缺血后處理對(duì)止血帶休克致腎損傷的作用

趙利軍,李開(kāi)濟(jì),吳 靜,門(mén)秀麗*

(1華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，唐山 063000;2唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;*通訊作者,E-mail:xiulimen@126.com)

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缺血后處理對(duì)止血帶休克致腎損傷的作用

趙利軍1,2,李開(kāi)濟(jì)1,2,吳 靜1,2,門(mén)秀麗1,2*

(1華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，唐山 063000;2唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;*通訊作者,E-mail:xiulimen@126.com)

目的 觀(guān)察缺血后處理對(duì)止血帶休克致腎損傷的作用,并探討其可能機(jī)制。 方法 30只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組)、止血帶休克組(TOS組)和缺血后處理組(I-postC組)。止血帶法制作止血帶休克動(dòng)物模型,另對(duì)I-postC組動(dòng)物在止血帶休克基礎(chǔ)上實(shí)施缺血后處理。經(jīng)腹主動(dòng)脈取血測(cè)各組大鼠血漿肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、C反應(yīng)蛋白(CRP)水平;腎組織勻漿測(cè)組織SOD、MDA、XOD和MPO水平;免疫組化法檢測(cè)腎組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的表達(dá);TUNEL法檢測(cè)腎細(xì)胞凋亡;電鏡下觀(guān)察腎組織超微結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果 ①與Control組比較,后兩組腎組織SOD活力明顯降低(P<0.01),血漿Cr、BUN、CRP均升高(P<0.01);腎組織MDA、XOD和MPO升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);免疫組化檢測(cè)中Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)略增強(qiáng);TUNEL法檢測(cè)可見(jiàn)腎細(xì)胞凋亡數(shù)目增多;透射電鏡下可見(jiàn)腎近曲小管上皮細(xì)胞核固縮,胞內(nèi)空泡,溶酶體和致密顆粒沉積增多,部分線(xiàn)粒體嵴斷裂或模糊。腎小球足突細(xì)胞突起不規(guī)則、融合,線(xiàn)粒體嵴斷裂并減少,有空泡,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。②與TOS組比較,I-postC組腎組織SOD活性增強(qiáng),血漿Cr、BUN、CRP及腎組織MDA、XOD、MPO等相關(guān)損傷指標(biāo)均有所下降,差異具有顯著性(P<0.05或P<0.01)；Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)而B(niǎo)ax減弱,腎凋亡細(xì)胞數(shù)目減少。電鏡下觀(guān)察可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞及腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度減輕。 結(jié)論 肢體長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用止血帶可導(dǎo)致腎功能障礙和腎組織結(jié)構(gòu)損傷,缺血后處理可通過(guò)減少氧自由基生成和抑制炎癥反應(yīng),減輕腎損傷。

止血帶休克； 腎損傷； 缺血后處理； 細(xì)胞凋亡

肢體在遭受一定時(shí)間重度缺血后再突然恢復(fù)血供,有時(shí)會(huì)發(fā)生更為嚴(yán)重的組織損傷,機(jī)體甚至陷入休克狀態(tài),臨床上稱(chēng)之為止血帶休克(tourniquet shock，TOS),這也是臨床外科多器官功能障礙發(fā)生的常見(jiàn)病因。大量資料表明,腎臟是止血帶休克過(guò)程中最易受累的器官之一,嚴(yán)重時(shí)表現(xiàn)為急性腎功能衰竭(acute renal failure,ARF)[1]。缺血后處理(ischemic postconditioning，I-postC)是一種在組織長(zhǎng)時(shí)間缺血后多次短暫的缺血和恢復(fù)血供交替進(jìn)行的預(yù)處理方法[2],對(duì)止血帶休克中腎臟功能和結(jié)構(gòu)的影響尚不完全明確。本研究應(yīng)用I-postC措施,從多方面觀(guān)察止血帶休克時(shí)腎臟的變化,探討I-postC的器官保護(hù)意義及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠30只,清潔級(jí),體重200-250 g,購(gòu)自河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物合格證號(hào):SCXK京2009-0004。將大鼠隨機(jī)分為3組(每組10只):對(duì)照組(Control組)、止血帶休克組(TOS組)和缺血后處理組(I-postC組)。

1.2 動(dòng)物模型

制作大鼠止血帶休克模型[3],即:在乙醚淺麻醉下,用標(biāo)準(zhǔn)化彈性的橡皮帶結(jié)扎大鼠雙后肢根部使其缺血4 h,然后松解橡皮帶恢復(fù)血供4 h。I-postC組在缺血4 h后,行缺血5 min和恢復(fù)血液灌注5 min,重復(fù)3次的操作,即缺血后處理,然后再持續(xù)恢復(fù)血流灌注4 h。Control組的橡皮帶僅松弛環(huán)繞雙后肢不阻斷血流。

1.3 標(biāo)本檢測(cè)

①全麻下開(kāi)腹經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,離心15 min(3 500 r/min),應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血漿肌酐(creatinine,Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)含量。②摘取一側(cè)腎臟并迅速縱向剖開(kāi),冷生理鹽水沖洗,用濾紙吸附表面水分,扭力天平稱(chēng)取腎組織200 mg制作組織勻漿,離心取上清液,用分光光度法測(cè)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)和髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的變化趨勢(shì)。③橫向切取對(duì)側(cè)腎組織塊約4 mm長(zhǎng),立即投入10%甲醛溶液中固定,石蠟包埋,低溫切片,TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;免疫組化法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的表達(dá)情況。④術(shù)中在腎皮質(zhì)部位迅即切取米粒大小腎組織,投入冷4%戊二醛-磷酸緩沖液,再修成1 mm×1 mm×1 mm的小塊預(yù)固定,轉(zhuǎn)入2.5%戊二醛中固定,經(jīng)丙酮脫水、環(huán)氧樹(shù)脂包埋,制作超薄切片,染色后在透射電鏡下觀(guān)察腎組織超微結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 血漿Cr、BUN和CRP測(cè)定結(jié)果

與Control組比較,TOS組和I-postC組的Cr、BUN和CRP均明顯升高(P<0.01);I-postC組與TOS組比較,三者含量均降低(P<0.01，見(jiàn)表1)。

2.2 腎組織SOD、XOD、MDA、MPO測(cè)定結(jié)果

與Control組比較,TOS組MDA、XOD和MPO均明顯升高(P<0.01);I-postC組與TOS組比較,MDA、XOD和MPO均降低(P<0.01,見(jiàn)表2),SOD均降低,損傷減輕。

組別Cr(U/L)BUN(U/L)CRP(U/L)Control組21.55±3.905.06±1.623.53±0.21TOS組58.93±6.76**17.09±2.06**6.05±0.80**I-postC組27.86±2.31**##12.04±1.41**##4.98±0.68**##

與對(duì)照組比較，**P<0.01;與TOS組比較，##P<0.01

組別SOD(U/gprot)XOD(U/g)MDA(nmol/mg)MPO(U/g) Control組87.64±6.4874.96±4.63 4.98±0.490.39±0.06 TOS組46.86±4.66**111.00±10.05**11.01±1.00**1.04±0.15** I-postC組61.01±7.06**#87.47±5.16*##6.94±0.51**##0.57±0.09*##

與Control組比較,*P<0.05,**P<0.01;與TOS組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.3 腎組織細(xì)胞凋亡情況

激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察,Control組腎組織凋亡細(xì)胞罕見(jiàn)。TOS組可見(jiàn)較多TUNEL陽(yáng)性信號(hào)為黃綠色或黃色熒光,位于胞核,呈小圓形、環(huán)行或顆粒狀。凋亡細(xì)胞主要見(jiàn)于腎小管上皮細(xì)胞和腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,間質(zhì)細(xì)胞凋亡少見(jiàn)(見(jiàn)圖1)。I-postC組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞較IR組明顯減少。

A.Control組 B.TOS組 C.I-postC組圖1 TUNEL染色激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察腎組織細(xì)胞凋亡情況 (×200)Figure 1 Apoptosis in renal tissues under laser confocal microscope by TUNEL staining (×200)

2.4 腎組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況

Bcl-2蛋白和Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要存在于腎小管上皮細(xì)胞和腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi),呈棕黃色顆粒。Control組可見(jiàn)少量腎細(xì)胞胞質(zhì)呈淺棕黃色,即Bcl-2和Bax蛋白弱陽(yáng)性表達(dá)。TOS組及I-postC組陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目更多,且著色加深。與TOS組比較,I-postC組Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng),而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)明顯減少(見(jiàn)圖2)。

2.5 腎組織超微結(jié)構(gòu)改變

透射電鏡下觀(guān)察可見(jiàn)Control組腎組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整。TOS組可見(jiàn)近曲小管上皮細(xì)胞核固縮,線(xiàn)粒體數(shù)量減少,部分線(xiàn)粒體嵴斷裂或模糊,甚至空泡化。腎小球足突細(xì)胞足突排列不規(guī)則,部分突起融合;線(xiàn)粒體腫脹,空泡變性較明顯,線(xiàn)粒體嵴斷裂并減少,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張(見(jiàn)圖3)。在I-postC組,腎組織超微結(jié)構(gòu)的損傷改變較之TOS組有一定程度改善(見(jiàn)圖3)。

A-C.Control組、TOS組、I-postC組Bcl-2表達(dá);D-E.Control組、TOS組、I-postC組Bax表達(dá)圖2 各組大鼠腎組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況 (×200)Figure 2 Expression of Bcl-2，Bax protein in renal tissues (×200)

a:足突融合；b:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；c:線(xiàn)粒體嵴斷裂、空泡化A-C分別為Control 組、TOS 組、I-postC 組的腎小球組織

d:核固縮,有較多空泡;e:線(xiàn)粒體嵴斷裂、空泡化D-F分別為Control 組、TOS 組、I-postC 組的腎小管組織圖3 電鏡下各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué) (Bar=1 μm)Figure 3 Morphology of renal tissue of rats in different groups under electron microscope (Bar=1 μm)

3 討論

在臨床外科實(shí)踐中,止血帶休克可見(jiàn)于松解結(jié)扎時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的止血帶后,由于各種毒素刺激以及有效循環(huán)血量不足導(dǎo)致的以神經(jīng)-體液因子失調(diào)與急性循環(huán)障礙為特征的危重狀態(tài),是創(chuàng)傷性休克的一種[1]。以全身循環(huán)衰竭為基礎(chǔ),急性腎損傷是止血帶休克常見(jiàn)且后果嚴(yán)重的并發(fā)癥。關(guān)于止血帶休克的防治,目前有多種藥物和措施，其中缺血后處理具有可控性好、操作簡(jiǎn)單,無(wú)毒副作用等特點(diǎn)，臨床應(yīng)用前景值得期待。

本實(shí)驗(yàn)中,動(dòng)物雙后肢在缺血期以無(wú)氧代謝為主要產(chǎn)能方式,乳酸、腺苷等酸性代謝產(chǎn)物生成增多,大量炎細(xì)胞活化。在第二個(gè)階段,隨著血流大規(guī)模的重新灌注,各種炎性介質(zhì)(inflammatory mediators)、酸性代謝產(chǎn)物以及氧自由基(oxygen free radicals，OFR)等有毒有害物質(zhì)均勻循環(huán)周身,成為遠(yuǎn)隔器官受損的直接因素[4],腎臟是敏感器官之一。此外,在止血帶休克的全程,機(jī)體均處于應(yīng)激狀態(tài),交感-腎上腺髓質(zhì)及腎素-血管緊張素系統(tǒng)強(qiáng)烈激活,腎血管收縮,加上血流重新分布的調(diào)控作用,腎臟血供明顯不足,也是加重腎損傷的重要的神經(jīng)-體液因素[5]。

SOD是生物體內(nèi)主要的抗氧化酶,短期內(nèi)可因清除OFR被消耗而活性下降。本實(shí)驗(yàn)中缺血后處理組的SOD活性得以保護(hù),可能是因?yàn)榉磸?fù)短暫的血流灌注,形成了局部組織的良性應(yīng)激效應(yīng),抑制了XOD的過(guò)多生成,ATP不至于短時(shí)大量分解,氧自由基的生成受到了抑制,SOD總活性得到了保護(hù)。全身性炎癥反應(yīng)(systemic inflammatory response)也是止血帶休克時(shí)遠(yuǎn)位器官受累的主要機(jī)制[5],組織MPO活性可反映中性粒細(xì)胞的激活、游走和在組織內(nèi)聚集的程度。CRP是一種非特異性炎性標(biāo)志物[6],可在炎癥或損傷的急性期敏感表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中MPO和CRP的變化,驗(yàn)證了止血帶休克時(shí)炎性反應(yīng)在全身的播散,缺血后處理可在一定程度上抑制炎性反應(yīng),從而減輕了腎損傷的程度。

肢體局部長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用止血帶,可經(jīng)多途徑啟動(dòng)全身的細(xì)胞凋亡通路[7]。Bcl-2和Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因,二者相互作用決定了細(xì)胞死亡的閾值[8]。本實(shí)驗(yàn)中,血流再灌注后Bcl-2高度表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞,其抗細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制在于抗氧化,抑制線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素氧化酶(Cyto-C)、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)等促凋亡蛋白[9],抑制半胱天冬酶(caspase)激活,抑制Bax、Bak等細(xì)胞毒作用,維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)[10]。免疫組化結(jié)果提示,I-postC可增加Bcl-2表達(dá)而抑制Bax表達(dá),上調(diào)Bcl-2/Bax 比值,減少細(xì)胞凋亡。在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察腎組織細(xì)胞的凋亡,I-postC組陽(yáng)性信號(hào)較TOS組明顯減少。血Cr和BUN是反映腎功能的常用指標(biāo),實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示I-postC可以降低血Cr和BUN水平,減輕止血帶休克腎損傷的程度。

綜上所述,缺血后處理可保護(hù)大鼠止血帶休克的腎臟,其機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制炎癥反應(yīng)和抗細(xì)胞凋亡有關(guān),有關(guān)更為詳盡的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[1] 門(mén)秀麗,張連元,董淑云，等.牛磺酸在大鼠止血帶休克后肺損傷中的保護(hù)作用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,25(2):144-146.

[2] Yang Xiu-hong，Wang Yin-huan，Wang Jian-jun.Role of angiotensin-converting enzyme (ACE and ACE2) imbalance on tourniquet-induced remote kidney injury in a mouse hind limb ischemia-reperfusion model[J].Peptides，2012，36 (1):60-70.

[3] 張連元，楊林.生理科學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京:人民軍醫(yī)出版社，2001:29.

[4] Men X，Han S，Gao J，etal.Taurine protects against lung damage following limb ischemia reperfusion in the rat by attenuating endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis[J].Acta Orthop，2010，81(2):263-267.

[5] Zambas NA，Karkos CD，Kambaroudis AG，etal.Protective effect of antithrombin III against lung and myocardial injury in lower limb ischemia-reperfusion syndrome [J].Ann Vasc Surg，2012，26(4):566-570.

[6] Shinohara G，Morita K，Nagahori R,etal.Ischemic postconditioning promotes left ventricular functional recovery after cardioplegic arrest in an invivo piglet model of global ischemia reperfusion injury on cardiopulmonary bypass[J].J Thorac Cardiovasc Surg，2011,142 (4):926-932.

[7] Fu X,Li S,Jia G,etal.Protective effect of the nitric oxide pathway in l-citrulline renal ischemia-reperfusion injury in rats[J].Folia Biologica，2013，59 (6):225-232.

[8] 李開(kāi)濟(jì),賀寶玲,盧秋玲，等.缺血后處理減輕大鼠肢體缺血再灌注后肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].天津醫(yī)藥,2016,44(4):453-456.

[9] Zhang Y，Leng YF，Xue X，etal.Effects of penehyclidine hydrochloride in small intestinal damage caused by limb ischemia-reperfusion [J].World J Gastroenterol，2011，17(2):254-259.

[10] Zhao W，Gan X，Su G，etal.The interaction between oxidative stress and mast cell activation plays a role in acute lung injuries induced by intestinal ischemia-reperfusion[J].J Surg Res,2014,187(2):542-552.

Effect of ischemic postconditioning on kidney injury caused by tourniquet shock

ZHAO Lijun1,2,LI Kaiji1,2,WU Jing1,2,MEN Xiuli1,2*

(1DepartmentofPathophysiology，BasicMedicalCollege，NorthChinaUniversityofScienceandTechnology，Tangshan063000,China;2TangshanKeyLaboratoryforPreclinicalandBasicResearchonChronicDiseases;*Correspondingauthor,E-mail:xiulimen@126.com)

ObjectiveTo investigate the effects of ischemic postconditioning(I-postC) on kidney injury caused by tourniquet shock，and explore its possible mechanisms.MethodsThirty SD rats were randomly divided into control group，tourniquet shock group(TOS group) and I-postC group.The tourniquet shock animal models were induced by tourniquet.In I-postC group，ischemic postconditioning was performed based on the treatment in model group.Blood was taken from the abdominal aorta to measure the contents of blood creatinine(Cr)，blood urea nitrogen(BUN) and C-reactive protein(CRP) in plasma.The contents of superoxide dismutase(SOD)，malondialdehyde(MDA)，xanthine oxidase(XOD)，and myeloperoxidase(MPO) in renal tissues were determined.The expression of Bcl-2 protein and Bax protein in renal tissue was detected.The apoptotic cells in renal tissue were determined by terminal-deoxynucleotidyl trans-ferase-mediated d-UTP nick end labeling(TUNEL).The histological ultrastructure changes of renal tissues were observed under electron microscope.Results①Compared with control group，SOD activity in renal tissues reduced in TOS group and I-postC group(P<0.01),while the levels of Cr,BUN and CRP in plasma increased(P<0.01)，and the levels of MDA,XOD,MPO in renal tissues also increased(P<0.01).Compared with control group，Bax protein expression increased obviously in TOS group and I-postC group，and the antiapoptotic gene Bcl-2 expression increased slightly.The number of renal tubular epithelial cells and endothelial cell apoptosis increased in TOS group and I-postC group.Under the transmission electron microscope，there were renal proximal convoluted tubule epithelial cell nucleus pycnosis，intracellular cavitation，increased lysosome and dense particle deposition，and some mitochondria crest fracture or fuzzy.Glomerular podocyte protuberant，irregular，fusion，mitochondrial cristae fracture and reduced free bubble，rough endoplasmic reticulum expansion were also observed.②Compared with TOS group，SOD activity in renal tissues increased in I-postC group(P<0.05 orP<0.01)，while the levels of Cr，BUN and CRP all decreased(P<0.05 orP<0.01),and the number of renal cell apoptosis reduced(P<0.05 orP<0.01).Compared with TOS group，Bcl-2 protein expression increased and Bax was decreased in I-postC group.Under the transmission electron microscope，the structural damage was reduced in renal tubular epithelial cells and glomerulus.ConclusionTourniquet shock can induce renal dysfunction and structural damage，while I-postC can relieve the kidney damage by reducing the oxygen free radicals and inhibiting the inflammation.

tourniquet shock； kidney damage； ischemic postconditioning； apoptosis

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)課題資助項(xiàng)目(20130060)

趙利軍,女,1975-07生，碩士,副教授,E-mail:786411506@qq.com

2016-12-09

R363

A

1007-6611(2017)04-0328-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.006