紫花苜蓿對銅的吸收、積累和耐受機制研究

張麗萍+沈亞婷

摘 要 采用原位微區(qū)X射線熒光分析法（In-situ micro-X-ray fluorescence spectrometry， μ-XRF）和分步提取技術(shù)， 研究了苜蓿幼苗中Cu原位微區(qū)分布特征及其根莖葉中Cu的不同結(jié)合形態(tài)。結(jié)果表明， 苜蓿根部富集Cu濃度高達12.06 mg/g， 是莖的8倍， 葉的4.9倍。微區(qū)分布結(jié)果表明， 過量Cu暴露下的苜蓿根部是富集Cu的主要部位， 且在根莖交界處存在Cu的阻隔屏障， 以減輕過量Cu對地上部分的毒害作用。過量Cu（大于50 μmol/L時）還抑制了苜蓿對Zn和Ca的向上吸收， 增強了苜蓿對Fe的吸收， 但對K和Mn的吸收影響不明顯。亞細胞分步提取結(jié)果表明， 根細胞中主要通過形成難溶的殘渣態(tài)（41%）和細胞壁螯合態(tài)（20%）實現(xiàn)對過量Cu的固定； 而在莖中則以疏水蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)、細胞壁結(jié)合態(tài)、殘渣態(tài)、水溶態(tài)等4種形式存在， 以進一步減少過量Cu向葉中輸送； 在葉中， 進入葉細胞的過量Cu主要以液泡區(qū)隔和難溶殘渣態(tài)形式存在， 以實現(xiàn)對Cu的耐受和解毒。

關(guān)鍵詞 紫花苜蓿； 銅； 植物分步提?。?原位微區(qū)X射線熒光分析法； 形態(tài)

1 引 言

我國銅礦儲量豐富， 隨著對Cu需求量日益增加， 銅礦的大規(guī)模開采使得我國很多地區(qū)土壤中的Cu含量超標[1，2]， 典型工業(yè)區(qū)Cu的超標率甚至高達97%[3]。Cu是生物體必需的微量元素， 是生命過程中許多酶的固有組成成分之一， 在生物體中多以有機復合物形式（如金屬蛋白等）存在， 參與催化生物系統(tǒng)中涉及氧的電子傳遞和氧化還原反應(yīng)[4]。但過量的Cu會影響人類造血功能， 導致人體肝硬化、運動和知覺神經(jīng)障礙等[5]。Cu進入土壤后的賦存狀態(tài)相對長期穩(wěn)定， 易通過食物鏈進入人體， 嚴重危害人類健康[6，7]， 因此， 使用綠色環(huán)保、成本低廉的植物重金屬修復技術(shù)， 降低污染土壤中的重金屬含量， 成為研究的熱點。

紫花苜蓿是一種分布廣泛的豆科牧草， 具有較好的Cu耐受性和富集性， 對Cu污染土壤具有較好的植物修復前景。眾多學者在Cu暴露下紫花苜蓿對Cu的積累量及其生理生化特征變化等方面已開展了大量研究[8～14]。丁克強等[10]發(fā)現(xiàn)， 100 μg/g Cu土培60天時苜蓿根中積累28.71 μg/g Cu， 是莖的3倍； 王文星等[11]的研究顯示， 400 μg/g Cu盆栽30天， 根部積累量為地上部的26倍。過量Cu顯著增加苜蓿體內(nèi)ROS水平， 導致脂質(zhì)過氧化[12]， 抑制苜蓿光合作用和呼吸作用[13]。在高濃度Cu脅迫下， 紫花苜蓿體內(nèi)能產(chǎn)生復雜的耐受解毒機制。超過10 μmol/L Cu處理下就會引發(fā)苜蓿葉片中抗氧化機制， 在不同濃度的Cu脅迫下， 傅里葉變換紅外光譜分析顯示， 紫花苜蓿根中有機酸含量先降后升； 莖的生理生化特征變化不明顯； 高濃度處理時， 葉中的可溶性糖和可溶性蛋白濃度等先升后降[14]。關(guān)于Cu在苜蓿內(nèi)的轉(zhuǎn)運及耐受機制方面的研究尚不全面， 細胞內(nèi)小分子有機酸、氨基酸和金屬硫蛋白等物質(zhì)螯合過量Cu形成低毒性物質(zhì)， 或進行轉(zhuǎn)運區(qū)隔處理， 以減少細胞質(zhì)中自由Cu2+濃度， 降低毒害作用。Wang等[15]對Cd應(yīng)激下兩種紫花苜蓿提取， 發(fā)現(xiàn)都產(chǎn)生了MT2a-和MT2b-兩大類金屬硫蛋白。在高濃度Pb處理下， 進入苜蓿根表皮細胞中的Pb有63%儲存在液泡中[16]。Printz等[17]的研究表明， Cu在苜蓿莖中優(yōu)先與煙草胺結(jié)合以阻斷Cu的向上遷移。在30～100 μmol/L Cu處理時， 苜蓿中主要的生物巰基化合物（hGSH、Cys和GSH）總量下降， 但各物種比例維持不變， 未檢測到PC [9]； 對紫花苜蓿莖部的Cu進行微區(qū)定位， 發(fā)現(xiàn)Cu沉積在莖的形成層。紫花苜蓿對Cu的吸收、富集和解毒的機理尚需進一步探索。

原位微區(qū)X射線熒光分析法（Micro-X-ray fluorescence spectrometry， μ-XRF）可以獲得元素納米-微米尺度的空間分布特征和元素相關(guān)性數(shù)據(jù)， 揭示元素在樣品中的動態(tài)分布過程和生物代謝機理[18，19]。開展Cu在紫花苜蓿體內(nèi)的原位無損微區(qū)分布和結(jié)合形態(tài)的特征研究是研究苜蓿對Cu轉(zhuǎn)運區(qū)隔的關(guān)鍵。本研究采用μ-XRF技術(shù)和分步提取方法， 揭示過量Cu暴露下紫花苜蓿中Cu在器官和組織水平的分布特征， 以及在不同器官和組織中Cu的形態(tài)特征， 從而進一步探究紫花苜蓿對Cu積累、轉(zhuǎn)運的微觀過程， 揭示其對Cu的耐受機制。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

原位微區(qū)X射線熒光光譜儀（μ-XRF， 國家地質(zhì)實驗測試中心自主研發(fā)）； NexION 300型電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS， 美國Perkin Elmer公司）； LRH-GSI智能型人工氣候箱（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）； KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器； HR/T20M HR/T16M臺式高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

北方六級苜蓿種子（上海春茵草坪技術(shù)有限公司）； CuSO4·5H2O（分析純， 天津市光復科技有限公司）； HNO3（BV-Ⅲ級）、HCl（優(yōu)級純）和H2O2（MOS級）均購自北京化學試劑研究所； 崩潰酶（Sigma公司）； 三羥甲基氨基甲烷（Tris， 優(yōu)級純， 北京化學試劑公司）； 十二烷基硫酸鈉 （SDS， 化學純， 國藥集團化學試劑有限公司）； CH3COONH4（分析純， 國藥集團化學試劑有限公司）； Hoagland培養(yǎng)液配制使用的溶質(zhì)有：KH2PO4、ZnSO4·7H2O、Na2-EDTA、FeSO4·7H2O、Ca（NO3）2·4H2O和H2MoO4（分析純， 國藥集團化學試劑有限公司）； KNO3（分析純， 北京紅星化工廠）； MgSO4·7H2O、H3BO3和MnCl2·4H2O CuSO4·5H2O（分析純， 天津市光復科技有限公司）。

2.2 植物培養(yǎng)

選取顆粒大小一致的紫花苜蓿種子， 置于放有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中， 并置于光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)（溫度25℃、相對濕度50%， 光照強度4000 Lx， 光照時間16 h）。待長出一對子葉時， 置于Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)兩周左右。至長出第二片真葉時， 選取長勢一致的植株， 移苗至浮標上， 在不同濃度梯度的Cu溶液中暴露一周。每個濃度下設(shè)3組重復， 每組19棵苗。收獲的植株分為地下部分（根）和地上部分（莖葉）， 用水清洗多次后， 用去離子水和超純水分別清洗3次， 40 ℃干燥10 h后測干重， 分析Cu對苜蓿生長情況和生物量的影響。

用同樣培養(yǎng)方法在1000 μmol/L Cu溶液中培養(yǎng)紫花苜蓿一周后收獲， 分根莖葉進行不同器官Cu濃度總量分析和Cu不同結(jié)合形態(tài)的分步提取實驗。另培養(yǎng)少數(shù)苜蓿， 發(fā)芽后立即用浮標移入Cu溶液（0、50和1000 μmol/L）中培養(yǎng)一周， 用于μ-XRF分析。

2.3 苜蓿根莖葉中Cu濃度測定

干燥后樣品使用密閉高壓釜在HNO3-H2O2體系中以150℃高溫消解10 h。消解液經(jīng)定容、稀釋、過濾（0.45 μm濾膜）后， 采用ICP-MS測試Cu含量。使用的標準物質(zhì)有GSB-1（大米）、GSB-3（玉米）和GSB-7（茶葉）。

2.4 苜蓿根莖葉中Cu的結(jié)合形態(tài)分布提取與分析

收獲的植物鮮樣干燥兩天后， 用液氮（

Symbolm@@ 196℃）打破細胞壁后， 研磨成均質(zhì)粉末。取50 mg于離心管中， 逐步用1 mL萃取液在超聲池中（超聲功率100%， 頻率40 kHZ， 溫度22℃）按以下順序依次提取[20]：（1）10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）用于提取細胞質(zhì)和液泡中水溶性的Cu； （2）含2%崩潰酶的10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）用于提取細胞壁中的Cu； （3）含1% SDS（十二烷基硫酸鈉）的10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）用于提取疏水蛋白質(zhì)結(jié)合的Cu； （4）10 mmol/L CH3COONH4（pH 4.6）用于提取小分子有機酸結(jié)合的Cu； （5）過濾， 檢測濾后殘渣中的Cu。每步萃取時間1 h， 萃取液冰浴10 min后， 4℃、15000 r/min高速冷凍離心15 min， 取上清液在相同條件下再次離心。所得四步的提取液用0.45 μm濾膜過濾， 在4℃放置片刻消除泡沫后， 用ICP-MS測定提取液中的Cu含量， 最后一步所得殘渣經(jīng)HNO3-H2O2消解后， 再用ICP-MS測定Cu含量。

2.5 苜蓿幼苗中Cu的原位微區(qū)分布測定

用原位微區(qū)X射線熒光光譜儀（μ-XRF）[21]分別對3種不同Cu濃度暴露下的苜蓿幼苗進行原位微區(qū)掃描， 通過毛細管聚焦技術(shù)將X射線聚焦成微束級別， 激發(fā)樣品后得到樣品中的元素特征X射線， 并使用Si漂移探測器探測熒光信號， 以實現(xiàn)對樣品微小區(qū)域的元素相對含量信息的分析[22]。儀器最小光斑可達18 μm， 用于譜峰識別的單點采譜時間為60 s。用于樣品微區(qū)掃描的參數(shù)設(shè)定為：電壓47.0 kV， 電流0.799 mA， 步長80 μm（1000 μmol/L Cu的幼苗采譜步長為50 μm）， 每點采譜時間為5 s。

3 結(jié)果與討論

3.1 Cu脅迫對苜蓿生長情況的影響

隨著Cu濃度遞增， 苜蓿生長受到的脅迫也逐漸增加。在50 μmol/L Cu培養(yǎng)下， 苜蓿開始出現(xiàn)部分植株矮小， 葉片萎黃， 側(cè)根減少等現(xiàn)象。植物葉片變黃是受重金屬脅迫下葉綠體被破壞、光催化反應(yīng)受損的典型癥狀[23]。Printz等[17]發(fā)現(xiàn)， 0.30 ～3.0 μmol/L Cu是紫花苜蓿最佳生長條件， Cu濃度超過3.0 μmol/L， 苜蓿開始產(chǎn)生毒害效應(yīng)； 10 μmol/L Cu暴露下就可觀察到葉片變黃的現(xiàn)象； 在1000 μmol/L Cu暴露下， 紫花苜蓿幾乎沒有側(cè)根發(fā)育， 且其主根較空白組變得細軟輕飄， 但并未致死， 表現(xiàn)出紫花苜蓿對Cu的良好耐性。

Cu的脅迫不僅影響植物葉片生理狀態(tài)， 還影響植物的生物量（圖1）。苜蓿干重隨Cu濃度的增加呈先下降后升高隨后維持相對穩(wěn)定的特征。苜蓿地上部變化曲線與總量基本相同的現(xiàn)象與紫花苜?？偵锪康淖兓饕艿厣喜可锪康淖兓绊懙膱蟮酪恢耓24]。50 μmol/L Cu暴露下， 苜蓿整體生物量顯著下降了31.4%， 表明50 μmol/L Cu很大程度上抑制了苜蓿的生長和新陳代謝。但在50～1000 μmol/L Cu脅迫期間， 苜蓿干重呈回升趨勢， 并維持平穩(wěn)。由此推測， 可能在超過50 μmol/L Cu脅迫時苜蓿體內(nèi)開始形成某種Cu的特殊耐受機制， 抵制了重金屬的進一步毒害作用， 以維持其相對正常的生長。

3.2 苜蓿對Cu的吸收富集能力

苜蓿對Cu有較強的積累能力， 其根部是積累富集Cu的主要場所， 減少了Cu對苜蓿地上部各器官的毒害[8]。由表1可見， 1000 μmol/L Cu中培養(yǎng)1周后的紫花苜蓿各器官中Cu積累量為根>葉>莖。結(jié)果顯示苜蓿根部是主要積累Cu的部位， 其積累量達到12.1 mg/g， 積累濃度是莖的8倍， 葉的4.9倍。苜蓿表現(xiàn)出對銅的高度富集能力。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)100 μmol/L Cu溶液培養(yǎng)7天后， 苜蓿中Cu含量即達到4.42 mg/g； Flores-Caceres[9]實驗發(fā)現(xiàn)半水培15天后的苜蓿在100 μmol/L Cu溶液培養(yǎng)7天后， 其根中Cu積累量為410 μg/g， 是嫩枝的19倍、空白組的5倍。以上實驗結(jié)論與本實驗相近， 都顯示紫花苜蓿具有高Cu耐受性， 且主要在根中積累解毒， 其次在葉和莖中少量積累以減少毒害效應(yīng)。

3.3 苜蓿中Cu的原位微區(qū)分布

毒性元素侵害植物主要有葉、莖和根3條途徑， 其中根是最主要的途徑[25]。μ-XRF是研究元素微區(qū)分布特征的重要手段， 因此， 本研究采用μ-XRF研究苜蓿對Cu的吸收。剛發(fā)芽的紫花苜蓿幼苗用浮標分別移入3個不同濃度梯度的Cu暴露液中， 7天后植株的生長狀態(tài)如圖2所示， 50 μmol/L Cu中暴露7天的苜蓿幼苗與空白組均已生長出真葉， 1000 μmol/L Cu培養(yǎng)7天后明顯抑制了植物真葉的生長， 取樣時仍為無真葉的子葉狀態(tài)。

由于根中Cu含量最高， 故將50 μmol/L Cu暴露下的苜蓿根進行μ-XRF單點能譜分析， 確認感興趣區(qū)的圈定范圍及元素特征譜線識別， 由圖3可見， 苜蓿根中顯示了明顯的CuKα特征峰。

苜蓿中的微區(qū)分布信息（圖4）顯示， 過量Cu脅迫時， 苜蓿根部富集大量Cu?？瞻捉M反映了Cu作為紫花苜蓿必需營養(yǎng)元素吸收和輸送時的分布狀態(tài)， 即根莖葉中的Cu含量相當， 且存在明顯的Cu連續(xù)分布區(qū)域， 地上部子葉邊緣處Cu含量也較多。50和1000 μmol/L Cu暴露下的苜蓿均表現(xiàn)出根尖向上濃度逐漸增加， 在根與莖的交接處達到Cu積累峰值的特征， 而苜蓿莖葉中Cu含量相對較少。表明受Cu脅迫的苜蓿主要通過根部富集， 且在根與莖的交界處形成屏障， 實現(xiàn)抑制過量Cu向上運輸， 從而減輕了對地上部分的毒害。

過量Cu不僅影響植物本身的Cu輸送和代謝平衡， 還影響了植物對其它元素的吸收。本研究表明， Cu過量明顯抑制苜蓿對Zn和Ca的向上輸送， 但增加了植株對Fe的吸收， 而對K和Mn的吸收的影響不明顯。 不同植物物種對Fe和Zn的吸收受Cu脅迫的影響并不一致， 但過量Cu會破壞Ca2+從植物根向莖的傳輸[26]。K+由于在植物中以離子態(tài)存在且具有較強移動性[27]， 因而受Cu脅迫的影響不大。

3.4 紫花苜蓿細胞中Cu的結(jié)合形態(tài)特征

苜蓿各器官中Cu的結(jié)合形態(tài)是了解其耐受和解毒機理的關(guān)鍵。根莖葉分步提取結(jié)果（圖5）表明， 苜蓿根部顯著富集大量的Cu， 抑制其向地上部遷移， 減緩了重金屬對地上部的毒害作用， 這與前面的結(jié)論一致。 在各個器官中Cu結(jié)合形態(tài)存在差異， 根中Cu在殘渣態(tài)中含量最高， 細胞壁結(jié)合態(tài)、水溶態(tài)和蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)次之， 且含量相當； 莖中Cu在4種結(jié)合態(tài)中的含量差異不大； 葉中Cu在水溶態(tài)和殘渣態(tài)中含量最高， 其次分別是細胞壁結(jié)合態(tài)和蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)。根莖葉中有機酸結(jié)合態(tài)的Cu含量均為最少， 說明小分子有機酸在紫花苜蓿對Cu耐性作用中不發(fā)揮主要作用。

植物根中細胞壁以及胞間層是吸收重金屬的主要場所[17]， 細胞質(zhì)[28]、細胞質(zhì)膜和根中小囊泡[29]能區(qū)隔存儲重金屬。實驗數(shù)據(jù)顯示根部主要的解毒方式為將Cu轉(zhuǎn)化為殘渣態(tài)， 從而與生命代謝過程相對隔離； 莖里主要為細胞間質(zhì)和液泡中儲存的水溶態(tài)Cu， 多余的Cu也可以在莖中形成細胞壁結(jié)合態(tài)； 葉中過量的Cu部分主要存在于細胞間質(zhì)和液泡中， 另一部分形成難溶的沉淀與生命代謝過程相對隔離。有研究者對Cd脅迫下的模式植物擬南芥用同樣方法進行分步提取[20]發(fā)現(xiàn)， 根中水溶態(tài)Cd比例最高（46%）， 葉中水溶態(tài)Cd含量最高（58%）， 這也顯示了不同植物種屬對元素的耐受性和解毒行為的差異。植物中Cu結(jié)合形態(tài)的分步提取技術(shù)提供了Cu在苜蓿各器官內(nèi)的分布信息， 為揭示苜蓿對Cu吸收轉(zhuǎn)運機制提供了重要信息。

4 結(jié) 論

不同Cu濃度脅迫下苜蓿生長情況的實驗表明， 過量Cu會抑制植物生長， 但并不致死， 苜蓿表現(xiàn)出一定的重金屬Cu耐受性。原位微區(qū)和消解測定苜蓿各器官Cu濃度的實驗表明， 苜蓿主要在根部積累大量Cu， 減少向上運輸， 從而抵制Cu脅迫帶來危害。根部主要通過形成難溶的殘渣態(tài)和細胞壁螯合態(tài)實現(xiàn)對過量Cu的固定， 且大量儲存于根莖分界點處； 部分可以通過植株根莖分界處進入向上輸送過程的Cu， 在莖中進一步通過與細胞壁或疏水蛋白質(zhì)結(jié)合， 形成殘渣態(tài)， 以水溶態(tài)形式停留于液泡， 降低向上輸送量； 葉中Cu主要區(qū)隔在液泡中， 形成難溶殘渣態(tài)儲存， 以降低毒性。過量的Cu明顯抑制了植物對Zn和Ca的向上吸收， 增強了Fe的吸收， 對K和Mn等元素的吸收影響較小。未來還需要借助多種形態(tài)分析手段深入探究Cu在苜蓿體內(nèi)具體的結(jié)合形態(tài)、在根莖葉亞細胞中的分布及含量。

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