姜黃素對(duì)秀麗隱桿線蟲降脂及抗氧化保護(hù)作用

李 萍,米生權(quán),馮亞芳,趙 卓(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院,北京 100191)

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姜黃素對(duì)秀麗隱桿線蟲降脂及抗氧化保護(hù)作用

李 萍,米生權(quán)*,馮亞芳,趙 卓
(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院,北京 100191)

本文研究姜黃素對(duì)秀麗隱桿線蟲的降脂及抗氧化作用。將L1期秀麗隱桿線蟲暴露于不同濃度姜黃素(12.5、25、50和100 μmol/L)48 h后,以油紅O染色線蟲腸道脂肪,檢測線蟲體內(nèi)甘油三酯的含量變化,同時(shí)測定線蟲體內(nèi)總超氧化物歧化酶活力(T-SOD)和丙二醛(MDA)含量的變化。結(jié)果表明,與二甲基亞砜(DMSO)對(duì)照組相比,姜黃素濃度在25 μmol/L以上顯著降低線蟲腸道脂肪(p<0.05),姜黃素濃度在50 μmol/L以上降低線蟲腸道脂肪作用極顯著(p<0.01),隨著姜黃素濃度升高,線蟲腸道脂肪含量逐漸降低。姜黃素濃度在25 μmol/L以上極顯著降低線蟲體內(nèi)甘油三酯和MDA含量(p<0.01)。黃素濃度在50 μmol/L以上極顯著提高線蟲體內(nèi)T-SOD酶活力(p<0.01)。綜上所述,姜黃素濃度在25 μmol/L以上對(duì)線蟲具有降脂及抗氧化保護(hù)作用。

姜黃素,秀麗隱桿線蟲,脂肪沉積,甘油三酯,抗氧化

肥胖癥是由于外界環(huán)境因素或人體內(nèi)因素導(dǎo)致的一種常見疾病,會(huì)誘發(fā)多種慢性疾病,如代謝綜合征、冠心病、高血壓等[1]。肥胖癥損害患者身體健康,使生活質(zhì)量下降、預(yù)期壽命縮短,成為重要的世界性健康問題之一[2]。1997年世界衛(wèi)生組織(WHO)將肥胖定義為一種疾病[3]。隨著肥胖問題的日益嚴(yán)重,迫切需求顯效快、療效明顯、副作用少的減肥方式。目前肥胖治療方法主要包括改變生活方式、藥物治療和手術(shù)治療[4]。其中減肥藥如西布曲明通過作用于下丘腦腹外側(cè)核飽食中樞,減少食物攝取;奧利司他抑制胃和小腸中脂肪酶的活性,減少食物中脂類物質(zhì)的消化和吸收,短期療效顯著但伴隨有頭暈、惡心及輕度胃腸功能障礙等不良反應(yīng)[5]。

減肥降脂相關(guān)功能食品的研發(fā)是未來的發(fā)展方向之一,姜黃素是從姜科植物姜黃(CurcumaIongaL.)中提取出來的一種橙黃色酚類物質(zhì),是中藥姜黃的主要活性成分,其分子式是C21H20O6,分子量為368.37,可溶于有機(jī)溶劑,在水中溶解度低[6]。姜黃素毒性低、不良反應(yīng)小、藥源廣、價(jià)廉、服用方便[7-8],且姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗微生物等廣泛的藥理作用,具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值及發(fā)展前景[9-10]。姜黃素降脂及抗氧化作用研究多應(yīng)用于大鼠、小鼠和雞等模式生物,本實(shí)驗(yàn)以秀麗隱桿線蟲為模式生物進(jìn)行姜黃素降脂及抗氧化作用研究。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)為低等的無脊椎動(dòng)物,其長度為1 mm,身體透明,以大腸桿菌OP50為食,其繁殖能力強(qiáng),野生型線蟲分為幼蟲期(L1、L2、L3、L4)和成蟲期[11]。因秀麗隱桿線蟲結(jié)構(gòu)簡單、繁殖量大、繁殖周期短、易于人工培養(yǎng)、方便觀察的特點(diǎn),且脂肪代謝通路研究明確,與人類脂肪代謝通路相似,各關(guān)鍵代謝步驟的酶相似度較高,所以將其作為重要的模式生物[12]。秀麗隱桿線蟲體內(nèi)不能合成膽固醇,脂質(zhì)主要以甘油三酯的形式存在,線蟲腸道是脂肪的主要儲(chǔ)存部位[13-14],應(yīng)用線蟲模型做的研究結(jié)果可以外推到肥胖癥人群[15]。

因此本文以秀麗隱桿線蟲為動(dòng)物模型,油紅O染色線蟲腸道脂肪,檢測線蟲體內(nèi)甘油三酯的含量變化,同時(shí)測定線蟲體內(nèi)總超氧化物歧化酶活力(T-SOD)和丙二醛(MDA)含量的變化,確定姜黃素對(duì)線蟲腸道脂肪、甘油三酯含量及抗氧化作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌OP50與秀麗隱桿線蟲N2野生型 中國科學(xué)院生物物理研究所;姜黃素(純度:98.9%) 中國食品藥品檢定研究院;油紅O(純度≥75.0%) Sigma-Aldrich公司;二甲基亞砜(DMSO純度:99.0%) 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;曲拉通X-100(Triton X-100) Sigma-Aldrich公司;甘油三酯試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)測試盒 南京建成生物工程研究所;BCA蛋白定量測定試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司等。

注射器式濾器 美國PALL公司;S6E連續(xù)變倍體視顯微鏡 德國Leica公司;TL2010S中通量組織研磨儀 北京鼎昊源科技有限公司;MJ-250F-II霉菌生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;UV-2000紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 姜黃素菌液和DMSO菌液涂布平板 參考何露[16]姜黃素類化合物提高線蟲的抗氧化應(yīng)激能力中姜黃素給藥濃度100 μmol/L,按倍數(shù)比例配制12.5、25、50和100 μmol/L的姜黃素菌液。取0.736 g姜黃素溶于10 mL DMSO中,用注射器式濾器過濾除菌后配制成姜黃素母液。分別取1 mL姜黃素母液,依次加入DMSO使溶液終體積分別為2、4、8和16 mL,配制成姜黃素工作液。無菌條件下,分別取0.01 mL姜黃素工作液于10 mL相同濃度的大腸桿菌OP50菌液(OD600=0.4)中,配制成12.5、25、50和100 μmol/L的姜黃素菌液。取0.01 mL DMSO于10 mL相同濃度的大腸桿菌OP50菌液中,配制成0.1%的DMSO菌液。取0.05 g VE溶解于10 mL DMSO中,從中量取0.2 mL相同濃度的大腸桿菌OP50菌液中,配制成100 mg/L的VE菌液(鋁箔遮光處理)。

取以上姜黃素菌液和DMSO菌液涂布線蟲生長培養(yǎng)基(NGM)平板,每個(gè)加藥濃度菌液分別各涂布1個(gè)NGM培養(yǎng)基平板,20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h待用(供線蟲腸道脂肪染色使用)。

取以上姜黃素菌液和DMSO菌液涂布NGM培養(yǎng)基平板,每個(gè)加藥濃度菌液分別各涂布4個(gè)NGM培養(yǎng)基平板,20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h待用(供甘油三酯測定使用)。

取以上姜黃素菌液、DMSO菌液和VE菌液涂布NGM培養(yǎng)基平板,每個(gè)加藥濃度菌液分別各涂布4個(gè)NGM培養(yǎng)基平板,20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h待用(供T-SOD酶活力和MDA含量測定使用)。

1.2.2 線蟲轉(zhuǎn)接培養(yǎng) 將同步化后培養(yǎng)14 h的L1期線蟲轉(zhuǎn)接到以上涂布平板,20 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,使線蟲長至L4末期,每個(gè)平板培養(yǎng)線蟲150～200條左右[15]。

1.2.3 線蟲腸道脂肪油紅O染色 油紅O染色劑:油紅O染色線蟲腸道脂肪,常規(guī)染色方法中油紅O難溶于水,酒精配制后容易造成線蟲體內(nèi)脂肪的溶解,且隨著酒精的揮發(fā),染料使用過程中極易形成結(jié)晶[17],染色效果差。通過β-環(huán)糊精包合油紅O,提高了油紅O的水溶性,同時(shí)避免因酒精萃取線蟲體內(nèi)脂肪而造成的脂肪含量降低。并且將油紅O工作液與Triton X-100溶液以5∶3的比例配制為油紅O染色劑[18],染色線蟲腸道脂肪,Triton X-100能夠增加線蟲細(xì)胞膜的通透性,從而在Triton X-100的輔助作用下,油紅O可以高效地進(jìn)入線蟲體內(nèi),有效地染色線蟲腸道脂肪,獲得良好的染色效果。

每個(gè)濃度組取1個(gè)培養(yǎng)至L4末期線蟲的平板,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗脫各濃度組平板中線蟲于離心管中,1500 r/min離心2 min后,去上清,重復(fù)洗脫3次后。加入1 mL甲醛固定液室溫固定15 min,-80 ℃冷凍15 min,43 ℃水浴1 min解凍[19]。PBS洗脫,加入500 μL油紅O染色劑,振蕩混勻,染色2 h,每隔10 min振蕩1次。PBS洗脫,制片,顯微鏡下觀察拍照,每個(gè)樣本拍照20條被染色線蟲。

1.2.4 線蟲甘油三酯含量檢測 每個(gè)濃度組取6個(gè)培養(yǎng)至L4末期線蟲的平板,其中每2個(gè)平板合并為1個(gè)平行,即分為3組平行。PBS洗脫各濃度組平板中線蟲于離心管中,1500 r/min離心2 min后,去上清。重復(fù)洗脫3次后,吸取各濃度組離心管中蟲體于對(duì)應(yīng)的10 mL研磨管中,加入PBS使各研磨管中液體總體積為300 μL,加入研磨珠適量,中通量組織研磨儀設(shè)置為1500 r/min,60 s運(yùn)行時(shí)間,10 s間歇時(shí)間,進(jìn)行3次研磨循環(huán),最后在倒置顯微鏡下取20 μL蟲液觀察線蟲是否都已經(jīng)破碎(研磨管和研磨珠提前在冰上預(yù)冷)。線蟲研磨充分后,將各濃度組研磨管置于4 ℃離心機(jī)中5000 r/min離心10 min,將離心后上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中[19],按照甘油三酯測定試劑盒說明書和BCA蛋白定量測定試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.2.5 線蟲T-SOD酶活力和MDA含量測定 每個(gè)濃度組取6個(gè)培養(yǎng)至L4末期線蟲的平板,其中每2個(gè)平板合并為1個(gè)平行,即分為3組平行。方法同1.2.4,取線蟲研磨上清液按照SOD試劑盒、MDA測試盒說明書和BCA蛋白定量測定試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 以Image-Pro Plus 6.0軟件分析被染色線蟲圖像并測量線蟲腸道脂肪紅光密度,用SPSS 20.0軟件中ANOVA分析方法比較不同組間線蟲腸道脂肪含量、甘油三酯含量、T-SOD酶活力及MDA含量,用OriginPro 9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 油紅O染色線蟲腸道脂肪處理

如圖1所示,油紅O將線蟲腸道脂肪染為紅色,顏色鮮艷并且容易觀察,染色效果良好,而未染色線蟲呈透明狀。

圖1 油紅O染色圖和未加染液圖(500×)Fig.1 Oil red O staining and without stain figure(500×)

如圖2所示,姜黃素處理線蟲48 h后,分析線蟲腸道脂肪含量顯示,12.5 μmol/L姜黃素處理組與DMSO對(duì)照組無差異(p>0.05),25 μmol/L姜黃素處理組與DMSO對(duì)照組相比腸道脂肪含量顯著降低(p<0.05),50和100 μmol/L姜黃素處理組與DMSO對(duì)照組相比腸道脂肪含量極顯著降低(p<0.01)。25和50 μmol/L姜黃素處理組與12.5 μmol/L姜黃素處理組相比有顯著差異(p<0.05),100 μmol/L姜黃素處理組與12.5 μmol/L姜黃素處理組相比有極顯著差異(p<0.01)。且隨著姜黃素濃度升高,線蟲腸道脂肪紅光光密度逐漸減弱。提示姜黃素濃度在25 μmol/L以上具有降低線蟲腸道脂肪作用,50～100 μmol/L姜黃素可以極顯著(p<0.01)降低腸道脂肪。

圖2 姜黃素處理后油紅O染色線蟲腸道脂肪紅光密度Fig.2 The red light density of the nematodes intestinal fat stained by the oil red O after curcumin treatment注:與DMSO對(duì)照組相比,*:p<0.05,**:p<0.01; 與12.5 μmol/L姜黃素處理組相比， #:p<0.05,##:p<0.01;圖3、圖5、圖6同。

2.2 線蟲體內(nèi)甘油三酯含量檢測

圖3顯示,12.5 μmol/L姜黃素處理組與DMSO對(duì)照組相比線蟲體內(nèi)甘油三酯含量無顯著差異(p>0.05),25、50和100 μmol/L姜黃素處理組與DMSO對(duì)照組相比有極顯著差異(p<0.01),25、50和100 μmol/L姜黃素處理組與12.5 μmol/L姜黃素處理組相比有極顯著差異(p<0.01),25、50和100 μmol/L姜黃素處理組之間無顯著差異(p>0.05)。提示姜黃素濃度在25 μmol/L以上時(shí)能夠極顯著(p<0.01)降低線蟲體內(nèi)甘油三酯的含量。

圖3 姜黃素樣本組與DMSO對(duì)照組甘油三酯測定結(jié)果Fig.3 The measurement results of the contents of triglyceride in the sample group of curcumin and DMSO control group

2.3 姜黃素處理對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)T-SOD酶活力的影響

SOD是機(jī)體重要的抗氧化酶,負(fù)責(zé)清除機(jī)體超氧陰離子自由基,起到抗氧化保護(hù)作用[20]。如圖4所示,與DMSO對(duì)照組相比,12.5和25 μmol/L姜黃素處理組秀麗隱桿線蟲體內(nèi)T-SOD酶活力無顯著差異。與DMSO對(duì)照組相比,VE陽性對(duì)照組、50 μmol/L和100 μmol/L姜黃素處理組秀麗隱桿線蟲體內(nèi)T-SOD酶活力極顯著提高(p<0.01)。VE陽性對(duì)照組、50 μmol/L和100 μmol/L姜黃素處理組與12.5和25 μmol/L姜黃素處理組相比有極顯著差異(p<0.01)。該結(jié)果表明,高濃度姜黃素顯著激活了線蟲體內(nèi)T-SOD酶活力。

圖4 不同濃度姜黃素對(duì)線蟲體內(nèi)總超氧化物歧化酶活力的影響Fig.4 Effects of different concentrations of curcuma on the activities of superoxide dismutase in C.elegans注：與DMSD對(duì)照組相比，*：p<0.05,**:p<0.01;與12.5 和25 μmol/L姜黃素處理組相比，#:p<0.05,##:p<0.01。

2.4 姜黃素處理對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)MDA含量的影響

MDA是脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物,常用于評(píng)價(jià)機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度和氧化受損傷程度,MDA的含量越大則說明機(jī)體氧化損傷越嚴(yán)重[21]。如圖5所示,與DMSO對(duì)照組相比,VE陽性對(duì)照組、25、50和100 μmol/L姜黃素處理組秀麗隱桿線蟲體內(nèi)MDA含量極顯著降低(p<0.01)。VE陽性對(duì)照組、25、50和100 μmol/L姜黃素處理組與12.5 μmol/L姜黃素處理組相比有極顯著差異(p<0.01)。25、50和100 μmol/L姜黃素處理組之間無顯著差異(p>0.05)。該結(jié)果表明,姜黃素濃度大于25 μmol/L時(shí)對(duì)線蟲具有抗氧化保護(hù)作用。

圖5 不同濃度姜黃素對(duì)線蟲體內(nèi)氧化產(chǎn)物MDA含量的影響Fig.5 Effects of different concentrations of curcuma on the contents of MDA in C.elegans

3 討論

首先本實(shí)驗(yàn)選擇油紅O對(duì)線蟲脂肪進(jìn)行染色,在顯微鏡下可以直觀地觀察到脂肪積累情況。油紅O為油溶性染料,染色中性脂肪,即染色線蟲中甘油三酯,在倒置顯微鏡普通光條件下即可清晰觀察線蟲腸道脂肪染色情況。但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),油紅O染色過程中只加入油紅O染色效果不是十分明顯,且有部分蟲體沒有染色,分析可能原因?yàn)橛图tO未能充分進(jìn)入線蟲腸道脂肪。Triton X-100是一種非離子型表面活性劑,其能有效增加抗體對(duì)細(xì)胞膜的通透性,因此本實(shí)驗(yàn)將油紅O工作液與Triton X-100溶液以5∶3的比例配制為油紅O染色劑,染色效果良好。Image-Pro Plus 6.0分析油紅O染色線蟲圖像,顯示姜黃素濃度在25 μmol/L以上具有明顯降低線蟲腸道脂肪作用,50～100 μmol/L降低腸道脂肪作用極顯著。

其次甘油三酯水解為甘油和不飽和脂肪酸,故本實(shí)驗(yàn)測定姜黃素作用于線蟲72 h后甘油三酯和甘油含量變化,結(jié)果顯示姜黃素濃度在25 μmol/L以上極顯著降低線蟲體內(nèi)甘油三酯含量,姜黃素濃度在25 μmol/L以上極顯著增加線蟲體內(nèi)甘油含量。

綜上所述,姜黃素濃度在25 μmol/L以上顯著降低線蟲體內(nèi)脂肪沉積,促進(jìn)甘油三酯的分解代謝,增加甘油三酯的分解,提高代謝產(chǎn)物甘油的含量。胡忠澤[22]等人以皖江黃雞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,將216只皖江黃雞隨機(jī)分為4組,在飼料中分別添加不同劑量的姜黃素喂養(yǎng),結(jié)果表明:添加250、350 mg/kg姜黃素顯著地降低了血清中膽固醇含量和甘油三酯濃度,同時(shí)提高了血清中高密度脂蛋白膽固醇水平和游離脂肪酸濃度。于燕[23]等人探討姜黃素對(duì)單純性肥胖大鼠的減肥作用研究,于冬青[24]等人探討姜黃素對(duì)糖尿病大鼠糖、脂代謝及氧化應(yīng)激的影響,發(fā)現(xiàn)給予姜黃素后,顯著減緩大鼠體重增長速度,降低體脂含量;高劑量姜黃素可降低血清中膽固醇和甘油三酯水平。這些實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與本研究結(jié)果相符,都表明姜黃素具有降脂作用。

4 結(jié)論

本研究通過測定油紅O染色線蟲腸道脂肪紅光密度值變化和線蟲體內(nèi)甘油三酯含量變化來確定姜黃素對(duì)秀麗隱桿線蟲脂肪沉積的影響。姜黃素濃度在25 μmol/L以上具有顯著降低線蟲腸道脂肪的作用,50 μmol/L以上作用極顯著,且隨著姜黃素濃度升高,線蟲腸道脂肪含量與蟲體內(nèi)甘油三酯含量均逐漸降低。

同時(shí)本研究通過測定T-SOD酶活力和MDA含量變化確定姜黃素對(duì)線蟲的抗氧化保護(hù)作用。姜黃素濃度在50 μmol/L以上極顯著提高線蟲體內(nèi)T-SOD酶活力,姜黃素濃度在25 μmol/L以上極顯著降低線蟲體內(nèi)MDA含量。

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Lipid-lowering and anti-oxidative effects of curcumin onCaenorhabditiselegans

LI Ping,MI Sheng-quan*,FENG Ya-fang,ZHAO Zhuo

(College of Applied Arts and Science of Beijing Union University,Beijing 100191,China)

To study the lipid-lowering and anti-oxidative effects of curcumin onCaenorhabditiselegans,C.elegansin L1period were exposed to the different concentrations of curcumin(12.5,25,50 and 100 μmol/L)for 48 h. Oil red O stained nematode intestinal fat,the activities of T-SOD,the contents of MDA and triglyceride inC.eleganswere measured. Results showed that compared with DMSO control group,curcumin could reduce intestinal fat inC.elegansat 25 μmol/L or more(p<0.05),curcumin could reduce intestinal fat significantly at 50 μmol/L or more(p<0.01),with the increasing of curcumin concentration,the content of intestinal fat decreased gradually. Curcumin could reduce the contents of triglyceride and MDA inC.eleganssignificantly at 25 μmol/L or more(p<0.01). Curcumin could increase the activities of T-SOD inC.eleganssignificantly at 50 μmol/L or more(p<0.01). In summary,curcumin had lipid-lowering and antioxidant protection effects at 25 μmol/L or more.

curcumin;Caenorhabditiselegans;fat deposition;triglyceride;anti-oxidative

2016-11-28

李萍(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向: 營養(yǎng)與慢性病，E-mail:1114176776@qq.com。

*通訊作者:米生權(quán)(1975-),男，博士，副教授,研究方向:營養(yǎng)與慢性病,E-mail:msq65@buu.edu.cn。

北京市教委研究項(xiàng)目資助(SQKM201311417014)；北京市屬高等學(xué)校人才強(qiáng)教計(jì)劃資助項(xiàng)目(PHR201107150)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)14-0289-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.057