tǒng)計學意義(P=0.079)。所有血液樣本均在收集后3 h內(nèi)處理，處理方法：于低溫離心機中以 4 ℃，1 200 r/min 離心 10 min。為進一步去除細胞碎片，離心后將上層血清移至一個新的 EP 管，再次進行離心，4 ℃條件下以12 000 r/min離心 5 min。將再次離心后的上清液進行分裝后(500 μL/管)保存于-80 ℃冰箱。保存待用。

1.2 主要試劑與儀器 miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒miScript II RT Kit和miScript SYBR?Green PCR Kit試劑盒均購置于德國QIAGEN公司，特異性反轉(zhuǎn)錄引物均由北京天根生化科技有限公司合成。分光光度計Nanodrop ND-1000購于美國ABI公司，無水乙醇、羥基乙醇等其他常規(guī)試劑和常規(guī)儀器均由新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院實驗室提供。

1.3 血清總RNA提取 按miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒說明書操作提取血清中總RNA。通過分光光度計測定提取的RNA純度和濃度，以RNA在260 nm處吸光值與在280 nm處吸光值的比值(A260/A280)來表示RNA純度，A260/A280=1.9～2.1則認為提取的RNA純度較滿意。

1.4 反轉(zhuǎn)錄 miR-126及miR-39引物序列。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒MiScript II RT Kit合成cDNA，根據(jù)說明書要求分別加入總RNA、10x Nucleics Mix和5x miScript HiSpec Buffer和RNA酶抑制劑等，混合成總體積20 μL反應(yīng)液進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，1個循環(huán)，最后維持4 ℃。新合成的cDNA放置于-20 ℃保存待用。

1.5 實時熒光定量PCR 使用miScript SYBR?Green PCR Kit試劑盒進行定量，按試劑盒說明書分別加入融化2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix、10x miScript Precursor Assay、template cDNA，和 RNase-free water以及上游引物、下游引物，最后混合成總體積為20 μL反應(yīng)液 。定量PCR反應(yīng)條件：變性95 ℃3 min；退火58 ℃10 s，延伸65 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)。每個樣本每種miRNA均重復(fù)2次，最后取平均值，并同時使用陰性對照(反應(yīng)液20 μL中，除2 μL的cDNA用2 μL的無RNA酶水代替外，其他成分均相同并同時進行定量PCR擴增)。用SDS 1.4軟件計算每個樣本的CT值。相對基因表達分析采用等式2-△△CT法，條件是目標基因和內(nèi)參基因的擴增效率均接近100%，且相互間的效率偏差<5%。

△△CT=△CT實驗組-△CT對照組

△CT實驗組 =CT目標基因?qū)嶒灲M-CT內(nèi)參基因?qū)嶒灲M

△△CT對照組 =CT目標基因?qū)φ战M -CT內(nèi)參基因?qū)φ战M

2-△△CT表示實驗組相對于對照組目的基因的表達倍數(shù)。選用miR-39作為內(nèi)參基因，對目的基因進行歸一化處理。

2 結(jié) 果

2.1 血清miR-126與內(nèi)參基因miR-39的CT值 非冠心病組、冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療組和冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹組miR-126的CT值分別為31.860±0.302，32.879±0.228，32.779±0.495，差異有統(tǒng)計學意義(F=48.78，P<0.001)；內(nèi)參基因miR-39的CT值分別為22.957±0.371，23.378±0.876，23.398±0.972，差異無統(tǒng)計學意義(F=0.468，P=0.628)。miR-39將作為本研究的內(nèi)參基因來對目標基因標化處理。

2.2 血清miR-126相對表達量 非冠心病組血清中miR-126相對表達量0.86(0.81～0.90)；冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療組血清中miR-126相對表達量1.10(0.99～1.20)；冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹組血清中miR-126相對表達量0.71(0.61～0.81)；與非冠心病組比較，冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療組表達量顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-4.166，P=0.001)；冠心病穢濁痰阻證基礎(chǔ)治療+天香丹組表達量差異組無統(tǒng)計學意義(Z=-1.880，P=0.06)；與基礎(chǔ)治療比較，基礎(chǔ)治療+天香丹組表達量明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-4.139，P=0.001)。

2.3 繪制受試者工作特征曲線 依據(jù)MiR-126在冠心病穢濁痰阻證病人與非冠心病血清中表達量的不同，利用受試者工作特征受試工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析，曲線下面積(area under the curve，AUC)=0.886(95%CI：0.796～0.976，P=0.001)，敏感性為72.5%，特異性為95.0%。

3 討 論

血脂代謝相關(guān)microRNA的發(fā)現(xiàn)為心血管和代謝性疾病研究提供新的視野。最新的研究表明miRNA在冠心病的發(fā)生進展中起著重要的調(diào)控作用[9]，microRNA與冠心病形成的重要基礎(chǔ)炎癥、脂代謝、動脈粥樣硬化等密切相關(guān)[10]。Harris等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-126 可以抑制血管黏附細胞因子1(VCAM-1)的表達和減少白細胞與內(nèi)皮細胞的相互作用從而參與到血管炎癥反應(yīng)之中；MicroRNA-125a-5p參與巨噬細胞對致動脈粥樣硬化脂質(zhì)的炎癥應(yīng)答[12]；microRNAs17-5p-20a-106a[13]是通過調(diào)控AML-1以及M-CSF受體而調(diào)控單核細胞的生成，它與AML-1的mRNA3′UTR結(jié)合后，mRNA降解，阻礙了AML-1的翻譯，表明microRNA可通過其靶標以及靶標介導的通路參與調(diào)節(jié)單核細胞系的發(fā)育、分化，進而調(diào)控單核細胞參與炎癥反應(yīng)。miR370和miR122分別下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP-1c)和酶甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶2(DGAT2)、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶1(Acc1)[14]減少血漿膽固醇水平，增加肝臟脂肪酸的氧化，減少肝臟脂肪酸和膽固醇合成率[15]。miRNA可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、細胞間黏附分子和各種炎癥因子的表達[16]、細胞周期進程和細胞增殖、內(nèi)皮細胞的功能、血管生成、斑塊形成和破裂氧化應(yīng)激、血小板活化，而直接或間接參與AS的病理生理過程[10，17-18]，通過microRNA的各種靶標調(diào)控各種參與AS的細胞和各種炎性細胞分子等進而影響AS的進程。在機體發(fā)生冠心病后，往往會伴有miRNA表達異常，其調(diào)節(jié)“保護”基因或“破壞”基因的作用，且循環(huán)miRNA在血清/血漿中穩(wěn)定性較好，循環(huán)miRNA反映冠心病中的miRNA表達水平。作為生物檢測樣本，血清具有取材方便、相對無創(chuàng)，并可連續(xù)體外檢測的優(yōu)點，使得miRNA作為冠心病生物學標志表現(xiàn)出極大應(yīng)用前景[19-20]。對microRNA與冠心病關(guān)系的研究將促進其診斷水平的提高，對尋找其特異性診斷指標和促進新藥開發(fā)的進展有一定幫助。前期研究表明miRNA-126對冠心病的發(fā)生發(fā)展有保護性作用，本研究在其基礎(chǔ)上使用天香丹治療，為中醫(yī)藥治療冠心病的治療靶點及作用提供分子生物學標志物。

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R541.4 R256.2

B

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.22.015

1672-1349(2017)22-2850-03

新疆維吾爾自治區(qū)重點實驗室開放課題(No.2015KL016)

新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院(烏魯木齊 830000)

安冬青，E-mail：326468701@qq.com

信息：郭龍龍，安冬青，劉偉，等.天香丹干預(yù)冠心病穢濁痰阻證病人血漿miR-126表達水平變化研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(22)：2850-2852.

2017-03-21)

(本文編輯 郭懷印)