NIRS結(jié)合TQ軟件對氯化銨摻假牛奶定量分析

范睿 周勇 孫曉凱 牛金葉 孫發(fā)哲 陳杰 孔玲 陳志偉

摘要 [目的]應用近紅外光譜法建立氯化銨摻假牛奶定量分析模型。[方法]氯化銨是提高牛奶中含氮量的典型摻假物質(zhì)，樣品直接使用近紅外光譜儀采用漫反射和三氯乙酸預處理后使用透射模塊分別掃描并建立定量分析模型，并對模型進行驗證。[結(jié)果]建立了漫反射氯化銨含量定量分析模型和透射氯化銨含量定量分析模型，后者模型更加準確可靠，均方根校正標準差（RMSEC）、相關系數(shù)（R2）、均方根預測標準差（RMSEP）分別為0.032 4、0.998 4、0.049 8，回收率為107.607 4%。[結(jié)論]三氯乙酸預處理后的透射模型更加精確，可以用于牛奶中氯化銨摻假檢測，為進一步研究牛奶中其他物質(zhì)摻假檢測提供借鑒。

關鍵詞 牛奶；近紅外；氯化銨；透射；漫反射

中圖分類號 TS252.7 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）07-0087-05

Quantitative Analysis of Ammonium Chloride Adulterated Milk by Near Infrared Spectroscopy Combined with TQ Software

FAN Rui， ZHOU Yong， SUN Xiao-kai， KONG Ling*， CHEN Zhi-wei* et al

（School of Life Sciences， Shandong University of Technology， Zibo， Shandong 255000）

Abstract [Objective] Near infrared spectroscopy （NIRS） technology was used for establish quantitative analysis model of ammonium chloride adulterated milk.[Method] Ammonium chloride is a kind of typical adulterated substance used to increase the nitrogen content of milk. The calibration models were built with infrared diffuse reflection spectrum and the near-infrared transmission spectrum of the samples with a pretreatment with trichloroacetic acid and then were validated.[Result] The root mean square error of cross （RMSEC）， the correlation coefficient （R2） and the root mean square error of prediction （RMSEP） of the established model was 0.032 4， 0.998 4， and 0.049 8 respectively. Recovery was 107.607 4%.[Conclusion] The overall results showed that the latter calibration model， which was developed with the near-infrared transmission spectrum of the samples with a pretreatment with trichloroacetic acid， could be more accurate and could be used for rapid analysis of ammonium chloride adulteration in milk.

Key words Milk；Near infrared spectroscopy（NIRS）；NH4Cl；Transmission；Diffuse reflection

牛奶含豐富的蛋白質(zhì)和人體必需的氨基酸及各種礦物質(zhì)，對人體具有重要的營養(yǎng)價值。然而牛奶的摻假問題由來已久，19世紀的英國倫敦，隨著奶源市場的變化，牛奶的摻水、染色、脫脂現(xiàn)象愈演愈烈，嚴重影響公眾健康[1]；2008年我國三鹿集團嬰幼兒配方奶粉添加“三聚氰胺”事件引起食品行業(yè)對安全監(jiān)管體制的探討[2]；2009、2011年“皮革奶事件”再度引起輿論熱議[3]。

自從1883年德國科學家Hammarsten從牛乳中分離出酪蛋白以來，到目前為止從乳中已經(jīng)分離了上百種蛋白質(zhì)[4]。乳蛋白是牛奶中的主要營養(yǎng)成分之一，它由多種氨基酸構(gòu)成，在維持機體組織生長、更新、參與各種化學反應、提供生理活動所需要的熱能等方面發(fā)揮著重要作用[5]。不法商家在利益的驅(qū)動下，向牛奶中摻入大量的水，同時向牛奶中摻入銨鹽、三聚氰胺、尿素等含有氮元素的物質(zhì)以提高“蛋白質(zhì)”的含量，其中氯化銨就是一個典型的摻假物質(zhì)。紅外光譜技術在全球食品工業(yè)中的應用越來越廣泛[6-8]，且已呈現(xiàn)快速增長趨勢[9-10]。紅外光譜技術的優(yōu)勢在于能對復雜的混合物進行有效準確地區(qū)分，隨著化學計量學方法的改善，可提取復雜的光譜信息，結(jié)合適當?shù)墓庾V預處理及建模方法，可以有效去除噪聲，解決光譜共線問題，得到準確可靠的預測模型[11]。

筆者配制不同梯度的氯化銨摻假牛奶樣品，使用近紅外光譜儀漫反射光纖模塊對樣品進行光譜掃描并建立模型，同時對摻假牛奶樣品進行三氯乙酸前處理，使用近紅外光譜儀透射模塊光譜掃描并建立模型，比較這2種方法對牛奶中氯化銨測定的差異，為牛奶摻假檢測奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料及主要試劑。

蒙牛純牛奶（批號1P20160720 AQ0321：52），購于淄博大潤發(fā)超市；三氯乙酸（20160308）、氯化銨（批號：20151010），購于國藥集團化學試劑有限公司；去離子水為實驗室自制。

1.1.2 主要儀器設備。

Nicolet 6700傅立葉變換近紅外光譜分析儀（配有Antaris透射分析和光纖分析系統(tǒng)）、ST 16R低溫冷凍離心機，美國Thermo Scientific公司；BSM 220.4電子天平（0.000 1 g），上海卓精電子科技有限公司；SY 5200臺式超聲波清洗機，上海聲源超聲波儀器設備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市鑫鑫實驗儀器有限公司；78-1磁力加熱攪拌器，上海上登實驗設備有限公司；Ominic 8.2.0.387光譜處理軟件、TQ Analyst 8.0.0.245建模軟件，美國Thermo Scientific公司。

1.2 樣品的制備

為了定量分析牛奶中氯化銨的含量，同時為了擴大樣本的適用性和代表性，該試驗配制了含量1～20 g/L的氯化銨牛奶摻假樣本。試驗設計方面，設置了20個濃度梯度、3個平行樣本、3個空白樣本，共計63個樣本，其中摻假樣本具體如表1所示。為了保留標準牛奶的各項原始濃度，該試驗對合格牛奶樣品和摻假牛奶樣品均未做稀釋處理。分別使用分析天平稱量氯化銨粉末于樣品瓶中，然后加入100 mL牛奶，超聲振蕩2 min待用。

同時使用15%三氯乙酸對摻假牛奶進行前處理，5 mL摻假牛奶加入15 mL 15%三氯乙酸溶液。超聲振蕩2 min，然后10 000 r/min 4 ℃條件下離心10 min，取上清液作為待測液。

1.3 近紅外光譜的采集

1.3.1 漫反射模塊近紅外光譜采集。

樣品在測試環(huán)境穩(wěn)定30 min，儀器開機后提前預熱30 min，利用SabIR漫反射光纖采集近紅外光譜，設置掃描范圍10 000～4 000 cm-1，Attenuator選擇Empty，Gain選擇1×，采樣間隔8 cm-1，采樣次數(shù)32次，采用扣除內(nèi)置參考背景。

1.3.2 透射模塊近紅外光譜采集。

樣品在測試環(huán)境穩(wěn)定30 min，儀器開機后提前預熱30 min，利用Antaris透射分析模采集近紅外光譜，樣品管厚度為1 mm，設置掃描范圍10 000～4 000 cm-1，Actuator選擇C，Gain選擇1×，采樣間隔16 cm-1，采樣次數(shù)32次，使用空白牛奶作為背景，每次采集牛奶樣品光譜后采集背景樣品作為背景，消除試驗中儀器飄逸的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 近紅外光譜圖譜

使用Nicolet 6700傅立葉變換近紅外光譜分析儀漫反射光纖分析模塊采集的60條氯化銨摻假牛奶圖譜如圖1所示，使用Nicolet 6700傅立葉變換近紅外光譜分析儀透射分析模塊采集的60條氯化銨摻假牛奶圖譜如圖2所示。

2.2 校正集和驗證集的選擇

應用TQ Analyst 8.0.0.245軟件，由計算機從60份樣品中挑選出50份具有代表性的樣品作為校正集，其余10份樣品作為驗證集，用于建立氯化銨含量定量分析模型，結(jié)果如表2所示。驗證集中氯化銨含量在校正集含量范圍之內(nèi)，此校正集和驗證集可用于氯化銨定量分析模型的建模和檢驗。

2.3 不同建模方法的比較

該試驗使用經(jīng)典最小二乘法（Classical Least Squares，CLS）、逐步多元線性回歸（Step-wise Multi Linear Rgression，SMLR）、主成分回歸（Principal Component Regression，PCR）和偏最小二乘回歸（Partial Least Squares，PLS）分別建立漫反射采集氯化銨含量定量分析模型和透射采集氯化銨含量定量分析模型，以均方根校正標準差（RMSEC）、均方根預測標準差（RMSEP）、相關系數(shù)（R2）為指標篩選建模方法，結(jié)果顯示，漫反射采集氯化銨含量定量分析模型PLS法模型參數(shù)較優(yōu)，數(shù)據(jù)見表3；透射采集氯化銨含量定量分析模型PLS法模型參數(shù)較優(yōu)，數(shù)據(jù)見表4。

2.4 光譜預處理

無論透射還是漫反射采集到的近紅外光譜，均很難從中鑒別出來某種化學成分的相關光譜。為了改善光譜特征和補償基線偏移，不同預處理的光譜預處理樣品物理性質(zhì)的差異會引起光譜基線和斜率等的變化，因此在建立近紅外模型之前，常運用化學計量學軟件對樣品原始光譜進行預處理[12]。該試驗通過一階導數(shù)（Frist derivative）、二階導數(shù)（Second derivative）、SG平滑（Savitzky-golay filter）、Norris平滑（Norris derivative filter）對漫反射采集氯化銨含量定量分析模型和透射采集氯化銨含量定量分析模型的近紅外光譜圖進行預處理，以RMSEC、RMSEP及R2為綜合指標，考察不同預處理方法對其模型的影響。最終確定漫反射采集氯化銨含量定量分析模型的近紅外光譜預處理方法為無處理，數(shù)據(jù)見表5；透射采集氯化銨含量定量分析模型的近紅外光譜預處理方法為一階導數(shù)+Norris平滑，數(shù)據(jù)見表6。

2.5 建模波段數(shù)影響

在建立模型時需要選擇建模波段以調(diào)整模型的準確性。表7和表8分別顯示了不同光譜范圍對漫反射采集氯化銨含量定量分析模型和對透射采集氯化銨含量定量分析模型的影響。由表7和8可知，漫反射采集氯化銨含量定量分析模型的最佳建模波段為10 000～5 750 cm-1，透射采集氯化銨含量定量分析模型的最佳建模波段為8 600～5 700 cm-1。

2.6 模型主成分數(shù)的選擇

在建立近紅外模型時，主成分數(shù)對模型實際預測能力有很大的影響，若主成分數(shù)選擇過少，就不能充分反映被測組分所產(chǎn)生的光譜信息，從而導致模型預測準確度下降；若主成分數(shù)選擇過多，會導致過擬合現(xiàn)象，從而導致模型預測能力下降。該研究以交叉驗證均方根（root mean square error of cross validation，RMSECV）為指標，選取最佳的建模成分數(shù)。最終，確定用于漫反射采集氯化銨含量定量分析建模選擇主成分數(shù)是10，用于透射采集氯化銨含量定量分析建模選擇主成分數(shù)是9（圖3）。

2.7 異常點剔除

剔除模型中的異常值也是優(yōu)化數(shù)學模型的一項技術。該研究采用傳統(tǒng)的馬氏距離法（Mahalanobis Distance Method），比較剔除異常點前后模型參數(shù)，最終漫反射采集氯化銨含量定量分析模型剔除3個異常點，剔除后模

型RMSEC、R2、RMSEP分別為0.076 1、0.991 4、0.587 0；透射采集氯化銨含量定量分析模型剔除4個異常點，剔除后模型RMSEC、R2、RMSEP分別為0.032 4、0.998 4、0.049 8。

2.8 定量模型的建立

通過Ominic 8.2.0.387和OriginPro 9.0軟件對近紅外光譜圖進行處理，TQ Analyst 8.0.0.245軟件進行模型建立及IBM SPSS Statistics 20.0.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，最終采用PLS建立了漫反射采集氯化銨含量定量分析模型，該模型采用無處理，10 000 ～5 750 cm-1光譜范圍，主成分數(shù)為9，剔除3個異常點，具體模型如圖4所示。以預測值與參考值的比值為預測回收率，漫反射氯化銨含量定量分析模型平均回收率為135.940 3%。

采用PLS建立了透射氯化銨含量定量分析模型，該模型采用一階導數(shù)+Norris平滑，8 600～5 700 cm-1光譜范圍，主成分數(shù)為10，剔除4個異常點，具體模型見圖5。以預測值與參考值的比值為預測回收率，透射氯化銨含量定量分析模型平均回收率為107.607 4%。

3 結(jié)論

無處理的氯化銨摻假牛奶經(jīng)過漫反射光纖模塊掃描，近紅外光譜不經(jīng)過處理，在10 000～5 750 cm-1光譜范圍建模，選擇主成分數(shù)為9，使用PLS建立模型。最終RMSEC、R2、RMSEP分別為0.076 1、0.991 4、0.587 0。漫反射氯化銨含量定量分析模型平均回收率為135.940 3%。

經(jīng)過三氯乙酸前處理的摻假牛奶經(jīng)過透射模塊掃描，近紅外光譜通過一階導數(shù)+Norris平滑，在8 600～5 700 cm-1光譜范圍建模，選擇主成分數(shù)為10，使用PLS建立模型。最終RMSEC、R2、RMSEP分別為0.032 4、0.998 4、0.049 8。透射氯化銨含量定量分析模型平均回收率為107.607 4%。

漫反射氯化銨含量定量分析模型和透射氯化銨含量定量分析模型都可以對牛奶中氯化銨含量進行定量分析；經(jīng)過三氯乙酸前處理后，通過透射采集建立的透射氯化銨含量定量分析模型更加可靠準確，可以用于牛奶中氯化銨摻假檢測，為進一步研究牛奶中其他摻假檢測奠定基礎。

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