補(bǔ)腎健脾活血方干預(yù)過(guò)表達(dá)DKK1骨細(xì)胞對(duì)細(xì)胞活性及BMP2的影響

王凡 黃宏興 王吉利 萬(wàn)雷 黃紅 柴爽

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510240

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征,導(dǎo)致骨脆性增加和易于骨折的全身性骨代謝疾病。其中最近研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)系統(tǒng)在成骨細(xì)胞的發(fā)育和分化過(guò)程中扮演重要角色，它是目前骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制和骨代謝研究的新熱點(diǎn)，其中DKK1(Dickkopf1，DKK1)是Wnt信號(hào)通路的抑制因子，DKK1調(diào)控Wnt信號(hào)通路在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病中也扮演著重要的角色。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥屬于“骨痹”的范疇，中醫(yī)主要病機(jī)是腎虛、血瘀，治以補(bǔ)腎、健脾、活血法為主，本研究應(yīng)用補(bǔ)腎健脾活血方觀察對(duì)成骨細(xì)胞MG63的影響，我們采用重組過(guò)表達(dá)腺病毒DKK1方法構(gòu)建成骨細(xì)胞模型，抑制成骨細(xì)胞的增殖和骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，觀察補(bǔ)腎健脾活血方干預(yù)MG63細(xì)胞對(duì)細(xì)胞增殖和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone Morphogenetic Protein 2，BMP2)的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雌性6月齡SPF級(jí)SD大鼠16只，體重240 g～260 g，均購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(粵)2011-0015】，分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后制備含藥血清；補(bǔ)腎健脾活血方(淫陽(yáng)藿10 g、熟地黃10 g、肉蓯蓉10 g、大棗10 g、當(dāng)歸10 g、丹參10 g、菟絲子10 g、補(bǔ)骨脂10 g、黃芪10 g、白芍10 g)購(gòu)置于廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院，并在本院制劑室制成水煮液(1.43 g生藥/mL)。

1.1.2 儀器和試劑：人成骨肉瘤細(xì)胞(MG63) 由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)提供，DMEM高糖培養(yǎng)基、FBS、胰酶(美國(guó)Gibco公司)，CCK8(中國(guó)同仁化學(xué)公司)，BCA蛋白定量試劑盒(中國(guó)弗德生物公司)，EGTA、Triton(美國(guó)Sigma公司)，脫脂奶粉(美國(guó)BD公司)，抗BMP2抗體(美國(guó)Abcam公司)，PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，超凈操作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.2 制備含藥血清

將16只6月齡雌性SD大鼠隨機(jī)分成生理鹽水組、中劑量組(4.8 g/kg)，每組8只。灌胃給藥，每天2次，間隔5 h，連續(xù)灌胃3 d，最后一次灌胃后2 h腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心獲取血清，滅活，過(guò)濾除菌，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 MG63細(xì)胞培養(yǎng)

人骨肉瘤細(xì)胞MG63培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基(含1%Pen/Strep)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞1次，隔2-4天換培養(yǎng)液1次。培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～95% 融合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代或收集細(xì)胞鋪板培養(yǎng)。棄去舊培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶消化液2 mL，細(xì)胞變圓﹑上浮后，加入4 mL培養(yǎng)液終止消化，再轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，1 000 r/min離心4 min，棄上清液，以1∶4～1∶6比例轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.4 重組腺病毒感染MG63細(xì)胞

MG63 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后分為空載病毒組(NC 對(duì)照組)、過(guò)表達(dá) DKK1(Ad-DKK1)組，分別用空載腺病毒和重組腺病毒 Ad-DKK1感染各組 MG63 細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)(MOI)為50。重組腺病毒感染 48 h 后，分別消化收集細(xì)胞，采用 qPCR、Western Blot 檢測(cè) DKK1、Sost 在 MG63 細(xì)胞中的表達(dá)，其具體方法參考前期研究基礎(chǔ)[1]。

1.5 CKK8檢測(cè)含藥血清對(duì)MG63增殖活性的影響

0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，1 000 rpm離心5 min收集細(xì)胞深沉，分別用含10%不同濃度的含藥血清(0、2.4、4.8、9.6 g/mL)DMEM高糖培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度5.0-6.0×104 Cells/mL，接種96孔板，每孔加100 μL的細(xì)胞懸液約5000-6 000個(gè)細(xì)胞，在37 ℃，5 % CO2條件下孵育，分別0、24、48、72 h后；棄去原培養(yǎng)基，加入100 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1.5～2.5 h，酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)各孔的吸光度(A)值。

將培養(yǎng)細(xì)胞分成NC對(duì)照組，Ad-DKK1組。NC對(duì)照組空載腺病毒轉(zhuǎn)染；Ad-DKK1組由包裝過(guò)表達(dá)DKK1腺病毒轉(zhuǎn)染。每組分別用含藥血清和空白血清干預(yù)。

1.6 Western blot檢測(cè)BMP2

過(guò)表達(dá)DKK1轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞72-96 h后，消化收集細(xì)胞提取蛋白，4 ℃的PBS溶液沖洗細(xì)胞4次。投放適量RIPA(使用前根據(jù)100∶1的比例在RIPA中加的PMSF蛋白裂解液)到細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)4 min。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下，收集到1.5 mL離心管中；冰浴30 min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解；12 000 g離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液。采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，將60 μg蛋白的溶液體積設(shè)成上樣量，于蛋白標(biāo)本內(nèi)添加一定量的5*蛋白上樣緩沖液，置于100 ℃調(diào)節(jié)下變性300 s，進(jìn)行Western blot檢測(cè)時(shí)采用SDS-30%丙烯酰胺凝膠使蛋白分離后，以75 V電壓電泳15 min，見(jiàn)溴酚藍(lán)蛋白樣品在濃縮膠中跑壓成一條直線且標(biāo)記marker肉眼可見(jiàn)條帶分開(kāi)后轉(zhuǎn)為120 V電壓繼續(xù)電泳40分鐘，而后PVDF膜在5%的脫脂牛奶(0.5% TBST)，封閉60 min；一抗于4 ℃撫育過(guò)夜，TBST于室溫條件洗3次后加二抗于室溫下孵育0.5 h，再用TBST于室溫條件下洗3次，取相同量的A和B試劑，于暗室顯影，并用膠片進(jìn)行掃描后保存，采用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 含藥血清對(duì)人成骨細(xì)胞MG63細(xì)胞增殖的影響

表1 細(xì)胞活性Table 1 Cell activity

注：與NC對(duì)照組空白血清比較，**P<0.01;在 Ad-DKK-1組空白血清比較，##P<0.01

圖1 細(xì)胞活性Fig.1 Cell activity

2.2 補(bǔ)腎健脾含藥血清對(duì)BMP2的影響

表2 BMP2蛋白檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of BMP2 protein test

注：在NC對(duì)照組，與含藥血清干預(yù)相比，**P<0.01;在 Ad-DKK-1組，與含藥血清干預(yù)相比，##P<0.01

圖2 BMP2蛋白檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of BMP2 protein test

圖3 BMP2蛋白檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Results of BMP2 protein test注：在NC對(duì)照組，與含藥血清干預(yù)相比，**P<0.01;在 Ad-DKK-1組，與含藥血清干預(yù)相比，##P<0.01Note：In the NC group, compared with medicated serum, **P<0.01; in the Ad-DKK-1 group, compared with medicated serum, ##P<0.01

3 討論

目前治療骨質(zhì)疏松的藥物主要是通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的骨吸收，治療骨質(zhì)疏松癥。中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松癥取得了良好的效果，但是其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

骨質(zhì)疏松癥從中醫(yī)辨證屬于腎虛、脾虛、血瘀，治以補(bǔ)腎健脾活血。本研究選用淫陽(yáng)藿、熟地黃、肉蓯蓉、大棗、當(dāng)歸、丹參、菟絲子、補(bǔ)骨脂、黃芪、白芍。本方以補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎壯骨為君藥；配以熟地、淫羊藿、白芍補(bǔ)腎滋陰益精為臣藥,此乃 “壯水之源,以制陽(yáng)光”之意；同時(shí)配以黃芪補(bǔ)中益氣,當(dāng)歸、丹參活血通絡(luò),共為佐藥, 此既可培補(bǔ)后天生化之源以充腎精, 又可達(dá)到補(bǔ)中寓通、補(bǔ)而不滯的目的。其中單味藥物的研究也發(fā)現(xiàn)單體對(duì)成骨細(xì)胞的增殖起到促進(jìn)的作用，淫羊藿總黃酮含藥血清可以刺激成骨細(xì)胞增殖活性并顯著提高堿性磷酸酶活性、礦化結(jié)節(jié)數(shù)和Ⅰ-型膠原表達(dá)，促進(jìn)其分化成熟[2]。

人類DKK1基因位于10號(hào)染色體10q11上，由266個(gè)氨基酸組成，其相對(duì)分子質(zhì)量在29k左右。DKK1和 Wnt蛋白競(jìng)爭(zhēng)性與膜受體結(jié)合，DKK1與LRP5/6結(jié)合后，下調(diào)胞漿 β-catenin 水平，進(jìn)而抑制 Wnt /β-catenin 信號(hào)通路，抑制轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的表達(dá)， 使成骨細(xì)胞數(shù)量減少、 活性降低[3]。Wnt信號(hào)通路促進(jìn)前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，但是DKK1 抑制這一過(guò)程[4]。DKK1+/-小鼠由于嚴(yán)重的發(fā)育異常，出生后不久死亡，但是DKK1+/-小鼠只有骨形成和骨質(zhì)量增加，而沒(méi)有代償性骨吸收的改變[5]。在小鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型中，應(yīng)用DKK1抗體可顯著增加成骨細(xì)胞數(shù)量和血清骨鈣素水平[5]表達(dá)。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β超家族，能夠誘導(dǎo)人類間充質(zhì)細(xì)胞分化骨、軟骨等組織，在成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)分化以及胚胎發(fā)育過(guò)程中有重要作用。其中BMP2的研究較為深入，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，可高效誘導(dǎo)成骨活性。BMP2可以提高成骨細(xì)胞的活性，同時(shí)ALP活性與BMP2的濃度成正比，BMP2可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化作用[6]。Zhang等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，BMP2可以通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路配體、β-catenin磷酸化抑制劑及LRP-5的表達(dá)來(lái)促進(jìn)β-catenin在成骨細(xì)胞中表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。

前期研究已發(fā)現(xiàn)當(dāng)過(guò)表達(dá)DKK1后，干預(yù)成骨細(xì)胞，其細(xì)胞活性和BMP2的表達(dá)都降低。在本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)空白血清和含藥血清分別干預(yù)Ad-DKK1時(shí)，含藥血清提高細(xì)胞的活性更明顯，與空白血清和含藥血清分別干預(yù)NC對(duì)照組比較，含藥血清干預(yù)Ad-DKK1后細(xì)胞活性升高的趨勢(shì)更明顯；當(dāng)空白血清和含藥血清分別干預(yù)Ad-DKK1時(shí)，含藥血清提高細(xì)胞的BMP2的表達(dá)更明顯，與空白血清和含藥血清分別干預(yù)NC對(duì)照組比較，含藥血清干預(yù)Ad-DKK1后細(xì)胞BMP2的表達(dá)趨勢(shì)更明顯；通過(guò)提高細(xì)胞的活性和提高BMP2的表達(dá)，有利于提高成骨細(xì)胞的活性，向骨細(xì)胞礦化，提高骨礦含量。

綜上，本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)補(bǔ)腎健脾活血方可以提高細(xì)胞的活性，提高BMP2的蛋白表達(dá)，尤其是補(bǔ)腎健脾活血方含藥血清干預(yù)過(guò)表達(dá)DKK1的成骨細(xì)胞模型，為補(bǔ)腎健脾活血方治療骨質(zhì)疏松癥提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而本實(shí)驗(yàn)中含藥血清組和空白血清組都提高了細(xì)胞的活性和BMP2的表達(dá)，不能完全說(shuō)明補(bǔ)腎健脾活血方是通過(guò)Wnt信號(hào)通路來(lái)影響成骨細(xì)胞的增殖，有待進(jìn)一步研究。