miR-582在胃癌組織中的表達及其作用機制

劉 棟,王建華*,宋 斌,孫學軍,鄭見寶,劉 斌,劉思達,毛智軍,普彥淞,段降龍,龍延濱

(1陜西省人民醫(yī)院普外二科,西安 710068;2西安交通大學第一附屬醫(yī)院普外科;*通訊作者,E-mail：wangjianhuaman@163.com)

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miR-582在胃癌組織中的表達及其作用機制

劉 棟1,王建華1*,宋 斌1,孫學軍2,鄭見寶2,劉 斌1,劉思達1,毛智軍1,普彥淞1,段降龍1,龍延濱1

(1陜西省人民醫(yī)院普外二科,西安 710068;2西安交通大學第一附屬醫(yī)院普外科;*通訊作者,E-mail：wangjianhuaman@163.com)

目的 研究胃癌和癌旁組織中microRNA-582(miR-582)的表達水平,以及調控miR-582表達后對胃癌細胞SGC-7901功能的影響。 方法 采用實時熒光定量PCR檢測人胃癌和正常胃組織中miR-582的表達水平;將miR-582 inhibitors(miR-582下調表達)通過脂質體轉染至人胃癌SGC-7901細胞中(miR-582 inhibitors組),設未轉染對照組(control組)和miRNA無義序列轉染對照組(NC組)。實時熒光定量PCR檢測轉染組細胞中miR-582的表達變化;MTT方法檢測各組細胞的生長活力;流式細胞術檢測各組的細胞周期和凋亡率;Transwell實驗檢測各組細胞侵襲能力;Western blot檢測各組細胞中Rab7a、CDK1和AKT3蛋白表達。 結果 miR-582在胃癌中的表達量為癌旁組織的(0.34±0.11)倍(P<0.05)。與control組和NC組相比,miR-582 inhibitors組中SGC-7901細胞增殖和侵襲能力上升(P<0.05),細胞周期被促進,細胞凋亡減少(P<0.05),Rab23蛋白表達上調,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結論 miR-582在胃癌組織中低表達,miR-582通過下調Rab23抑制胃癌細胞SGC-7901增殖、侵襲、遷移能力,促進其凋亡。其可以作為胃癌診斷和治療的新靶點。

胃癌; miR-582; Rab23; SGC-7901細胞; 細胞活力; 細胞凋亡; 細胞侵襲

胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一,在我國也是發(fā)病率和死亡率分別位居第2位和第3位的惡性腫瘤[1]。從分子水平上闡釋胃癌的發(fā)生和發(fā)展的具體機制,是為了尋求新的胃癌早期標記物和有效生物治療的靶點。胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及到多種癌基因的激活、抑癌基因的失活等一系列的異常生物學過程[2]。microRNA(miRNA)是一種19-25個核苷酸大小的內源性非編碼的RNA,在基因表達的轉錄后水平發(fā)揮重要作用[3],現(xiàn)在大量研究已證實其參與到腫瘤發(fā)生發(fā)展的很多過程,如增殖、凋亡、侵襲、耐藥等[4]。一般來說,miRNA主要以完全或部分互補配對的方式通過結合到靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)(3′UTR)來發(fā)揮功能[5]。miR-582作為近年來在腫瘤發(fā)展中扮演重要角色的微小RNA成員之一,已經引起了越來越多的關注。很多研究表明miR-582涉及到腫瘤細胞生長及侵襲遷移的多種生物學進程中,如膀胱癌[6]和結直腸癌[7,8]。然而miR-582在胃癌中的功能尚不清楚,本研究檢測miR-582在胃癌組織中的表達及抑制miR-582在胃癌細胞SGC-7901中的表達,研究其在胃癌增殖、凋亡、侵襲轉移中的作用,探討miR-582作為胃癌治療靶點的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;反轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Thermo Scientific公司;Real-Time PCR購自日本TaKaRa公司生產;Real-Time PCR檢測儀器為美國Bio-Rad公司生產的CFX96TMReal-Time PCR Detection System;miR-582、U6引物由廣州銳博生物科技有限公司設計并合成;RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Corning公司;胎牛血清購自法國Biowest公司;LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司;OPTI-MEN購自美國Gibco公司;Annexin Ⅴ-FITC試劑盒購自美國BD公司;MTT購置美國Sigma公司;miR-582及Negative Control(NC)購自上海吉瑪公司生產;Rab23,CDK1,AKT3和GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司;凝膠成像儀購自美國Bio-rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

GES-1、SGC-7901、MGC-803、AGS、BGC-823和MKN28為西安交通大學醫(yī)學院中心實驗室長期保存,采用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞長滿約80%時用0.25%胰蛋白酶消化傳代,取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞用于實驗。收集2016-01～2016-05于陜西省人民醫(yī)院普通外科手術切除的20例原發(fā)性胃癌標本及相應癌旁正常組織標本(距離癌灶邊緣5 cm以上的組織),其中男14例,女6例;年齡39-73歲,平均年齡58.3歲。所有患者術前未經過放、化療,術后經病理確診。新鮮標本離體后迅速置于液氮中保存待用。所有入選患者均簽署知情通知書,并經醫(yī)院倫理委員會同意批準。

1.3 real-time PCR檢測miR-582

用Trizol試劑按照操作說明書對正常胃黏膜細胞系GES-1和5株胃癌細胞行總RNA提取,各取2 μg RNA進行反轉錄成cDNA,行real-time PCR。反應條件:反應條件:95 ℃預變性30 s;然后按95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s進行40個循環(huán)。以每個樣本的U6作為內參,基因相對表達量采用2-ΔΔCt方法進行計算分析。實驗重復3次。

1.4 細胞轉染

將對數(shù)生長期SGC-7901細胞經0.25%胰酶消化,取2×104個接種于6孔板,設實驗組(轉染miR-582 inhibitors)、陰性對照組(轉染negative control)組和空白對照組(untreated cell)。用250 μl OPTI-MEN稀釋LipofectamineTM2000轉染試劑5 μl室溫靜置5 min,再用250 μl OPTI-MEN稀釋miR-582 inhibitors或Negative Control 5 μl,兩者混合室溫靜置20 min, 每孔加入500 μl中的轉染復合液,在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4-6 h,用新鮮的完全培養(yǎng)基(含血清)替換含有轉染復合物的培養(yǎng)基,供后續(xù)實驗使用。實驗重復3次。

1.5 細胞增殖實驗

采用MTT法,將消化后的胃癌細胞SGC-7901按照5×103個/孔接種于96孔板中,隨機分為實驗組、陰性對照組和空白對照組,每組設4個復孔;未接種細胞的孔中加入RPMI 1640培養(yǎng)基作為調零孔,放于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后24,48,72,96 h,每孔加入MTT 20 μl繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h,后用酶標儀檢測其490 nm處吸光值。實驗重復3次。

1.6 細胞周期檢測

取胃癌細胞SGC-7901按照2×105個/孔接種于6孔板中,分為實驗組、陰性對照組和空白對照組,轉染后48 h、24 h,然后再換成含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,用胰酶收集各組細胞,所收集細胞用預冷的PBS洗滌3次,1 000 r/min,5 min,棄上清。加入-20 ℃預冷的75%冰乙醇1 ml固定細胞,置于4 ℃冰箱過夜;檢測前離心(1 000 r/min 5 min),用PBS洗滌2次;加入100 μl PBS并將細胞吹懸;用含0.01%RNase和0.5%碘化丙錠(PI)4 ℃處理細胞20 min。過300目尼龍網。送流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.7 細胞凋亡檢測

取胃癌細胞按照2×105個/孔接種于6孔板中,分為實驗組、陰性對照組和空白對照組,轉染后24 h Annexin Ⅴ-FITC試劑盒進行染色,并在1 h內檢測。實驗重復3次。

1.8 Western blot檢測Rab23的表達水平

取胃癌細胞按照2×105個/孔接種于6孔板中,分為實驗組、陰性對照組和空白對照組,收集轉染72 h細胞,加入細胞裂解液,提取細胞總蛋白,BCA法檢測總蛋白濃度,每組樣本取10 μl進行10%SDS-PAGE垂直電泳,濕轉法將膠中蛋白水平轉移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶在37 ℃搖床上封閉1 h,加入TBST稀釋后的一抗,4 ℃過夜;取出后TBST洗膜3次再加入二抗,孵育1 h,再洗膜3次,添加ECL發(fā)光液反應底物,凝膠成像系統(tǒng)掃描,采用相關圖像分析軟件(Bio-rad Quantity One,CA)進行條帶灰度分析，實驗采用GAPDH作為參照蛋白。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計學分析軟件,兩組間差異分別采用兩樣本t檢驗,多組間差異采用單因素方差分析One-way ANOVA,P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人胃癌組織和胃癌細胞中miR-582的表達

與20例相應的癌旁組織相比,miR-582在胃癌組織中表達明顯降低(P<0.05,見圖1A)。miR-582在胃癌中的表達量為癌旁組織的(0.34±0.11)倍(P<0.05)。與正常胃黏膜細胞GES-1相比,miR-582在人胃癌細胞MGC-803和SGC-7901相對高表達,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01),而MKN28、BGC-823、AGS等胃癌細胞中miR-582的表達量與GES-1細胞相比差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05,見圖1B)。因此，后續(xù)功能學研究選用miR-582表達量較高的胃癌細胞SGC-7901為實驗細胞,采用miR-582 inhibitors下調miR-582在胃癌細胞SGC-7901中的表達。

與GES-1細胞比較，*P<0.05,**P<0.01 A.20例胃癌及癌旁組織 B.正常胃黏膜細胞及胃癌細胞系圖1 組織及細胞系中miR-582的表達Figure 1 The expression of miR-582 in gastric cancer tissue and gastric cancer cells

2.2 轉染后24 h miR-582的表達水平

與陰性對照組比較,人胃癌細胞SGC-7901轉染miR-582 inhibitors后miR-582的表達水平顯著下調,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖2)。陰性對照組和空白對照組間沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.3 miR-582對胃癌細胞增殖的影響

MTT結果顯示,相對陰性對照組,人胃癌細胞SGC-7901轉染miR-582 inhibitors,在轉染后24 h、48 h生長速度均沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05,見圖3),在72 h、96 h生長速度明顯增快,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。陰性對照組和空白對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果表明下調miR-582具有促進胃癌細胞增殖的作用。

與NC組比較,*P<0.05圖2 細胞系SGC-7901轉染miR-582 inhibitors 24 h后miR-582的表達Figure 2 Expression of miR-582 in SGC-7901 cells after transfection with miR-582 inhibitor for 24 h

2.4 miR-582對胃癌細胞周期的影響

流式細胞儀檢測顯示,相比陰性對照組和空白對照組,人胃癌細胞SGC-7901轉染miR-582 inhibitors 48 h,其G0/G1期細胞比例明顯減少(實驗組vs陰性對照組vs空白對照組:45.6%vs52.4%vs53.4%,P<0.05,見圖4),S期細胞比例增多(實驗組vs陰性對照組vs空白對照組:32.9%vs21%vs23.9%,P<0.05),G2/M期細胞比例沒有統(tǒng)計學差異(實驗組vs陰性對照組vs空白對照組:20.6%vs26.7%vs23.3%,P>0.05)。陰性對照組與空白對照組間沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結果表明下調miR-582具有促進胃癌細胞G1/S轉化的作用。

與陰性對照組和空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 SGC-7901細胞生長曲線Figure 3 Cell growth curves of SGC-7901 cells after transfection with miR-582

A.control組 B.NC組 C.inhibitors組圖4 流式細胞儀檢測轉染后48 h細胞周期Figure 4 Cell cycle distribution by flow cytometry at 48 h after transfection

2.5 miR-582對胃癌細胞凋亡的影響

與陰性對照組比較,轉染了miR-582 inhibitors的人胃癌細胞SGC-7901凋亡比例減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖5)。陰性對照組和空白對照組間沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結果表明下調miR-582對胃癌細胞具有促進凋亡的作用。

A.Control組 B.NC組 C.Inhibitors組圖5 細胞儀檢測SGC-7901細胞凋亡Figure 5 Apoptosis of SGC-7901 cells by flow cytometry

2.6 miR-582對胃癌細胞侵襲及遷移的影響

與陰性對照相比,人胃癌細胞SGC-7901轉染miR-582 inhibitors后侵襲能力均顯著增強(見圖6),即每視野穿膜細胞數(shù)均顯著增加(均P<0.05,見圖7)。陰性對照組和空白對照組間沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結果表明下調miR-582對胃癌細胞具有促進侵襲的作用。

A.空白對照組 B.陰性對照組C.Inhibitors組圖6 細胞侵襲實驗(結晶紫染色100倍)Figure6 Cellinvasionassay(crystalvioletstaining×100)

圖7 miR-582對胃癌細胞侵襲的影響(*P<0.05)Figure 7 Effect of miR-582 on cell invasion(*P<0.05)

2.7 miR-582對胃癌相關蛋白Rab23、CDK1及AKT3的影響

相比陰性對照組,轉染了miR-582 inhibitors后的SGC-7901細胞Rab23表達明顯升高(P<0.05),CDK1及AKT3表達沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖8)。陰性對照組和空白對照組間沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

3 討論

越來越多的證據(jù)表明,miRNA在對其靶向的癌基因、抑癌基因或者參與腫瘤增殖、血管生成和凋亡的相關基因的調控方面發(fā)揮著至關重要的作用[9]。此外血清中游離的異常的miRNA的表達為腫瘤的早期診斷和疾病進展的標志物提供新的診療希望[10,11]。根據(jù)先前的研究[12],在胃癌中許多miRNA異常表達,提示在胃癌的發(fā)生發(fā)展中miRNA的表達的差異性是十分普遍的現(xiàn)象,miRNA的異常表達與胃癌細胞增殖活性,藥物敏感性和侵襲遷移能力密切相關。miR-582已被證實在多種人的腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。最近一篇文獻[6]顯示miR-582能抑制膀胱癌細胞生長,在腫瘤形成過程中發(fā)揮關鍵作用。但是關于miR-582在胃癌中的作用至今未被報道。

圖8 Western blot實驗檢測miR-582在SGC-7901細胞中的表達Figure 8 The expression of miR-582 protein in SGC-7901 cells by Western blot

Rab蛋白是小GTPase超家族的成員,其在細胞分泌、內吞、信號傳導和發(fā)育過程中都有重要作用[13],在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中同樣參與了重要過程[14]。Rab23,是Rab家族的成員,與細胞生長、侵襲遷移密切相關。根據(jù)以往的報道,Rab23被認為在胃癌中高表達,且被miR-367所調節(jié)[15]和本研究結果相一致,Rab23可以促進胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移,并抑制凋亡。高分辨率的基于芯片的比較基因組雜交發(fā)現(xiàn)胃癌細胞中Rab23基因的擴增現(xiàn)象,且Rab23可以顯著性提高AGS細胞的侵襲能力[16]。

本研究證實miR-582在胃癌的組織和細胞中顯著性下降,Rab23可能是miR-582在胃癌細胞的靶基因之一,下調miR-582能夠通過增加Rab23的表達而促進胃癌細胞的增殖,減少凋亡,增加侵襲能力。因此,本研究得出miR-582在胃癌的腫瘤形成過程中扮演者抑癌基因的角色。其他腫瘤的相關報道,miR-582在肝癌組織和肝癌細胞系的表達降低,上調miR-582能抑制肝癌細胞的生長,且CDK1和AKT3作為miR-582的直接靶基因調節(jié)肝癌的進程[17]。然而在不同類型的實體腫瘤中miR-582的靶基因也不盡相同。在人前列腺癌細胞和腦膠質瘤細胞中miR-582表達上調且促進細胞增殖,在前列腺細胞中miR-582在剝奪雄激素的條件下靶向下調EFNB2[18],而膠質瘤中靶向下調凋亡相關基因caspase 3和9[19]。在急性肺結核中,miR-582上調并通過靶向FOXO1來抑制單核細胞的凋亡[20]。而本研究發(fā)現(xiàn)miR-582通過Rab23來抑制胃癌細胞的增殖和侵襲,促進其凋亡。

綜上所述,上調miR-582能夠抑制胃癌細胞的增殖活性和侵襲能力,促進胃癌凋亡,提示其在胃癌中可能扮演致抑癌基因的角色,本研究首次提示其可能通過靶基因Rab23發(fā)揮生物學功能,為胃癌的發(fā)生機制及臨床生物治療提供新的靶點。

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Expression of miR-582 in gastric cancer and its mechanism

LIU Dong1,WANG Jianhua1*,SONG Bin1,SUN Xuejun2,ZHENG Jianbao2,LIU Bin1,LIU Sida1,MAO Zhijun1,PU Yansong1,DUAN Xianglong1,LONG Yanbin1

(1SecondDepartmentofGeneralSurgery,ShaanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China;2DepartmentofGeneralSurgery,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:wangjianhuaman@163.com)

ObjectiveTo explore the expression level of microRNA-582(miR-582)in human gastric cancer and normal gastric tissues and the effect of miR-582 expression on the function of gastric cancer cells.MethodsThe expression levels of miR-582 in human gastric cancer and normal gastric tissues were detected by real-time PCR. The miR-582 inhibitors were transfected into human gastric cancer SGC-7901 cells by liposome method. The expression of miR-583 in the cells after transfection was detected by real-time PCR.The experiment was divided into control group,negative control group(NC)and miR-582 inhibitors group.The cell viability was measured by MTT assay.The cell cycle and apoptotic rate of SGC-7901 cells were analyzed by flow cytometry.The invasion ability of SGC-7901 cells was measured by Transwell assay.The expression levels of Rab23,CDK1 and AKT3 were detected by Western blot.ResultsThe expression level of miR-582 in human gastric cancer tissues was significantly lower than that in normal gastric tissues(P<0.05).Compared with control group and NC group,the viability and invasion ability of the SGC-7901 cells were increased in miR-582 inhibitors group(P<0.05),the cell cycle was promoted(P<0.05),and the cell apoptosis was decreased and the protein expression of Rab23 was up-regulated(P<0.05).ConclusionThe expression of miR-582 significantly decreases in gastric cancer tissues.MiR-582 can inhibit gastric cancer SGC-7901 cell proliferation,migration and invasion by down-regulating Rab23 to promote apoptosis.It can be used as a new diagnosis and treatment target for gastric cancer.

gastric cancer; miR-582； Rab23； SGC-7901cells； cell proliferation； cell apoptosis； cell invasion

國家自然科學基金資助項目(81101874)

劉棟,男,1982-09生,博士,主治醫(yī)師,E-mail:liudong522@163.com

2017-01-08

R735.2

A

1007-6611(2017)04-0316-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.004