兩種不同方法制備南極磷蝦富脂蛋白的對(duì)比研究

尹利昂,薛長(zhǎng)湖,田利利,姜曉明,尹利端,李兆杰,薛 勇,*(.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 66003; .煙臺(tái)新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)有限公司,山東煙臺(tái) 64006)

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兩種不同方法制備南極磷蝦富脂蛋白的對(duì)比研究

尹利昂1,薛長(zhǎng)湖1,田利利1,姜曉明1,尹利端2,李兆杰1,薛 勇1,*
(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003; 2.煙臺(tái)新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)有限公司,山東煙臺(tái) 264006)

以冷凍南極磷蝦為原料,通過(guò)優(yōu)化自溶條件,采用控制自溶的方式,制備一種富含ω-3的復(fù)合物,并就其基本組成、蛋白質(zhì)變化與分布、營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)等,與等電點(diǎn)促溶/促沉法制備的富脂蛋白進(jìn)行對(duì)比研究。優(yōu)化的自溶條件為55 ℃和pH7.5條件下自溶3 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兩種蛋白均為富含ω-3多不飽和脂肪酸的蛋白-脂質(zhì)復(fù)合物,含有全部的人體必需氨基酸,超過(guò)FAO/WHO/UNU對(duì)食品蛋白質(zhì)中必需氨基酸的要求,而自溶法制備的富脂蛋白在總脂、磷脂、ω-3多不飽和脂肪酸含量,以及必需氨基酸總量上均優(yōu)于后者,平均值分別達(dá)到了43.88%干基、48.84%總脂、31.52%脂質(zhì)和517.4 mg/g蛋白。由此可見(jiàn),控制自溶是一種高效的制備富脂蛋白的方式,有助于磷蝦富脂蛋白作為功能性海洋食品的開發(fā)。

南極磷蝦,富脂蛋白,自溶,ω-3多不飽和脂肪酸

南極磷蝦是一種生活在南極海域的浮游生物,在南極食物鏈系統(tǒng)中擔(dān)任重要角色[1]。作為地球上生物蘊(yùn)藏量最大的物種,南極磷蝦資源的開發(fā)利用引起全世界越來(lái)越多的關(guān)注。南極磷蝦,一般指南極大磷蝦(Euphausiasuperba),除了蝦油產(chǎn)品外,其作為人類日常食物的來(lái)源尚受到一定的成本和技術(shù)上的限制,但它有著均衡的營(yíng)養(yǎng)組成,整蝦含有77.9%～83.1%的水分、0.4%～3.6%的脂質(zhì)、11.9%～15.4%的蛋白質(zhì),以及約2%的甲殼質(zhì)和碳水化合物[2]。南極磷蝦蛋白的營(yíng)養(yǎng)高于一般畜禽肉蛋白和牛乳蛋白,含有全部的人體必需氨基酸,必需氨基酸的總量達(dá)到212.1 mg/g 蛋白質(zhì)[3]。南極磷蝦脂質(zhì)含有比例可觀的多不飽和脂肪酸,其中,DHA和EPA含量分別為16.6%～36.5%和11.1%～24.8%脂質(zhì)[4],且多以磷脂型存在[5]。

南極磷蝦加工的限制性因素較多:含有較高比例的可溶性蛋白成分;其蛋白質(zhì)在本體死亡和冷凍后極易發(fā)生變性;南極磷蝦肌肉中含有4.5～570 mg/kg的氟[6];南極磷蝦體內(nèi),尤其是頭胸部的消化系統(tǒng),含有豐富的和較強(qiáng)活性的自溶酶系,主要是蛋白酶類和酯酶類。南極磷蝦的這些特征增加了傳統(tǒng)途徑的加工成本,使磷蝦資源的大宗利用受到限制,而尚未規(guī)?；淖鳛槿祟愂澄锏膩?lái)源。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),等電點(diǎn)促溶/促沉法制備低氟南極磷蝦基料時(shí),所形成的蛋白復(fù)合物,在一定程度發(fā)生了脂質(zhì)的富集,可以認(rèn)為是一種富脂蛋白[7]。本實(shí)驗(yàn)意在利用南極磷蝦自溶酶的生化特點(diǎn),嘗試制備一種新的富脂蛋白,以推動(dòng)磷蝦加工的研究和相關(guān)產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)。迄今,相關(guān)學(xué)者對(duì)磷蝦自溶酶的生化性質(zhì)進(jìn)行了較為深入的研究[8-12],但利用自溶酶作用制備南極磷蝦制品的開發(fā)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用冷凍南極磷蝦為原料,經(jīng)脫氟、優(yōu)化條件和控制自溶,制備了一種富含ω-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids,PUFAs)的蛋白-脂質(zhì)復(fù)合物,通過(guò)與原料蝦肉、等電點(diǎn)促溶/促沉法制備的富脂蛋白相比較,以期證明其是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、安全性好的富脂蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦(E.superba) 2015年3月捕撈于南極FAO 48.1海域,中國(guó)水產(chǎn)有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris) 北京索萊寶科技有限公司;對(duì)硝基苯酚(p-NP)、對(duì)硝基苯酚丁酸酯(p-NPB)、苯甲酰-L-精氨酰-對(duì)硝基苯胺(BApNA) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;石油醚、乙醚、乙酸、氯仿、甲醇、油酸、乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;福林-酚乙液 上海君瑞生物技術(shù)有限公司;其他試劑等均為分析純。

JB-1A型磁力攪拌器 上海精密科學(xué)儀器有限公司;JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器、HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;GL-20M型高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器廠;016-240改進(jìn)型魚肉分離機(jī) 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院上海漁業(yè)機(jī)械研究所;PF-1氟選擇電極、232甘汞參比電極 上海雷磁精密儀器有限公司;自動(dòng)電位滴定儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司;Biochrom 30+全自動(dòng)氨基酸分析儀 英國(guó)Biochrom公司;6980N氣相色譜儀、5973質(zhì)譜儀、石英毛細(xì)管柱HP-INNOWAX(30 m×0.32 mm×0.25 μm) 美國(guó)安捷倫公司;BRUKER AV500核磁共振波譜儀 德國(guó)布魯克公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 去殼南極磷蝦蝦肉的制備 脫氟:將冷凍南極磷蝦在4 ℃的2 mol/L磷酸溶液中解凍6 h,以降低蝦殼中的氟,防止其向蝦肉中遷移。

采肉:瀝干磷蝦表面水分,以魚肉分離機(jī)采取蝦肉,得到去殼南極磷蝦肉。

1.2.2 自溶法制備富脂南極磷蝦蛋白

1.2.2.1 南極磷蝦粗酶液的制備 收集冷凍南極磷蝦蝦頭,加入2倍質(zhì)量的Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L,pH7.5,4 ℃),高速勻漿后,勻漿液4 ℃、10000 r/min離心30 min,收集上清液,得南極磷蝦粗酶液[13]。粗酶液于-80 ℃冰箱凍存。

1.2.2.2 內(nèi)源酶最適溫度的測(cè)定 取pH7.5的粗酶液,參考Erlanger等的方法[14],以苯甲酰-L精氨酰-對(duì)硝基苯胺(BApNA)為底物,以吸光值最高的pH所對(duì)應(yīng)的酶活力為100%,進(jìn)行粗酶液中蛋白酶在不同溫度條件(5～65 ℃)下相對(duì)活力的測(cè)定;采用對(duì)硝基苯酚(p-NP)法[15],以對(duì)硝基苯酚丁酸酯(p-NPB)為底物,以吸光值最高的pH所對(duì)應(yīng)的酶活力為100%,進(jìn)行粗酶液中脂肪酶在不同溫度條件(5～65 ℃)下相對(duì)酶活力的測(cè)定。

1.2.2.3 內(nèi)源酶最適pH的測(cè)定 以55 ℃為反應(yīng)溫度,BApNA為底物,以吸光值最高的pH所對(duì)應(yīng)的酶活力為100%,進(jìn)行粗酶液中蛋白酶在不同pH(pH3～11)下相對(duì)活力的測(cè)定;以p-NPB為底物,以吸光值最高的pH所對(duì)應(yīng)的酶活力為100%,進(jìn)行粗酶液中脂肪酶在不同pH(pH3～11)下相對(duì)酶活力的測(cè)定。

1.2.2.4 自溶過(guò)程及自溶時(shí)間選擇 準(zhǔn)確稱取8～10 g的去殼南極磷蝦肉,加入3倍體積的Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L,pH7.5,4 ℃),于冰浴條件下高速勻漿。保持pH穩(wěn)定,加入南極磷蝦肉質(zhì)量1/20的上述南極磷蝦粗酶液,分別于55 ℃水浴、溫和攪拌條件下自溶1、2、3、4 h,快速升溫滅酶(90 ℃保持5 min),并于冷卻后離心(5000 r/min,10 min),收集沉淀部分即自溶法制備的富脂蛋白。

以Folch方法[16]提取其中的脂質(zhì),以薄層色譜法(TLC)分析不同的自溶時(shí)間節(jié)點(diǎn)時(shí),游離脂肪酸(FFA)、溶血卵磷脂(LPC)等脂質(zhì)品質(zhì)劣化代表產(chǎn)物含量的變化趨勢(shì)。以油酸(C18∶1)為參照,中性展開劑為石油醚∶乙醚∶乙酸=85∶15∶1(v/v/v),極性展開劑為氯仿∶甲醇∶水=65∶25∶4(v/v/v)。

1.2.3 等電點(diǎn)促溶/促沉法制備富脂南極磷蝦蛋白 準(zhǔn)確稱取8～10 g的去殼南極磷蝦肉,加入3倍體積的4 ℃的蒸餾水,高速勻漿。以10 mol/L和4 mol/L NaOH調(diào)節(jié)勻漿液pH至11.5,在冰浴條件下攪拌30 min以溶解南極磷蝦蛋白,5000 r/min離心10 min,收集沉淀部分,重復(fù)一次以上的蛋白溶解操作。將先后兩次離心的上清混合,以10 mol/L和4 mol/L HCl調(diào)節(jié)混合液pH至4.5,冰浴靜置30 min,5000 r/min離心10 min,收集沉淀部分,得等電點(diǎn)促溶/促沉法制備的富脂蛋白[7]。

1.2.4 基本成分分析 水分含量:采用直接干燥法測(cè)定,參照GB/T 5009.3-2010?？傊?參照Folch[16]的方法,采用氯仿/甲醇(2/1,v/v)提取磷蝦油,以蝦油質(zhì)量除以樣品質(zhì)量,即得總脂含量;該磷蝦油用于脂肪酸組成分析和磷脂、游離脂肪酸含量測(cè)定。蛋白質(zhì)含量:采用凱氏定氮法測(cè)定,參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.5-2010。灰分含量:參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.4-2010測(cè)定。總氟含量:精確稱量2 g樣品,采用堿熔固定-高溫灰化-氟離子選擇電極法測(cè)定[17],以0.1 mol/L高氯酸為氟的提取試劑。

1.2.5 蛋白質(zhì)的雙向二維電泳分析 提取和純化兩種富脂蛋白,采用雙向二維電泳(2-DE)分析幾種蛋白的分布特征[18]。

1.2.5.1 電泳樣品的制備 在研缽中倒入液氮預(yù)冷,然后將樣品置于研缽中,再次迅速加入液氮,待液氮揮發(fā)完之后再倒一次液氮,至研缽中液氮停止沸騰后迅速研磨,直至組織變成粉末,均勻而沒(méi)有明顯顆粒。在研缽中加入800 μL RB(使用前加入1×PMSF),充分溶解粉末后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中。

將EP管中樣品以超聲破碎儀進(jìn)行超聲破碎,頻次為8次/輪,共超聲8～9輪。每完成一輪的超聲破碎,將樣品立即冰浴1 min,然后進(jìn)行離心(4 ℃,12000 r/min,20 min),收集上清液。將上清液分裝成3管,每管約250 μL,每管再加入4倍樣本體積丙酮-20 ℃沉淀過(guò)夜。沉淀完的蛋白質(zhì)進(jìn)行離心(4 ℃,12000 r/min,20 min),倒去上清液后,平放于干凈的紙巾上自然干燥,即可得到處理后的蛋白質(zhì)團(tuán)塊,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 二維電泳條件 一向等電聚焦電泳(IEF):pH3～10;二向垂直電泳(SDS-PAGE):15～170 kDa;染色:銀染。以ImageMaster 2D platinum 5.0進(jìn)行圖像分析。

1.2.6 氨基酸組成分析 參照GB/T5009.124-2003。

1.2.7 脂肪酸組成分析 蝦油脂肪酸甲酯化條件:取磷蝦油10 mg,加入1 mL 10%濃硫酸-甲醇溶液(或濃鹽酸∶甲醇=1∶5),于90 ℃水浴甲酯化30 min,冷卻后加入正己烷1 mL振蕩,靜置分層,取上清液供GC/MS分析[19]。

色譜條件:HP-INNOWax石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm),高純氦氣為載氣,采用恒壓模式,壓力為54 kPa,分流比為25∶1。進(jìn)樣口溫度為230 ℃,檢測(cè)器溫度為250 ℃,柱溫以3 ℃/min由140 ℃升到210 ℃,然后在210 ℃下保持10 min,整個(gè)分析過(guò)程為33 min。

質(zhì)譜條件:GC/MS接口溫度280 ℃,EI離子源,電離能量70 eV,離子源溫度230 ℃,掃描周期2.84次/s,質(zhì)量掃描范圍m/z 50～500 u。

1.2.8 磷脂和游離脂肪酸含量測(cè)定 磷脂含量測(cè)定[20]:核磁共振法(31PNMR)。以三氯甲烷∶氘代甲醇(2∶1)溶劑為溶劑,磷酸三苯酯(TPP)為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行核磁共振分析。

游離脂肪酸含量測(cè)定:采用自動(dòng)電位滴定法[21],以石油醚∶乙醇(2∶1)為混合溶劑,0.1 mol/L NaOH溶液為滴定試劑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各數(shù)據(jù)均平行測(cè)定三次。運(yùn)用分析軟件SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用one-way ANOVA算法進(jìn)行方差分析。多重比較分析采用Tukey’s test算法判斷顯著性差異(p<0.05)。表2～表3同。

2 結(jié)果與分析

2.1 自溶條件的優(yōu)化

2.1.1 自溶溫度和pH的選擇 南極磷蝦自溶酶系主要由蛋白酶和脂肪酶構(gòu)成,為探索最佳的自溶效果,本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在不同溫度和pH條件下兩種酶類的相對(duì)活性。如圖1所示,南極磷蝦蛋白酶系的最高相對(duì)活性對(duì)應(yīng)的溫度為55 ℃、pH為7.5,體現(xiàn)了其類胰蛋白酶的屬性。這與以往研究者報(bào)道的結(jié)果一致,Kubota等[22]認(rèn)為對(duì)自溶起主要作用的是消化道內(nèi)的蛋白酶,這些酶最適pH為6～8;Osnes等[9]也認(rèn)為磷蝦自溶酶中起著決定作用是類胰蛋白酶,整體自溶酶活性在中性至弱堿性條件下最強(qiáng);Kimoto等[10]研究顯示南極大磷蝦的類胰蛋白酶對(duì)其自溶起主要的作用;Konagaya[23]通過(guò)分離鑒定南極磷蝦體內(nèi)的蛋白酶,也認(rèn)為其主要的蛋白酶為類胰蛋白酶。

就脂肪酶類而言,由圖1可以看出,南極磷蝦脂肪酶系為低溫酶,其較適宜的溫度為5～40 ℃,最高相對(duì)活性對(duì)應(yīng)的溫度為35 ℃、pH為7.5。Turkiewicz等[24]的研究表明,磷蝦酯酶在pH4.6和37 ℃下具有最大活性,55 ℃下5 min熱處理可以使其完全失活。尚憲明[12]進(jìn)行了反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH對(duì)酶促反應(yīng)速率影響的實(shí)驗(yàn),結(jié)論認(rèn)為,南極磷蝦脂肪酶最佳反應(yīng)pH為8.0左右,其對(duì)較高溫度的穩(wěn)定性差,在35 ℃具有最佳反應(yīng)速率,具有低溫脂肪酶的催化特性,并分析這可能與其生活環(huán)境相關(guān)。

圖1 冷凍南極磷蝦自溶酶的相對(duì)活性Fig.1 Relative activity of autoenzyme from frozen Antarctic krill注:(a)和(b)分別表示自溶酶在不同溫度和pH條件下相對(duì)活性的變化。

脂肪酶類在自溶過(guò)程中,容易導(dǎo)致脂質(zhì)的酶促降解,引起游離脂肪酸(FFA)和溶血卵磷脂(LPC)水平的上升,使自溶產(chǎn)物的脂質(zhì)發(fā)生品質(zhì)的劣化,因此有必要采取合適的自溶條件,在促進(jìn)蛋白酶類作用的同時(shí),抑制脂肪酶類的活性。鑒于蛋白酶在55 ℃和pH7.5分別顯現(xiàn)最高的相對(duì)活性,而在55 ℃反應(yīng)溫度下,脂肪酶類的相對(duì)活性只有最高時(shí)的20%～30%,本實(shí)驗(yàn)采用的自溶溫度和pH分別為55 ℃和7.5。

2.1.2 自溶時(shí)間的選擇 一般來(lái)說(shuō),隨著自溶時(shí)間的延長(zhǎng),脂肪酶作用對(duì)自溶產(chǎn)物的不利影響會(huì)逐漸增大,如圖2所示,在不同時(shí)間(1、2、3、4 h)的平行自溶產(chǎn)物中,隨著自溶時(shí)間的延長(zhǎng),作為脂質(zhì)劣化標(biāo)志性產(chǎn)物的FFA、LPC呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),在1～3 h的自溶中,二者含量的增加比較緩慢,而自溶4 h時(shí)則呈現(xiàn)急劇增加的特點(diǎn)。為避免脂質(zhì)劣化給自溶產(chǎn)物帶來(lái)不利影響,優(yōu)化的自溶時(shí)間以3 h為宜。因此,結(jié)合自溶效果,本實(shí)驗(yàn)選擇自溶時(shí)間為3 h的反應(yīng)產(chǎn)物為富脂蛋白。

表1 南極磷蝦肉和兩種富脂蛋白的基本成分Table 1 Basic composition of AKM,OEP-A and OEP-ISP

注:AKM,南極磷蝦肉;OEP-A,自溶3 h制備的富脂蛋白;OEP-ISP,等電點(diǎn)促溶/促沉法制備的富脂蛋白。表2～表3同

圖2 不同自溶時(shí)間所對(duì)應(yīng)脂質(zhì)的薄層色譜分析Fig.2 TLC analysis oflipid from OEP with different autolysis time注:(a)中性展開;(b)極性展開;TG-甘油三酯。

2.2 基本成分分析

所制備OEP-A的干物質(zhì)得率平均為40.53%,OEP-ISP的干物質(zhì)得率平均為41.16%。去殼南極磷蝦肉及兩種富脂蛋白的基本組成見(jiàn)表1。原料中蛋白質(zhì)含量(68.05%±0.45%干基)遠(yuǎn)高于總脂含量(19.72%±0.32%干基)。自溶過(guò)程中,蛋白酶能夠有效的降解蛋白質(zhì),而在溶解/等電沉淀法中,在等電點(diǎn)pH4.5處,半數(shù)以上的蛋白能夠析出而形成沉淀[25],這也是自溶方法的干物質(zhì)得率略低于后者的原因。

由表1可知,OEP-ISP中的蛋白、總脂的比例接近2∶1,這與王靈昭等[25]使用等電點(diǎn)溶解-沉淀法(ISP方法)所制備的低氟南極磷蝦基料中蛋白、總脂的比例相接近。OEP-A中的蛋白、總脂的比例略高于1∶1,就總脂含量而言,自溶方式比等電點(diǎn)促溶/促沉方式對(duì)脂質(zhì)的富集能力更強(qiáng),這可能是由于在酶解過(guò)程中,蛋白酶作用較強(qiáng)而脂肪酶作用較弱,有相當(dāng)比例的非水溶性蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后,以多肽、氨基酸的形式進(jìn)入到上清液中。兩種富脂蛋白中的平均干基氟含量分別為35.27 mg/kg和24.81 mg/kg,符合美國(guó)FDA對(duì)食品中氟含量100 mg/kg的限定標(biāo)準(zhǔn)要求,ISP法對(duì)氟的脫除效果較自溶方式稍好。這可能是由于ISP過(guò)程中,除了經(jīng)歷水洗作用,蛋白質(zhì)的完全溶解使氟釋放的比較充分,相關(guān)研究結(jié)果證實(shí)酸處理更能加速氟的脫除[6,26-28]。表1數(shù)據(jù)對(duì)比說(shuō)明,自溶是有效的富集脂質(zhì)的方式。同時(shí),自溶過(guò)程所產(chǎn)生的上清液,含有蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸及部分脂質(zhì),經(jīng)有效的脫氟后,可以作為后續(xù)開發(fā)風(fēng)味類產(chǎn)品的原料。

2.3 蛋白質(zhì)的分布情況

圖3 南極磷蝦蛋白與兩種富脂蛋白的雙向二維電泳圖譜Fig.3 2-DE spectrum of protein from AKM,OEP-A and OEP-ISP注:(a)、(b)、(c)分別為AKM、OEP-A和OEP-ISP蛋白的雙向二維電泳圖。

由于制備原理的不同,OEP-A及OEP-ISP的蛋白分布情況有所差異,如圖3所示。由圖3可以看出,南極磷蝦蛋白的2-DE圖譜上的斑點(diǎn)集中在pH4～5,尤其以pH4.5處最為集中,說(shuō)明南極磷蝦蛋白的等電點(diǎn)在pH4.5附近,這與已報(bào)道的南極磷蝦蛋白等電點(diǎn)pH4.6相近[25],同時(shí)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中制備OEP-ISP所采用的等電點(diǎn)是正確的。南極磷蝦蛋白的分子量集中在35～55 kDa和70～100 kDa。由圖3(a)～圖3(c)對(duì)比可以看出,南極磷蝦肉蛋白(圖3(a))在170 kDa處有少量斑點(diǎn)(spots),該斑點(diǎn)通常被認(rèn)為是魚類、對(duì)蝦和磷蝦肌原纖維蛋白中的肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC)的所在[29-30]。MHC斑點(diǎn)或條帶的弱化,是其所在的蛋白質(zhì)凝膠性和ATPase活性減弱的表征。這說(shuō)明,南極磷蝦在經(jīng)歷了死亡和長(zhǎng)期凍藏后,其蛋白質(zhì)可能發(fā)生了較嚴(yán)重的降解和變性。在圖3(b)及圖3(c)中,MHC的斑點(diǎn)幾乎完全消失,并且代表肌動(dòng)蛋白的40～55 kDa的斑點(diǎn)也明顯的減少和弱化,這可能是肌原纖維蛋白受溫度、酸堿作用的影響,發(fā)生了進(jìn)一步的降解[31-32]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在自溶過(guò)程中,肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白是蛋白酶作用的主要對(duì)象[33]。與此同時(shí),低于35 kDa的小分子量蛋白斑點(diǎn)增加,圖3(c)的增加尤其明顯,說(shuō)明酸堿對(duì)南極磷蝦蛋白質(zhì)的降解作用較強(qiáng)。

表2 南極磷蝦肉蛋白和兩種富脂蛋白的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of protein from AKM,OEP-A,and OEP-ISP

注:Lys,賴氨酸;Trp,色氨酸;Phe,苯丙氨酸;Tyr,絡(luò)氨酸;Met,甲硫氨酸;Cys,半胱氨酸;Thr,蘇氨酸;Ile,異亮氨酸;Leu,亮氨酸;Val,纈氨酸;His,組氨酸;Glu,谷氨酸;Asp,天冬氨酸;Ala,丙氨酸;Arg,精氨酸;Ser,絲氨酸;Gly,甘氨酸;Pro,脯氨酸;EAA,必需氨基酸;NEAA,非必需氨基酸。

2.4 氨基酸組成分析

氨基酸組成特別是必需氨基酸(EAA)的含量,是衡量蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。由表2可以看出,3種南極磷蝦蛋白中必需氨基酸的含量,分別達(dá)到486.8、517.4和503.8 mg/g蛋白,均超過(guò)FAO/WHO/UNU對(duì)成人(嬰兒)食品蛋白中必需氨基酸的要求[277(292.6) mg/g蛋白][34]。OEP-A和OEP-ISP蛋白的必需氨基酸總量在AKM蛋白的基礎(chǔ)上得到提升,OEP-A蛋白的必需氨基酸總量更高。經(jīng)過(guò)兩種方式的處理,賴氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸的含量增加明顯,其中標(biāo)志蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的賴氨酸(Lys),在OEP-A中的含量達(dá)到93.4 mg/g蛋白,高于在AKM和OEP-ISP中的含量(88.5、89.7 mg/g蛋白)。

2.5 脂肪酸組成分析

3種脂質(zhì)的脂肪酸組成如表3所示。OEP-A的PUFAs含量超過(guò)了其它2種脂質(zhì),其中EPA(C20∶5 n-3)和DHA(C22∶6 n-3)的含量之和達(dá)到30.44%,明顯高于AKM的28.39%和OEP-ISP的28.50%,ω-3 PUFAs(C18∶3 n-3、C20∶5 n-3、C22∶6 n-3)含量達(dá)31.52%，這說(shuō)明OEP-A的脂質(zhì)含有豐富的ω-3 PUFAs,考慮到OEP-A中的總脂含量達(dá)到43.88%干基,故本實(shí)驗(yàn)將自溶法制備的脂質(zhì)-蛋白復(fù)合物稱為ω-3富脂蛋白(omega-3-enriched protein,OEP)。

表3 南極磷蝦肉和兩種富脂蛋白脂質(zhì)的脂肪酸組成Table 3 Fatty acid composition of lipids from AKM,OEP-A,and OEP-ISP

注:SFAs,飽和脂肪酸;MUFAs,單不飽和脂肪酸;PUFAs,多不飽和脂肪酸。

2.6 磷脂和游離脂肪酸含量分析

本實(shí)驗(yàn)采用核磁共振方法(31P NMR)以準(zhǔn)確定量脂肪中的磷脂含量,結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 自溶法所制備的富脂蛋白脂質(zhì)的31P NMR譜圖Fig.4 31P NMR spectrum of lipid from OEP prepared with autolysis

3種脂質(zhì)的磷脂和游離脂肪酸含量如表4所示,OEP-A脂質(zhì)的磷脂含量(48.84%±0.57%總脂)比AKM脂質(zhì)中磷脂含量(33.16%±0.41%總脂)和OEP-ISP脂質(zhì)中磷脂含量(34.97%±0.48%總脂)明顯提高,說(shuō)明OEP-A是一種富含磷脂結(jié)合型脂質(zhì)的復(fù)合物。自溶酶解法提高脂質(zhì)中磷脂含量的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道,故這一發(fā)現(xiàn)將作為后續(xù)研究的重點(diǎn)。OEP-A所含的脂質(zhì),可以對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)健康起到良好的維護(hù)作用[35],不僅是由于其含有豐富的ω-3 PUFAs,還有重要一點(diǎn)是,其脂肪酸主要以磷脂結(jié)合的形式存在,據(jù)相關(guān)研究證實(shí),磷脂型脂質(zhì)在人體內(nèi)的吸收效率和安全程度更高[36-37]。因此,OEP-A可以認(rèn)為是一種富含磷脂型PUFAs的復(fù)合物。OEP-A脂質(zhì)中的游離脂肪酸含量較AKM的略有增加,這可能是自溶過(guò)程中脂肪酶的分解作用所致。

表4 三種脂質(zhì)的磷脂和游離脂肪酸含量Table 4 Phospholipid and free fatty acid content of lipid from AKM and two OEP

3 結(jié)論

本研究的結(jié)果表明,可以通過(guò)優(yōu)化的自溶方法:于55 ℃、pH7.5條件下經(jīng)自溶酶3 h的作用,制備得到富含ω-3的蛋白-脂質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物具有優(yōu)異的氨基酸及脂肪酸組成,其EAA、ω-3 PUFAs分別達(dá)到517.4 mg/g蛋白和31.52%脂質(zhì),并含有較高的磷脂含量(48.84%總脂),安全的氟含量(35.27 mg/kg干重)以及合理的游離脂肪酸含量(4.72%總脂)。該富脂蛋白制備過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物可以用于開發(fā)磷蝦風(fēng)味產(chǎn)品,為南極磷蝦的綜合利用提供新途徑。自溶法制備的富脂蛋白對(duì)人體健康有積極的意義,具有開發(fā)功能性海洋食品的潛在價(jià)值。

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Comparative research of two omega-3-enriched protein prepared from Antarctic krill(Euphausiasuperba)with different methods

YIN Li-ang1,XUE Chang-hu1,TIAN Li-li1,JIANG Xiao-ming1,YIN Li-duan2,LI Zhao-jie1,XUE Yong1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China; 2.Yantai New Era Health Industry Co.,Ltd.,Yantai 264006,China)

Omega-3-enriched protein(OEP)was prepared with controlled autolysis from Antarctic krill(Euphausiasuperba)meat(AKM)with optimization,and compared with OEP prepared with isoelectric solubilization/precipitation(ISP)from basic composition,nutritional evaluation,and variations and distributions of proteins. The optimized condition was that autolysis at 55 ℃ and pH7.5 for 3 h,either protein was demonstrated to be a protein-lipid complex which was rich in ω-3 polyunsaturated fatty acids(ω-3 PUFAs),and exhibited excellent amino-acid composition in all the essential amino acids,exceeding the requirements of the FAO/WHO/UNU for food protein. Total lipid,phospholipid,ω-3 PUFAs and essential amino acids were richer in the OEP prepared with autolysis,and the average values reached 43.88% dry basis,48.84%total lipid,31.52% lipid and 517.4 mg/g protein. This study indicated that controlled autolysis was an efficient way of preparation of ω-3-enriched protein,promotingits development as a functional seafood product in future.

Antarctic krill;ω-3-enriched protein;autolysis;ω-3 PUFAs

2016-12-20

尹利昂(1983-)，男，博士研究生，工程師，研究方向：水產(chǎn)品加工，E-mail:yinliang2011@163.com。

*通訊作者:薛勇(1976-)，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品加工，E-mail:xueyong@ouc.edu.cn。

山東省科技重大專項(xiàng)海洋食品現(xiàn)代加工與產(chǎn)業(yè)鏈質(zhì)量控制體系研究(2015ZDZX05003)。

TS254.4

A

1002-0306(2017)14-0075-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.015