定性、定量方法測(cè)定養(yǎng)血注射液溶血性試驗(yàn)

侯超

（鄭州市中醫(yī)院制劑室，河南 鄭州 450000）

定性、定量方法測(cè)定養(yǎng)血注射液溶血性試驗(yàn)

侯超

（鄭州市中醫(yī)院制劑室，河南 鄭州 450000）

目的：觀察養(yǎng)血注射液溶血作用。方法：肉眼觀察法定性觀察養(yǎng)血注射液的溶血性；同時(shí)采用分光光度法、體外紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法定量計(jì)算養(yǎng)血注射液的溶血率。結(jié)果：肉眼觀察法中，養(yǎng)血注射液溶血作用較弱；分光光度法中，養(yǎng)血注射液溶血率低于3.5%；體外紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法中，養(yǎng)血注射液溶血率低于5%。結(jié)論：養(yǎng)血注射液溶血作用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

養(yǎng)血注射液；溶血試驗(yàn)；肉眼觀察法；分光光度法；體外紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法

養(yǎng)血注射液是以四物湯中有效成分為原料藥，配伍甘油等附加劑制備而成的化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、療效確切的注射液，具有補(bǔ)血、養(yǎng)血、活血的功效，為了考察注射液的安全性，本試驗(yàn)開展了溶血性試驗(yàn)，為新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器、試藥與試驗(yàn)動(dòng)物

1.1 儀器

UV-4802型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼克儀器有限公司）；POCH-100 ivd型全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀（希森美康醫(yī)用電子有限公司）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；水浴鍋（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；抗凝管（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；錐形瓶；移液槍；離心管；試管；鑷子。

1.2 試藥

0.9 %氯化鈉溶液（福州海王福藥制藥有限公司）；養(yǎng)血注射液由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥劑科研實(shí)驗(yàn)室自制，蒸餾水由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院自制。

1.3 動(dòng)物

昆明小鼠，清潔級(jí)，合格證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房提供，雌雄各半，18～22 g。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 肉眼觀察法定性觀察

2.1.1 2%紅細(xì)胞懸浮液的配制 采用抗凝管取健康小鼠血液3 mL，混勻，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管內(nèi)，加1倍量0.9%氯化鈉溶液，搖勻，1000～1500 r/min離心15 min，除去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再加入0.9%氯化鈉溶液約5倍量，搖勻，1000～1500 r/min離心15 min，除去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再加入0.9%氯化鈉溶液5倍量按上述方法洗滌2～3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細(xì)胞用0.9%氯化鈉溶液制成2%（V/V）的混懸液，供試驗(yàn)用。

2.1.2 定性觀察[1-3]取潔凈試管7只，進(jìn)行編號(hào)，1～5號(hào)管為供試品管，6號(hào)管為陰性對(duì)照管，7號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照管。按下表所示依次加入2%紅細(xì)胞懸液，0.9%氯化鈉溶液或蒸餾水，混勻后，立即置（37±0.5）℃的水浴鍋中進(jìn)行溫育，并于第15 min，30 min，45 min，1 h，2 h及3 h觀察溶血與凝聚反應(yīng)。按表1中順序加入各種溶液。

表1 試驗(yàn)安排 （mL）

2.1.3 結(jié)果判定 溫育的過(guò)程中，若試管中的溶液呈澄明紅色，管底無(wú)細(xì)胞殘留或有少量紅細(xì)胞殘留，表明有溶血發(fā)生；如試管下部為紅色紅細(xì)胞懸浮液，上部液體無(wú)色澄明，表明無(wú)溶血發(fā)生。

若供試品管紅細(xì)胞沉降較對(duì)照管明顯快，表明有紅細(xì)胞凝聚發(fā)生。如有紅細(xì)胞凝聚的現(xiàn)象，可按下法進(jìn)一步判定是真凝聚還是假凝聚。若凝聚物在試管振蕩后又能均勻分散，或?qū)⒛畚锓旁谳d玻片上，在蓋玻片邊緣滴加2滴0.9%氯化鈉溶液，置顯微鏡下觀察，凝聚紅細(xì)胞能被沖散者為假凝聚，若凝聚物不被搖散或在玻片上不被沖散者為真凝聚。

2.1.4 試驗(yàn)結(jié)果 按照“2.1.1”～“2.1.3”中的試驗(yàn)方法，重復(fù)做3批，溫育3 h后定性觀察。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 3批注射液溶血試驗(yàn)肉眼觀察

15 min時(shí)，3批樣品1～6號(hào)試管均在液面約0.2 cm處出現(xiàn)分層，下部為紅細(xì)胞懸浮液，上部為澄明溶液，顏色微紅；7號(hào)試管為澄明紅色，不分層。

30 min時(shí)，3批樣品1～6號(hào)試管均在液面約0.3 cm處出現(xiàn)分層，下部為紅細(xì)胞懸浮液，上部為澄明溶液，顏色微紅；7號(hào)試管為澄明紅色，不分層。

45 min時(shí)，3批樣品1～6號(hào)試管均在液面約0.5 cm處出現(xiàn)分層，下部為紅細(xì)胞懸浮液，上部為澄明溶液，顏色微紅；7號(hào)試管為澄明紅色，不分層。

1 h時(shí)，3批樣品1～6號(hào)試管均在液面約0.6 cm處出現(xiàn)分層，下部為紅細(xì)胞懸浮液，上部為澄明溶液，顏色微紅；7號(hào)試管為澄明紅色，不分層。

2 h時(shí)，3批樣品1～6號(hào)試管均在液面約1.2 cm處出現(xiàn)分層，下部為紅細(xì)胞懸浮液，上部為澄明溶液，顏色微紅；7號(hào)試管為澄明紅色，不分層。

3 h時(shí)，3批樣品1～6號(hào)試管均在液面約2 cm處出現(xiàn)分層，下部為紅細(xì)胞懸浮液，上部為澄明溶液，顏色微紅；7號(hào)試管為澄明紅色，不分層。

2.2 分光光度法定量計(jì)算

2.2.1 定量計(jì)算 按表1將溫育了3 h后的各管溶液離心，取上清液，在分光光度計(jì)545 nm處，以蒸餾水為空白讀取各管的吸光度值（OD）值。

2.2.2 結(jié)果判定 根據(jù)紅細(xì)胞破裂釋放出來(lái)的血紅素在可見(jiàn)光波長(zhǎng)段具有最大吸收的原理，采用分光光度法測(cè)定中藥注射劑的溶血程度，可用下列公式計(jì)算各試驗(yàn)管的溶血率。

溶血率（%）＝（ODt－ODnc）/（ODpc－ODnc）×100%

式中，ODt：試驗(yàn)管吸光度；ODnc：陰性對(duì)照管吸光度；ODpc：陽(yáng)性對(duì)照管吸光度。

2.2.3 試驗(yàn)結(jié)果 按照“2.1.1”～“2.1.3”以及“2.2.1”～“2.2.2”中的試驗(yàn)方法，重復(fù)做3批，溫育3 h后，定量計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2，表3。

表2 3批試驗(yàn)定量計(jì)算結(jié)果（吸光度）

表3 3批試驗(yàn)定量計(jì)算結(jié)果（溶血率）

注：溶血率（%）＝[(空白對(duì)照管紅細(xì)胞數(shù)-供試品管紅細(xì)胞數(shù))/空白對(duì)照管紅細(xì)胞數(shù)]×100%

2.3 體外紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法定量計(jì)算

2.3.1 小鼠10只，摘眼球取血，將所采血液置抗凝管中，混勻，共5 mL，待用。

2.3.2 取5 mL試管6只，編號(hào)，1～4號(hào)管為供試品管，5號(hào)管為空白對(duì)照管，6號(hào)管為陰性對(duì)照管。見(jiàn)表4。

表4 試驗(yàn)安排 （mL）

按表4依次加入血液、養(yǎng)血注射液、生理鹽水，混勻，分別于第15 min，30 min，1 h，2 h，4 h及8 h后進(jìn)行血常規(guī)檢查，得紅細(xì)胞（RBC）數(shù)值，并計(jì)算溶血率。

2.3.3 按照“2.3.1”和“2.3.2”中的試驗(yàn)方法，重復(fù)做3批，結(jié)果見(jiàn)表5和表7。

表5 體外紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法第1批試驗(yàn)數(shù)據(jù)

表6 體外紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法第2批試驗(yàn)數(shù)據(jù)

表7 體外紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法第3批試驗(yàn)數(shù)據(jù)

3 討論

3.1 肉眼觀察法

3批樣品中，7號(hào)試管均一直為澄明紅色，不分層，表明發(fā)生溶血。1～6號(hào)試管中紅細(xì)胞隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸沉淀下部，上部液體澄清，并且1～5號(hào)供試品管上部澄明液體顏色與6號(hào)陰性對(duì)照管上部澄明液體顏色一致，表明養(yǎng)血注射液的溶血作用較弱。

3.2 分光光度法

3批樣品中，采用分光光度法測(cè)定養(yǎng)血注射液的溶血程度，進(jìn)行定量計(jì)算。結(jié)果1～5號(hào)供試品管的溶血率均低于3.5%，表明養(yǎng)血注射液的溶血作用較弱。為了增加可靠性，該溶血試驗(yàn)連做3批，結(jié)果3批溶血率均低于3.5%，符合國(guó)家溶血不得＞5%規(guī)定的要求[4]，且穩(wěn)定性好，表明養(yǎng)血注射液溶血作用較弱，安全性較好。

3.3 體外紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法

通過(guò)測(cè)定6號(hào)陰性對(duì)照管中RBC的值為0，表明養(yǎng)血注射液對(duì)血液測(cè)定無(wú)干擾。3批樣品中，1～4號(hào)管的溶血率均符合國(guó)家溶血率不得＞5%規(guī)定的要求，且隨著時(shí)間的推移，溶血率并沒(méi)有升高，表明養(yǎng)血注射液溶血性較弱，安全性較好。

本試驗(yàn)在經(jīng)典肉眼觀察法定性觀察注射液溶血性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)分光光度法、體外紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法定量計(jì)算注射液的溶血率[5-7]，使得試驗(yàn)方法更科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)更有說(shuō)服力。

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本文編輯：魯守琴

Qualitative and Quantitative Tests for Hemolysis of Yangxue Injection

Hou Chao
(Manufacturing Laboratory, Zhengzhou Hospitol of Traditional Chinese Medicine, Henan Zhengzhou 450000, China)

Objective：To observe Hemolytic effect of Yangxue Injection.Methods：The hemolysis of yangxue Injection was observed visually, while the hemolysis rate was determined by spectrophotometry and red blood cell count in vitro.Results：Weak hemolysis was observed visually. However, the hemolysis rate was less than 3.5% by spectrophotometry, and less than 5% by red blood cell count in vitro.Conclusion：Hemolytic effect of yangxue injection is in line with national standards.

Yangxue Injection; Hemolysis Test; Visual Observation; Spectrophotometry; Red Blood Cell Count in Vitro

R927

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.05.015

2017 - 04 - 04

侯超，男，碩士，中藥師。研究方向：中藥制劑與質(zhì)量控制。E-mail：18838195935@163.com