1—甲基乙內(nèi)酰脲與氟尿嘧啶聯(lián)合對人結(jié)腸癌SW480細胞增殖和凋亡作用的研究

許云吉　梁慶模

[摘要] 目的 探討1-甲基乙內(nèi)酰脲（1-methylhydantoin）單用以及與氟尿嘧啶（5-Fu）聯(lián)合對結(jié)腸癌SW480細胞增殖抑制作用和誘導凋亡。 方法 使用MTT比色法檢測1-甲基乙內(nèi)酰脲M（a-h）在不同濃度（0.5、5、10、20、50、100、200、500 mg/L）單用及與不同濃度5-Fu（a-d）（10、20、50、100 mg/L）聯(lián)合作用于人結(jié)腸癌SW480細胞的吸光度值，然后再計算抑制率（IR）。流式細胞儀監(jiān)測Md、Me、Fub、Md+Fub、Me+Fub處理SW480細胞48 h對細胞周期分布和凋亡影響。 結(jié)果 1-甲基乙內(nèi)酰脲在體外對人結(jié)腸癌SW480細胞有增殖抑制作用。在低濃度時，1-甲基乙內(nèi)酰脲對人結(jié)腸癌SW480細胞增殖抑制效果與5-Fu相當（P>0.05）；在高濃度時，1-甲基乙內(nèi)酰脲對人結(jié)腸癌SW480細胞抑制增殖效果弱于5-Fu（P<0.05）。1-甲基乙內(nèi)酰脲與氟尿嘧啶聯(lián)合應用有協(xié)同抗腫瘤效果。 結(jié)論 1-甲基乙內(nèi)酰脲能夠抑制人結(jié)腸癌細胞SW480的增殖和誘導凋亡作用，并與氟尿嘧啶有協(xié)同抗瘤細胞增殖效果。

[關(guān)鍵詞] 1-甲基乙內(nèi)酰脲；結(jié)腸癌；MTT比色法；氟尿嘧啶；增殖抑制；誘導凋亡

[中圖分類號] R735.35 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）19-0036-04

[Abstract] Objective To investigate the proliferation inhibitory effect and inducingapoptosis of 1-methylhydantoin alone and combined application with 5-fluorouracil（5-Fu） on human colon cancer SW480 cells. Methods MTT colorimetric assay was used to detect the absorbance value of colon cancer SW480 cells after the application of different concentrations of 1-methylhydantoin（0.5， 5， 10， 20， 50， 100， 200， 500 mg/L） alone and combined application with 5-Fu（10， 20， 50， 100 mg/L）， and then the inhibitory rate was calculated.Flow cytometry was used to monitor the cell cycle distribution and apoptosis of SW480 cells treated with Md， Me， Fub， Md+Fub and Me+Fub for 48 h. Results 1-methylhydantoin had an inhibitory effect on the proliferation of human colon cancer SW480 cells in vitro. At low concentration， the inhibitory effect of 1-methylhydantoin on the proliferation of human colon cancer SW480 cells was similar to that of 5-Fu（P>0.05）； at high concentration， the inhibitory effect of 1-methylhydantoin on the proliferation of human colon cancer SW480 cells was weaker than that of 5-Fu（P<0.05）. Combined application of 1-methylhydantoin and 5-Fu had a synergistic anti-tumor effect. Conclusion 1-methylhydantoin can inhibit the proliferation and inducingapoptosis of human colon cancer cell SW480 and has a synergistic effect with 5-Fu.

[Key words] 1-methylhydantoin； Colon cancer； MTT colorimetric assay； Fluorouracil； Proliferation inhibition； Inducingapoptosis

惡性腫瘤嚴重威脅人類的生存健康，結(jié)腸癌就是其中之一，是僅次于乳腺癌、肺癌的惡性腫瘤。隨著經(jīng)濟逐步發(fā)展，生活及精神壓力不斷增加，生活節(jié)奏日益加快，生活習慣改變，人口老齡化逐步加劇，飲食及膳食結(jié)構(gòu)的變化，我國結(jié)腸癌患者的死亡率及患病率逐年遞增。在臨床治療中，積極開發(fā)新的抗惡性腫瘤治療藥物及治療手段意義深遠。獨角蓮為我國獨有的一味中草藥，它具有抗驚厥、抗炎、抗破傷風毒素、調(diào)節(jié)免疫、抑制酪氨酸酶、殺菌、祛痰、增強免疫力等藥理作用，近年來在抗腫瘤藥物的研究中發(fā)現(xiàn)，獨角蓮及其提取物對乳腺癌、胃癌、原發(fā)性肝癌、肺癌等多種癌細胞具有增殖抑制效果[1-3]。1-甲基乙內(nèi)酰脲是從獨角蓮中提取得到的[4]，研究證實，它具有良好的抗炎效果，是治療免疫性疾病、炎癥的有效活性成分，另外，1-甲基乙內(nèi)酰脲還能抑制活化的淋巴細胞破壞內(nèi)皮細胞、消除羥基自由基活性[5-6]。然而，1-甲基乙內(nèi)酰脲抑制惡性細胞增殖和誘導凋亡作用的相關(guān)報道較少。本文旨在探討1-甲基乙內(nèi)酰脲對體外培養(yǎng)的SW480細胞增殖是否有抑制作用，以及對SW480細胞凋亡是否有誘導作用，同時與氟尿嘧啶的增殖抑制作用強弱相比較，以期為臨床開發(fā)新的藥物來治療結(jié)腸癌。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌SW480細胞（中南大學湘雅醫(yī)學院）；二甲基亞砜（DMSO）、RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT粉、胰蛋白酶粉均購買于美國Sigma公司；1-甲基乙內(nèi)酰脲（分子式C4H6N2O2，純度>99.0%，分子量114.10）、5-氟尿嘧啶（上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號：H31020593）；新生小牛血清（杭州四季清公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) SW480細胞用RPMI-1640培養(yǎng)基（含有10%的新生小牛血清）培養(yǎng)在5% CO2、37.0℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，細胞單層附壁生長，每2～3天傳代一次，取對數(shù)期生長細胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組 根據(jù)預實驗及文獻資料[1-7]將實驗分四組：1-甲基乙內(nèi)酰脲組M（a-h）、Fu（a-d）組、對照組、1-甲基乙內(nèi)酰脲和氟尿嘧啶聯(lián)合組。對照組：加入培養(yǎng)基、SW480細胞、用生理鹽水處理；乙內(nèi)酰脲組（干預人結(jié)腸癌SW480細胞24 h、48 h、72 h）：濃度M（a-h）分別為0.5、5、10、20、50、100、200、500 mg/L；氟尿嘧啶組（干預48 h）：濃度Fu（a-d）分別為10、20、50、100 mg/L；聯(lián)合組（干預48 h）：濃度分別為Fua+Mc、Fub+Md、Fuc+Me、Fud+Mf。MTT比色法測定各實驗組對結(jié)腸癌SW480細胞株的抑制增殖效果，同時與單獨使用氟尿嘧啶作用效果進行比較。Md、Me、Fub、Md+Fub、Me+Fub組干預人結(jié)腸癌SW480細胞48 h，流式細胞儀檢測細胞周期分布及凋亡率。

1.2.3 MTT比色法測定SW480細胞抑制率 取對數(shù)期生長良好的SW480細胞用于實驗；用0.25%胰蛋白酶消化液消化后制成單個細胞懸液，以每孔細胞5200個接種細胞于96孔培養(yǎng)板中，實驗各組設置6個平行孔，培養(yǎng)至方案既定時間，用移液槍往培養(yǎng)板每孔中加20 μL 5 mg/L的噻唑氮藍液，再培養(yǎng)4 h后終止細胞培養(yǎng)，將96孔培養(yǎng)板每孔內(nèi)上清培養(yǎng)液用移液槍小心移除，用移液槍往每孔加150 μL二甲基亞砜，然后放在搖晃床上振蕩10 min，使充分溶解，用酶標儀測定波長在570 nm下吸光度值（0D值）。細胞增殖抑制率=（1-實驗組平均吸光度值/對照組平均吸光度值）×100%。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期分布及細胞凋亡率 按照《現(xiàn)代分子生物學實驗技術(shù)》書中所述流式細胞技術(shù)方法稍加改動。將試驗用細胞分別加入35 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶20 mL細胞混懸液，按照實驗制定計劃加藥處理48 h，對照組加入等量PBS，在北京康為世紀生物科技有限公司上機檢測分析：所得數(shù)據(jù)采用Mod Fit LT for Mac V3.0軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差表示，One Way ANOVA方式分析各組實驗數(shù)方差，多組間均數(shù)采用SNK法進行比較，組間比較采用Students t檢驗，兩組計量資料比較采用LSD法，以上步驟重復實驗3次，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 1-甲基乙內(nèi)酰脲對SW480細胞增殖抑制率的影響

見表1。1-甲基乙內(nèi)酰脲在濃度5～500 mg/L濃度范圍對體外培養(yǎng)的SW480 細胞株具有抑制增殖作用，兩組比較差異顯著（P<0.05）。1-甲基乙內(nèi)酰脲在5～500 mg/L濃度范圍內(nèi)對結(jié)腸癌細胞增殖抑制率有濃度依賴性，1-甲基乙內(nèi)酰脲對結(jié)腸癌SW480細胞增殖抑制率在5～500 mg/L范圍內(nèi)遞增。1-甲基乙內(nèi)酰脲作用48 h后抑制SW480細胞增殖作用最顯著。

2.2 氟尿嘧啶、1-甲基乙內(nèi)酰脲分別對SW480細胞株增殖抑制率的影響

見表2。濃度為10、20 mg/L的1-甲基乙內(nèi)酰脲對結(jié)腸癌細胞的增殖抑制作用與等濃度氟尿嘧啶抑制效果相比，兩者對結(jié)腸癌SW480細胞的增殖抑制效果相當，無顯著性差異（P>0.05）。濃度為50、100 mg/L的1-甲基乙內(nèi)酰脲對人結(jié)腸癌SW480細胞株的抑制作用與濃度為50、100 mg/L的氟尿嘧啶抑制作用相比，氟尿嘧啶對結(jié)腸癌SW480細胞增殖抑制作用大于1-甲基乙內(nèi)酰脲，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 氟尿嘧啶和1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用48 h對SW480細胞增殖抑制影響

見表3。與對照組對比，濃度在10～50 mg/L范圍內(nèi)氟尿嘧啶和1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)合應用對SW480細胞增殖抑制率有濃度遞增趨勢，隨濃度增高聯(lián)合用藥對腫瘤細胞增殖抑制效果越明顯，組間兩兩對比具有顯著性差異（P<0.05）。濃度在100 mg/L時氟尿嘧啶和1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用對結(jié)腸癌SW480細胞增殖抑制作用，與濃度為50 mg/L的氟尿嘧啶和1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用對結(jié)腸癌SW480細胞增殖抑制作用相比效果相當，無顯著性差異（P>0.05）。

2.4 氟尿嘧啶+1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用與氟尿嘧啶單用對結(jié)腸癌SW480細胞增殖的抑制作用

見表4。氟尿嘧啶與1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用對SW480細胞增殖抑制作用強于相同濃度氟尿嘧啶單用，具有顯著性差異（P<0.05）。氟尿嘧啶10 mg/L與1-甲基乙內(nèi)酰脲10 mg/L聯(lián)用組對結(jié)腸癌SW480細胞增殖抑制作用與氟尿嘧啶20 mg/L單用效果相當，差異無顯著性 （P>0.05）。5-Fu 50 mg/L與1-甲基乙內(nèi)酰脲50 mg/L聯(lián)用對結(jié)腸癌SW480細胞增殖的抑制效果強于氟尿嘧啶100 mg/L單獨作用，具有顯著性差異（P<0.05）。

2.5 1-甲基乙內(nèi)酰脲、氟尿嘧啶對SW480細胞周期分布及細胞凋亡影響

隨著濃度增高1-甲基乙內(nèi)酰脲單用及與氟尿嘧啶聯(lián)用使SW480細胞凋亡率逐漸上升，S期在細胞周期分布中所占百分比增大，兩組間比較有顯著性差異（P<0.05）。聯(lián)合組干預SW480細胞凋亡率所占百分比較單獨用藥組高，聯(lián)合組S期在細胞周期分布中所占百分比要比單獨用藥組高，兩組間比較有顯著性差異（P<0.05）。見表5。

3 討論

獨角蓮中提取物種類眾多，1-甲基乙內(nèi)酰脲就是其中一種。研究證實，1-甲基乙內(nèi)酰脲具有廣闊的臨床應用價值，風濕免疫性疾病、缺血再灌注、肺纖維化等多種疾病[8-9]治療常用到1-甲基乙內(nèi)酰脲，然而1-甲基乙內(nèi)酰脲是否能抑制惡性腫瘤增殖以及是否能誘導惡性腫瘤細胞凋亡？迄今為止相關(guān)報道及研究較少。因此我們課題組推測在結(jié)腸癌抗癌治療過程中使用1-甲基乙內(nèi)酰脲有效果。

本文在體外采用MTT 比色法檢測1-甲基乙內(nèi)酰脲對體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細胞增殖抑制作用。結(jié)果顯示，1-甲基乙內(nèi)酰脲對體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細胞具有增殖抑制及誘導凋亡作用，且結(jié)腸癌細胞的抑制率呈劑量依賴趨勢，結(jié)果與獨角蓮及其提取物抑制腫瘤細胞增殖的報道[2]相符合。但其對腫瘤細胞增殖抑制作用機制與腫瘤細胞的抑制效率、藥物劑量、實驗條件、實驗對象等很多因素有關(guān)系，仍然需進一步研究探討。

抗腫瘤藥物作用的強弱常以傳統(tǒng)藥物氟尿嘧啶作為對照。1-甲基乙內(nèi)酰脲對結(jié)腸癌SW480細胞的增殖有抑制作用以及1-甲基乙內(nèi)酰脲可以誘導細胞凋亡已通過本實驗研究證實。但和傳統(tǒng)化療藥物相比，1-甲基乙內(nèi)酰脲抗腫瘤作用效果如何？本研究選取同等劑量氟尿嘧啶作為參照，結(jié)果表明，1-甲基乙內(nèi)酰脲在低濃度時對體外培養(yǎng)的SW480細胞抑制作用與氟尿嘧啶大致相等。1-甲基乙內(nèi)酰脲在高濃度時對體外培養(yǎng)的SW480細胞抑制作用弱于氟尿嘧啶。本實驗研究所得結(jié)果與獨角蓮醇提物在低濃度時抗惡性腫瘤增殖作用與氟尿嘧啶相比無顯著性差異、獨角蓮醇提物在高濃度時抗惡性腫瘤增殖作用要弱于氟尿嘧啶的報道相符合[10-11]。所以1-甲基乙內(nèi)酰脲具有非常好的抗惡性腫瘤價值，有必要進一步探討研究。

抗癌藥物單獨使用容易使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，且用藥過程中具有較大的細胞毒副作用，為了增強抗腫瘤藥物的效果，降低化療藥物的毒副作用以及避免腫瘤產(chǎn)生耐藥性，臨床上常使用多種藥物聯(lián)合抗癌治療。氟尿嘧啶是臨床上常用的抗癌藥，在抗癌治療過程中氟尿嘧啶常與其他抗癌藥物聯(lián)合應用，不但可以降低惡性腫瘤產(chǎn)生耐藥性，還能增強抗癌藥物的臨床效果。1-甲基乙內(nèi)酰脲具有良好的抗惡性腫瘤作用已被本試驗研究證實，同時將氟尿嘧啶和1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用的抗腫瘤作用與氟尿嘧啶單用進行比較。研究結(jié)果表明，氟尿嘧啶和1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用抑制惡性腫瘤增殖作用要強于氟尿嘧啶單獨使用。值得一提的是，氟尿嘧啶和1-甲基乙內(nèi)酰脲聯(lián)用抑制SW480細胞的增殖作用強于等濃度氟尿嘧啶單用，說明二者聯(lián)合使用具有協(xié)同抗結(jié)腸癌細胞增殖和誘導凋亡作用?？拱┧幬锫?lián)合使用可以降低藥物毒副作用，此結(jié)果與獨角蓮及其提取物抑制惡性腫瘤細胞增殖的研究報道相符[12-15]。因此需要進一步研究1-甲基乙內(nèi)酰脲與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應用的臨床價值。

本研究為1-甲基乙內(nèi)酰脲單用及與傳統(tǒng)抗癌藥物聯(lián)合應用抗腫瘤治療提供了理論支持。但是1-甲基乙內(nèi)酰脲抗惡性腫瘤細胞增殖作用研究目前還處于體外研究階段，有必要開展移植瘤動物模型研究，為1-甲基乙內(nèi)酰脲進入臨床抗癌治療奠定基礎。

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（收稿日期：2017-05-02）