不同植物精油對體外瘤胃發(fā)酵及甲烷產(chǎn)量影響的比較研究

李艷玲 賈 淼 魯 琳

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實驗室，北京102206)

不同植物精油對體外瘤胃發(fā)酵及甲烷產(chǎn)量影響的比較研究

李艷玲 賈 淼 魯 琳

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實驗室，北京102206)

在底物精粗比為6∶4的條件下，在底物中添加不同劑量[使發(fā)酵液中植物精油的濃度分別為0(對照)、50、100、200和400 mg/L]的丁子香酚、D-檸烯、茴香腦、肉桂醛、百里香酚或香芹酚，通過體外產(chǎn)氣法比較研究不同植物精油對體外瘤胃發(fā)酵和甲烷(CH4)產(chǎn)量的影響。每種植物精油的每個劑量設(shè)3個重復(fù)。體外模擬瘤胃發(fā)酵培養(yǎng)24 h，測定產(chǎn)氣量和氣體中的CH4含量以及發(fā)酵液的pH、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和氨態(tài)氮(NH3-N)濃度。結(jié)果表明：1)除百里香酚外，添加各種植物精油對體外發(fā)酵液pH均無顯著影響(P>0.05)。2)添加丁子香酚、D-檸烯、茴香腦和肉桂醛對體外發(fā)酵液總VFA濃度沒有顯著影響(P>0.05)，但總VFA濃度隨百里香酚和香芹酚濃度的增加呈二次曲線變化(PQ<0.01)。與對照組相比，添加400 mg/L百里香酚和香芹酚顯著降低體外發(fā)酵液總VFA濃度(P<0.01)。D-檸烯、茴香腦、百里香酚和香芹酚的添加改變了各VFA占總VFA的摩爾百分比。與對照組相比，添加50 mg/LD-檸烯和茴香腦使乙酸比例顯著增加(P<0.05)，丙酸比例顯著降低(P<0.05)；而添加400 mg/LD-檸烯和茴香腦則使乙酸比例顯著下降(P<0.05)，丙酸和丁酸比例顯著上升(P<0.05)。百里香酚和香芹酚的添加對乙酸比例沒有產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，與對照組相比，400 mg/L百里香酚和香芹酚使丙酸比例顯著下降(P<0.05)。3)添加茴香腦、百里香酚和香芹酚顯著影響體外發(fā)酵液NH3-N濃度(P<0.05)，與對照組相比，400 mg/L百里香酚和香芹酚顯著降低NH3-N濃度(P<0.05)。4)添加D-檸烯、茴香腦、肉桂醛對體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量沒有顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，各濃度的百里香酚和香芹酚均顯著降低體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量(P<0.05)，且產(chǎn)氣量隨百里香酚和香芹酚濃度的增加呈二次曲線變化(PQ<0.01)。5)添加D-檸烯、茴香腦和肉桂醛對體外發(fā)酵24 h CH4產(chǎn)量沒有顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，50和100 mg/L的丁子香酚顯著增加體外發(fā)酵24 h CH4產(chǎn)量(P<0.05)，而400 mg/L的百里香酚和香芹酚體外發(fā)酵24 h CH4產(chǎn)量分別降低84.7%(P<0.05)和73.9%(P<0.05)。綜合以上試驗結(jié)果可知，不同植物精油對體外瘤胃發(fā)酵和CH4產(chǎn)量的影響結(jié)果不同，且與添加劑量有關(guān)。其中，低劑量的百里香酚和香芹酚促進(jìn)體外瘤胃發(fā)酵，而高劑量的百里香酚和香芹酚抑制體外瘤胃發(fā)酵且顯著降低24 h CH4產(chǎn)量。

植物精油；瘤胃發(fā)酵；甲烷產(chǎn)量

大氣中二氧化碳(CO2)、甲烷(CH4)、一氧化二氮(N2O)等氣體濃度的增加所導(dǎo)致的溫室氣體效應(yīng)目前引起了各國的普遍關(guān)注。大氣中CH4的溫室效應(yīng)是CO2的21倍，目前被認(rèn)為是僅次于CO2的引起全球變暖的重要?dú)怏w。反芻家畜每年排放CH4約8 000萬t，占人為CH4排放總量的33%[1]。此外，CH4的排放也造成動物飼糧能量的嚴(yán)重?fù)p失，一般來說，CH4的能量占飼料總能量的2%～12%[2]，低質(zhì)粗飼料可達(dá)15%。因此，研究降低瘤胃CH4排放的措施已成為目前研究的熱點(diǎn)之一。

雖然現(xiàn)在許多化學(xué)添加劑都可以有效降低反芻動物CH4的產(chǎn)生，但隨著科學(xué)研究的不斷深入，人們逐漸意識到這些化學(xué)添加劑所帶來的負(fù)面效應(yīng)，更傾向于選擇天然的綠色添加劑。植物精油(essential oils)是一類存在于植物中并具有芳香氣味，可隨水蒸氣蒸餾出來但又不溶于水的揮發(fā)性油狀物質(zhì)的總稱，它是從植物的花、葉、莖、根或果實中，通過水蒸氣蒸餾法、擠壓法、冷浸法或溶劑提取法提煉萃取的揮發(fā)性芳香物質(zhì)，是植物提取物中重要的活性成分之一。研究表明，植物精油不僅具有抗菌作用，還可以減少CH4產(chǎn)量[3-4]，降低瘤胃蛋白質(zhì)降解，從而減少氨態(tài)氮(NH3-N)濃度[5-6]，而不同植物精油對瘤胃發(fā)酵和飼料消化的影響則不盡相同[7-9]。本試驗選擇植物精油中常見的3種單萜類化合物香芹酚、百里香酚和D-檸烯以及3種類苯丙烷類化合物肉桂醛、茴香腦和丁子香酚開展試驗，研究其對體外瘤胃發(fā)酵和CH4產(chǎn)量的影響，為植物精油在動物生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試植物精油

選擇6種植物精油開展本試驗，分別是丁子香酚(純度99%，印度尼西亞)、百里香酚(純度99%，印度)、茴香腦(純度99%，廣西)、香芹酚(純度99%，南京)、肉桂醛(純度98%，南京)、D-檸烯(純度94%，巴西)。

1.2 試驗設(shè)計

體外培養(yǎng)試驗的底物參考我國《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)推薦的營養(yǎng)水平，以玉米、豆粕和羊草等作為原料，粉碎過0.5 mm篩，按一定比例配制，底物組成及營養(yǎng)水平見表1，底物精粗比為6∶4。試驗采用單因子試驗設(shè)計，在底物中分別添加不同劑量[使發(fā)酵液中植物精油的濃度分別為0(對照)、50、100、200和400 mg/L]的丁子香酚、D-檸烯、茴香腦、肉桂醛、百里香酚或香芹酚，每種植物精油的每個劑量設(shè)3個重復(fù)。另設(shè)一空白對照組(用于校正產(chǎn)氣量值)，不加底物，只添加發(fā)酵液進(jìn)行體外培養(yǎng)，設(shè)3個重復(fù)。

表1 底物組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the substrate (DM basis) %

1)預(yù)混料為每千克底物提供The premix provided the following per kg of the substrate：Cu 15.0 mg，F(xiàn)e 100.0 mg，Mn 60.0 mg，Zn 100.0 mg，I 0.9 mg，Se 0.3 mg，Co 0.2 mg，VA 16 000 IU，VD34 000 IU，VE 100 IU。

2)營養(yǎng)水平為實測值。干物質(zhì)含量指底物風(fēng)干樣的干物質(zhì)比例，其余營養(yǎng)成分含量指在底物干物質(zhì)基礎(chǔ)上的百分含量。The nutrient levels were measured values. DM content was calculated based on air-dried substrate, other nutrient contents were calculated based on substrate DM.

1.3 體外瘤胃發(fā)酵培養(yǎng)

試驗采用Menke等[10]的體外產(chǎn)氣法，采集4只安裝永久瘤胃瘺管的瘺管羊瘤胃液，與緩沖液以1∶2的比例混合制成人工瘤胃發(fā)酵液。稱取200 mg(干物質(zhì)基礎(chǔ))底物至100 mL培養(yǎng)管(注射器)的頂部，在加入人工瘤胃發(fā)酵液之前，從培養(yǎng)管的前端注入0.5 mL植物精油混合物(植物精油與乙醇不同濃度梯度的混合物)，然后加入30 mL人工瘤胃發(fā)酵液。按照試驗設(shè)計，使得加入發(fā)酵液后不同組的植物精油濃度分別達(dá)到0、50、100、200和400 mg/L發(fā)酵液。另外，空白對照組的培養(yǎng)管中不加底物，直接加入30 mL人工瘤胃發(fā)酵液。各培養(yǎng)管放置在39 ℃的恒溫水浴培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄培養(yǎng)管在不同時間點(diǎn)的刻度值，并于24 h終止培養(yǎng)，測定發(fā)酵液各項發(fā)酵參數(shù)和CH4產(chǎn)量。

試驗進(jìn)行了2個批次的重復(fù)。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 底物營養(yǎng)成分含量的測定

底物營養(yǎng)成分含量的測定設(shè)置3個平行，平行樣品測定結(jié)果的變異系數(shù)控制在5%以內(nèi)。采用105 ℃烘箱烘干5 h后測定干物質(zhì)含量；采用550 ℃馬弗爐燃燒5 h后測定粗灰分含量，然后利用100減去粗灰分含量即為有機(jī)物含量；中性洗滌纖維含量采用Van Soest等[11]的方法測定，且使用了熱穩(wěn)定的α-淀粉酶；酸性洗滌纖維含量根據(jù)AOAC(1991)[12]方法測定；粗蛋白質(zhì)(氮×6.25)含量采用凱氏定氮法[12]測定；鈣含量采用高錳酸鉀滴定法[13]測定；磷含量采用鉬黃比色法[13]測定。

1.4.2 產(chǎn)氣量測定

體外培養(yǎng)過程中分別讀取0、1、2、4、6、8、10、12、16、20和24 h的培養(yǎng)管刻度值，計算不同時間點(diǎn)的體外產(chǎn)氣量，并計算24 h的累積凈產(chǎn)氣量。

1.4.3 體外發(fā)酵參數(shù)測定

將采集氣體后的培養(yǎng)管中的發(fā)酵液排出，立即測定發(fā)酵液pH。

將培養(yǎng)管的發(fā)酵液離心(800×g，15 min)，取1 mL上清液加入1.5 mL離心管(預(yù)先加入200 μL 25%偏磷酸冷凍保存)中，采用氣相色譜儀(Agilent 6890N)，配置HP-INNOwax(30.0 m×320 μm×0.5 μm，Catalog No.:19091N-213)毛細(xì)管色譜柱，以2-乙基丁酸(2EB)作為內(nèi)標(biāo)[色譜條件：火焰離子化檢測器；載氣為氮?dú)?N2)，分流比40∶1，進(jìn)樣量0.4 μL，溫度220 ℃；毛細(xì)管色譜柱恒流模式，流量2.0 mL/min，平均線速度38 cm/s；程序升溫120 ℃(3 min)—10 ℃/min—180 ℃(1 min)；檢測器度250 ℃，氫氣(H2)流量40 mL/min，空氣流量450 mL/min，柱流量+尾吹氣流量45 mL/min]，測定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度，并計算各VFA占總VFA的摩爾百分比。

另取4 mL上清液加入5 mL離心管(預(yù)先加入0.8 mL 1%硫酸冷凍保存)中，采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定NH3-N的濃度[14]。

1.4.4 CH4產(chǎn)量測定

在體外培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)管取出，迅速放入冰水浴中中止發(fā)酵，抽取發(fā)酵管中的氣體，立即用TP-2060T氣相色譜儀檢測氣體中的CH4含量[色譜條件：熱導(dǎo)檢測器(TCD)，TDX-01填充柱，1 mm×3 mm×2 mm，進(jìn)樣口溫度150 ℃，柱溫120 ℃，檢測器溫度150 ℃，載氣為氦氣(He)，流速50 mL/min，進(jìn)樣量0.1 mL]，并根據(jù)產(chǎn)氣量和CH4含量計算CH4產(chǎn)量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.0的一般線性模型(GLM)程序進(jìn)行統(tǒng)計分析，按單因子試驗設(shè)計進(jìn)行方差分析和多重比較，試驗進(jìn)行了2個批次的重復(fù)，每個處理的重復(fù)數(shù)為6，對不同劑量的植物精油對體外瘤胃發(fā)酵和CH4產(chǎn)量的影響采用線性(L)和二次曲線(Q)比較，顯著性水平定為P<0.05，變化趨勢范圍定為0.05≤P≤0.10。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物精油對體外瘤胃發(fā)酵的影響

2.1.1 不同植物精油對體外發(fā)酵液pH的影響

由表2可以看出，添加百里香酚顯著影響體外發(fā)酵液pH(P<0.05)，當(dāng)其在發(fā)酵液中濃度達(dá)到400 mg/L時，體外發(fā)酵液pH較對照組顯著升高(P<0.05)；而其他植物精油的添加對體外發(fā)酵液pH則沒有顯著影響(P>0.05)。

2.1.2 不同植物精油對體外發(fā)酵液VFA比例的影響

由表3可以看出，添加百里香酚和香芹酚顯著影響體外發(fā)酵液的總VFA濃度(P<0.05)，而其他植物精油的添加對體外發(fā)酵液總VFA濃度沒有顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，體外發(fā)酵液中百里香酚和香芹酚濃度為400 mg/L時顯著降低總VFA濃度(P<0.05)，且總VFA濃度隨百里香酚和香芹酚濃度的增加呈二次曲線變化(PQ<0.01)。

由表3可以看出，添加D-檸烯和茴香腦顯著影響體外發(fā)酵液乙酸比例(P<0.05)，而其他植物精油的添加對體外發(fā)酵液乙酸比例沒有顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，體外發(fā)酵液中D-檸烯濃度為50 mg/L時顯著增加乙酸比例(P<0.05)，D-檸烯濃度為200和400 mg/L顯著降低乙酸比例(P<0.05)，且乙酸比例隨D-檸烯濃度的增加呈線性下降(PL<0.01)；體外發(fā)酵液中茴香腦濃度為50 mg/L時顯著增加乙酸比例(P<0.05)，茴香腦濃度為400 mg/L時顯著降低乙酸比例(P<0.05)，且乙酸比例隨茴香腦濃度的增加呈線性下降(PL<0.01)。

表2 不同植物精油對體外發(fā)酵液pH的影響Table 2 Effects of different plant essential oils on fermentation fluid pH in vitro

L、Q分別為組間的線性和二次曲線效應(yīng)。同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

L and Q mean linear and quadratical effects among different groups, respectively. In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

由表3可以看出，除丁子香酚和肉桂醛外，添加D-檸烯、茴香腦、百里香酚和香芹酚顯著影響體外發(fā)酵液丙酸比例(P<0.05)。與對照組相比，體外發(fā)酵液中D-檸烯濃度為100、200和400 mg/L時顯著增加丙酸比例(P<0.05)，且丙酸比例隨D-檸烯濃度的增加呈現(xiàn)二次曲線變化(PQ<0.01)；體外發(fā)酵液中茴香腦濃度為50和400 mg/L時顯著降低丙酸比例(P<0.05)，且丙酸比例隨茴香腦濃度的增加呈二次曲線變化(PQ<0.01)；隨肉桂醛濃度的增加，丙酸比例呈二次曲線變化(PQ=0.04)；體外發(fā)酵液中百里香酚濃度為200和400 mg/L時顯著降低丙酸比例(P<0.05)，且丙酸比例隨百里香酚濃度的增加呈線性下降(PL=0.02)；體外發(fā)酵液中香芹酚濃度為添加400 mg/L時顯著降低丙酸比例(P<0.05)，且丙酸比例隨香芹酚濃度增加呈二次曲線變化(PQ=0.04)。

由表3可以看出，添加D-檸烯、茴香腦和香芹酚顯著影響體外發(fā)酵液乙丙比(P<0.05)，而其他植物精油的添加對體外發(fā)酵液乙丙比沒有顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，體外發(fā)酵液中D-檸烯濃度為100、200、400 mg/L時顯著降低乙丙比(P<0.05)，且乙丙比隨D-檸烯濃度的增加呈二次曲線變化(PQ<0.01)；體外發(fā)酵液中茴香腦濃度為50和400 mg/L時顯著提高乙丙比(P<0.05)，茴香腦濃度為200 mg/L時顯著降低乙丙比(P<0.05)，且乙丙比隨茴香腦濃度的增加呈二次曲線變化(PQ<0.01)；體外發(fā)酵液中香芹酚濃度為400 mg/L時顯著提高乙丙比(P<0.05)，且乙丙比隨香芹酚濃度的增加呈線性上升(PL<0.01)。

由表3可以看出，添加D-檸烯和香芹酚顯著影響體外發(fā)酵液異丁酸比例(P<0.05)，且異丁酸比例隨D-檸烯和香芹酚濃度的增加分別呈二次曲線(PQ<0.01)和線性下降(PL<0.01)；添加D-檸烯、茴香腦與香芹酚顯著影響體外發(fā)酵液丁酸比例(P<0.05)，且丁酸比例隨D-檸烯和茴香腦濃度的增加均呈二次曲線變化(D-檸烯：PQ<0.01；茴香腦：PQ=0.02)，隨香芹酚濃度的增加呈線性增加(PL<0.01)；添加百里香酚和香芹酚顯著影響體外發(fā)酵液異戊酸比例(P<0.05)，且異戊酸比例隨百里香酚和香芹酚濃度的增加均呈二次曲線變化(PQ<0.05)；添加D-檸烯、茴香腦、百里香酚及香芹酚顯著影響體外發(fā)酵液戊酸比例(P<0.05)，且戊酸比例隨D-檸烯、茴香腦、百里香酚濃度的增加均呈二次曲線變化(D-檸烯：PQ=0.01；茴香腦：PQ<0.01；百里香酚：PQ=0.03)，隨香芹酚濃度的增加呈線性下降(PL<0.01)。

表3 不同植物精油對體外發(fā)酵液VFA比例的影響Table 3 Effects of different plant essential oils on fermentation fluid VFA proportions in vitro

續(xù)表3項目Items濃度Concentration/(mg/L)050100200400SEMP值P-value線性L二次Q異戊酸Isovalerate丁子香酚Eugenol1.801.962.021.771.960.0980.380.740.86D-檸烯D-limonene1.801.811.841.941.950.0560.260.040.51茴香腦Anethole1.801.771.871.932.000.0590.110.020.65肉桂醛Cinnamaldehyde1.801.851.892.031.930.0710.290.150.12百里香酚Thymol1.80a2.01a1.87a1.80a1.30b0.086<0.01<0.010.03香芹酚Carvacrol1.80a1.68a1.75a1.89a1.10b0.059<0.01<0.01<0.01戊酸Valerate丁子香酚Eugenol0.931.031.030.930.970.0560.540.710.77D-檸烯D-limonene0.93c0.90c0.87c1.03b1.27a0.030<0.01<0.010.01茴香腦Anethole0.93b0.90b0.97b0.90b1.20a0.033<0.01<0.01<0.01肉桂醛Cinnamaldehyde0.930.930.931.000.970.0300.450.240.34百里香酚Thymol0.93a1.00a0.97a0.97a0.77b0.0390.01<0.010.03香芹酚Carvacrol0.93a0.90a0.90a0.90a0.73b0.0330.01<0.010.17

2.1.3 不同植物精油對體外發(fā)酵液NH3-N濃度的影響

由表4可以看出，添加茴香腦、百里香酚和香芹酚顯著影響體外發(fā)酵液NH3-N濃度(P<0.05)，而其他植物精油的添加對體外發(fā)酵液NH3-N濃度沒有顯著影響(P>0.05)。與體外發(fā)酵液中茴香腦濃度為100 mg/L時相比，茴香腦濃度為400 mg/L時顯著降低體外發(fā)酵液NH3-N濃度(P<0.05)，且NH3-N濃度隨茴香腦濃度的增加呈二次曲線變化

(PQ=0.03)；與對照組相比，體外發(fā)酵液中百里香酚濃度為400 mg/L時顯著降低體外發(fā)酵液NH3-N濃度(P<0.05)，且NH3-N濃度隨百里香酚濃度的增加呈線性下降(PL<0.01)；與對照組相比，體外發(fā)酵液中香芹酚濃度為400 mg/L時顯著降低體外發(fā)酵液NH3-N濃度(P<0.05)，且NH3-N濃度隨香芹酚濃度的增加呈二次曲線變化(PQ<0.01)。

表4 不同植物精油對體外發(fā)酵液NH3-N濃度的影響Table 4 Effects of different plant essential oils on fermentation fluid NH3-N concentration in vitro mmol/L

2.2 不同植物精油對體外瘤胃發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量的影響

由表5可以看出，添加丁子香酚、百里香酚和香芹酚顯著影響體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量(P<0.05)，而其他植物精油的添加對體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量沒有顯著影響(P>0.05)。隨丁子香酚濃度的增加，體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量呈線性下降(PL<0.05)；與對照組相比，添加各濃度的百里香酚和香芹酚均顯著降低24 h產(chǎn)氣量，且隨二者濃度的增加均呈二次曲線變化(PQ<0.01)。

由表5可以看出，添加肉桂醛、百里香酚和香芹酚顯著影響體外發(fā)酵氣體中CH4含量(P<0.05)，而其他植物精油的添加對CH4含量沒有顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，體外發(fā)酵液中添加各濃度肉桂醛均顯著提高體外發(fā)酵氣體中CH4含量(P<0.05)，且CH4含量隨肉桂醛濃度的升高呈二次曲線變化(PQ=0.02)；體外發(fā)酵液中百里香酚濃度為200 mg/L時顯著提高體外發(fā)酵氣體中CH4含量(P<0.05)，而當(dāng)百里香酚濃度達(dá)到400 mg/L時，CH4含量又顯著降低(P<0.05)，總之，隨百里香酚濃度的增加，體外發(fā)酵氣體中CH4含量呈二次曲線變化(PQ<0.01)；與體外發(fā)酵液中香芹酚濃度為100和200 mg/L時相比，香芹酚濃度為400 mg/L時顯著降低體外發(fā)酵氣體中CH4含量(P<0.05)，且隨香芹酚濃度的增加，體外發(fā)酵氣體中CH4含量呈二次曲線變化(PQ<0.01)；隨D-檸烯濃度的增加，體外發(fā)酵氣體中CH4含量呈二次曲線變化(PQ=0.02)。

由表5可以看出，添加丁子香酚、百里香酚和香芹酚顯著影響體外發(fā)酵24 h CH4產(chǎn)量(P<0.05)，而其他植物精油的添加對體外發(fā)酵24 h CH4產(chǎn)量沒有顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，體外發(fā)酵液中丁子香酚濃度為50和100 mg/L時顯著提高體外發(fā)酵24 h CH4產(chǎn)量(P<0.05)；隨D-檸烯濃度的增加，體外發(fā)酵24 h CH4產(chǎn)量呈線性下降(PL=0.02)；隨肉桂醛濃度的增加，體外發(fā)酵24 h CH4產(chǎn)量呈二次曲線變化(PQ=0.04)；與對照組相比，體外發(fā)酵液中百里香酚和香芹酚濃度為400 mg/L時均顯著降低體外發(fā)酵24 h CH4產(chǎn)量(P<0.05)，且24 h CH4產(chǎn)量隨二者濃度的增加均呈二次曲線變化(PQ<0.01)。

表5 不同植物精油對體外瘤胃發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量的影響Table 5 Effects of different plant essential oils on gas and CH4 productions for 24 h rumen fermentation in vitro

3 討 論

3.1 不同植物精油對體外瘤胃發(fā)酵的影響

植物精油具有組成、性質(zhì)和活性多樣化的特點(diǎn)，其中，最重要的活性成分包括2個化學(xué)組分：萜類(單萜類和倍半萜類)和類苯丙烷化合物。這2個組分來源于不同的代謝前體物并通過不同代謝途徑合成，都是不含氮的碳?xì)浠衔?，本試驗所采用?種植物精油中，香芹酚、百里香酚和D-檸烯屬于單萜類化合物，肉桂醛、茴香腦和丁子香酚屬于類苯丙烷類化合物。

植物精油對瘤胃發(fā)酵的影響作用源于其抗微生物的特性。萜類和類苯丙烷類化合物都是通過作用于細(xì)胞膜對細(xì)菌發(fā)揮作用的，至少部分活性是由于環(huán)烴的疏水性，允許它們作用于細(xì)胞膜并在細(xì)菌的雙分子脂膜上累積，占用脂肪酸鏈間的空間。這種互作引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)構(gòu)象的改變，導(dǎo)致它的液化和擴(kuò)張。膜穩(wěn)定性的丟失導(dǎo)致離子穿過細(xì)胞膜泄露，從而使橫跨膜的離子梯度下降。在大多數(shù)情況下，細(xì)菌可以通過使用離子泵來平衡離子梯度，但這個過程中大量的能量被消耗從而導(dǎo)致細(xì)菌生長減緩[15-16]。通常，氧化環(huán)烴的抗菌活性最高，尤其在酚醛結(jié)構(gòu)中，例如百里香酚和香芹酚，其中羥基和移位電子允許通過氫橋作為主要的活性點(diǎn)與水互作，使得它們抗微生物的活性尤其活躍[15-17]。植物精油應(yīng)用于反芻動物，主要通過影響瘤胃微生物的活性，從而影響瘤胃發(fā)酵。

反芻動物的瘤胃液pH可以反映瘤胃內(nèi)環(huán)境狀態(tài)，它受飼糧類型、動物唾液分泌量及有機(jī)酸積累等的共同影響。在本試驗中，僅在添加400 mg/L的百里香酚時顯著提高了體外發(fā)酵液pH，添加其他濃度的各種植物精油對體外發(fā)酵液的pH均沒有顯著影響。由于體外發(fā)酵試驗中緩沖液對維持pH的恒定具有重要作用，本研究中添加400 mg/L的百里香酚引起發(fā)酵液pH降低的原因可能是顯著降低了總VFA濃度。

在飼糧中添加植物精油對總VFA濃度的影響，不同試驗結(jié)果并不一致。在少量的研究中，供給植物精油或其復(fù)合物增加瘤胃液的總VFA濃度，同時可能會改善飼料消化。然而，大多數(shù)研究表明，飼糧中添加植物精油會降低總VFA濃度或者對其沒有顯著影響。例如，Chaves等[18]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中供給肉桂醛(0.2 g/kg干物質(zhì)采食量)會增加瘤胃中總VFA濃度；Castillejos等[19]在連續(xù)培養(yǎng)試驗中維持恒定的pH，添加1.5 mg/L的混合植物精油增加了總VFA的濃度，盡管沒有同時增加有機(jī)物的消化率；而另外2個體內(nèi)試驗采用同樣的混合植物精油飼喂綿羊(110 mg/d)和肉牛(1 g/d)，對總VFA濃度和各種VFA的比例均沒有產(chǎn)生顯著影響[20-21]。植物精油的添加是否引起總VFA濃度的降低可能與其劑量有關(guān)。例如，Busquet等[5]研究了大量植物精油對24 h體外瘤胃發(fā)酵的影響，每個處理添加不同劑量的植物精油，最高的達(dá)到3 000 mg/L培養(yǎng)液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了最高劑量時，各種植物精油對總VFA濃度均沒有產(chǎn)生顯著影響，而在最高劑量時，大多數(shù)處理的總VFA濃度降低了，而且同時飼料消化率也降低了。Castillejos等[6]報道了類似的結(jié)果，在體外培養(yǎng)試驗中添加不同劑量的丁子香酚、愈創(chuàng)木酚、檸檬油精、百里香酚以及香草精，最高濃度達(dá)5 000 mg/L，這些植物精油通常對總VFA濃度都沒有顯著影響，只有在最高劑量時所有這些植物精油都會降低總VFA的濃度。分析其原因可能是高濃度植物精油抑制瘤胃微生物對瘤胃纖維的消化，從而引起總VFA濃度的降低，這可能也是植物精油在高精料飼糧或偏酸性瘤胃環(huán)境比起高粗料飼糧能夠更好調(diào)控瘤胃發(fā)酵的原因[22]。國內(nèi)學(xué)者林波等[23]用體外法研究了添加0、50、200、500和750 mg/L肉桂油、牛至油及其主要成分肉桂醛、香芹酚對瘤胃發(fā)酵的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總VFA濃度隨植物精油濃度的增加而降低，高濃度(500、750 mg/L)時顯著抑制瘤胃發(fā)酵。本試驗所采用的6種植物精油中，添加不同濃度的丁子香酚、D-檸烯、茴香腦和肉桂醛對體外發(fā)酵液總VFA濃度均沒有產(chǎn)生顯著影響；而添加各濃度的百里香酚和香芹酚，只有在最高濃度時顯著降低總VFA濃度，且24 h產(chǎn)氣量也顯著下降，表明百里香酚和香芹酚濃度為400 mg/L時抑制了瘤胃發(fā)酵。本試驗結(jié)果總體表明添加不同種類的植物精油對總VFA濃度的影響結(jié)果不一致，而且與植物精油的添加劑量有關(guān)。

一些研究發(fā)現(xiàn)，某些植物精油及其組分會改變VFA的摩爾比，類似于莫能菌素的作用(比如降低乙酸比例和增加丙酸比例)，這些被視為是添加植物精油的有利影響。如Busquet等[24]使用了2個劑量(31.2和312 mg/L的培養(yǎng)液)的肉桂醛和大蒜油，低劑量的肉桂醛和高劑量的大蒜油都使得乙酸比例下降而丙酸比例上升。陸燕等[25]在體外試驗中添加30、50、100、300和500 mg/L的大蒜油，除添加30 mg/L的大蒜油外，添加其他濃度的大蒜油均顯著降低乙酸比例，增加丙酸和丁酸比例，降低乙丙比。而也有一些研究發(fā)現(xiàn)，添加一些植物精油會對單個VFA的比例產(chǎn)生不理想的改變，比如使丙酸比例下降而沒有影響總VFA的濃度[6]。在本試驗中，對乙酸比例有影響的2種植物精油D-檸烯和茴香腦，都是在低劑量時提高乙酸比例，而在高劑量時降低乙酸比例，相應(yīng)地，在低劑量時降低丙酸和丁酸比例，而在高劑量時提高丙酸和丁酸比例，這種乙酸比例下降丙酸比例上升的結(jié)果可以認(rèn)為是添加植物精油的有利影響；添加高劑量百里香酚和香芹酚顯著降低丙酸比例，同時總VFA濃度也顯著下降，表明體外瘤胃發(fā)酵受到抑制。

瘤胃中NH3-N濃度是反映瘤胃氮代謝的重要指標(biāo)，能間接反映瘤胃微生物分解飼糧中蛋白質(zhì)產(chǎn)生NH3-N和利用NH3-N合成菌體蛋白的平衡情況。瘤胃中大部分氨(總量的50%以上)是由一組稱作“超級產(chǎn)氨菌”(HAP)的細(xì)菌產(chǎn)生的[20]，HAP占瘤胃細(xì)菌的數(shù)量僅有1%左右[26]，但卻具有非常高的脫氨基活性[27]，這可以降低瘤胃中氨的產(chǎn)量，通過增加瘤胃蛋白質(zhì)利用效率來提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。由于植物精油能夠選擇性地抑制瘤胃HAP，可以顯著抑制瘤胃中氨的產(chǎn)生[28]。不同類型的植物精油成分影響瘤胃氮代謝的最佳劑量不同。如Castillejos等[6]研究發(fā)現(xiàn)，愈創(chuàng)木酚的添加量為5 mg/L時可降低氨的濃度，檸檬油精和百里香酚降低氨的濃度的添加量為50 mg/L，而香草精和丁子香酚在添加量為500 mg/L時對瘤胃中氨的濃度也沒有產(chǎn)生顯著影響。本試驗所采用的6種植物精油中，茴香腦、百里香酚和香芹酚影響體外發(fā)酵液NH3-N濃度，且都是在低劑量時沒有顯著影響，而在最高劑量400 mg/L時顯著降低NH3-N濃度，表明高劑量植物精油的添加抑制了瘤胃微生物的活動，可能同時抑制了瘤胃超級產(chǎn)氨菌的活性，這與高劑量時引起總VFA濃度下降，抑制瘤胃發(fā)酵的結(jié)果相一致。

3.2 不同植物精油對體外瘤胃CH4產(chǎn)量的影響

近年來，大量的研究評估了各種添加劑，包括植物精油，在降低CH4產(chǎn)量方面的效果。一些植物精油可以直接抑制產(chǎn)CH4菌或者通過抑制一些有利于CH4生成的微生物的代謝過程而間接降低CH4產(chǎn)量[23]。Cobellis等[29]綜述了大量的體外試驗研究，概括了植物精油在抑制CH4產(chǎn)量和瘤胃發(fā)酵方面的效果。Macheboeuf等[30]報道，采用5 mmol/L牛至油或肉桂油可以降低98%的CH4產(chǎn)量，而采用同樣劑量的蒔蘿精油，僅降低12%的CH4產(chǎn)量，表明不同的植物精油其對CH4產(chǎn)量的影響效果不同。Patra等[31]采用5種不同的植物精油(分別來自丁香、桉樹、大蒜、牛至和薄荷)，研究發(fā)現(xiàn)，使用1 g/L牛至和大蒜植物精油時，CH4產(chǎn)量降低最多，表明植物精油對CH4產(chǎn)量降低的效果與其劑量有關(guān)。大量研究結(jié)果表明，植物精油降低CH4產(chǎn)量的效果伴隨著對瘤胃發(fā)酵的抑制，而這種負(fù)面效果與植物精油的種類和劑量以及所采用的底物有關(guān)[29]。國內(nèi)研究者陸燕等[25]報道了體外試驗條件下添加30、50、100、300和500 mg/L大蒜油可使CH4產(chǎn)量降低65.0%～98.3%，但總VFA的濃度也出現(xiàn)下降。米熱古麗等[32]的體外培養(yǎng)試驗中添加100、150和250 μL/L葡萄籽精油，添加100、150 μL/L時分別使CH4含量下降10.79%和15.30%，添加250 μL/L時反而使CH4含量升高7.17%，表明適宜濃度的葡萄籽精油能降低瘤胃CH4的產(chǎn)生，但各添加濃度均顯著降低總VFA濃度。林波等[23]報道，體外添加不同濃度的牛至油和肉桂油，瘤胃CH4產(chǎn)量隨添加濃度的增加而降低，當(dāng)添加50 mg/L的牛至油和肉桂油可分別降低13.3%和21.2%的CH4產(chǎn)量，而對總VFA濃度的影響較小，說明該濃度的植物精油發(fā)揮了理想的瘤胃調(diào)控作用。在本試驗所采用的6種植物精油中，添加不同劑量的百里香酚和香芹酚，只有在最高劑量400 mg/L時顯著降低CH4產(chǎn)量，使CH4產(chǎn)量分別降低84.7%和73.9%，且總VFA濃度和24 h產(chǎn)氣量也顯著下降，表明CH4產(chǎn)量降低的同時瘤胃發(fā)酵也受到了抑制。這與前人研究的植物精油對CH4產(chǎn)量降低的效果與其劑量有關(guān)的結(jié)論相一致。植物精油降低CH4產(chǎn)量的機(jī)制之一是抑制瘤胃原蟲的活性，進(jìn)而抑制與原蟲共生的甲烷菌的活性[30]。另外，本試驗中添加的其他幾種植物精油D-檸烯、茴香腦和肉桂醛對體外發(fā)酵24 h CH4產(chǎn)量沒有產(chǎn)生顯著影響，但添加50和100 mg/L的丁子香酚與對照組相比增加了CH4產(chǎn)量，可能是由于該劑量下的丁子香酚促進(jìn)了瘤胃發(fā)酵及瘤胃微生物的活性。本試驗的結(jié)果也表明不同的植物精油對CH4產(chǎn)量的影響效果不同。

目前，關(guān)于植物精油體內(nèi)試驗研究的結(jié)果還比較少，在大多數(shù)情況下，由于植物精油的劑量和種類不同，體內(nèi)試驗的結(jié)果存在矛盾。由于植物精油的化學(xué)組成、飼糧類型和飼養(yǎng)方式的不同，很難確定植物精油的劑量需求，以達(dá)到瘤胃中有效的植物精油濃度[33]。Wang等[34]飼喂肉羊一種來自牛至的植物精油混合物(0.25 g/d) 15 d，結(jié)果表明CH4產(chǎn)量降低，而Tomkins等[35]飼喂肉牛一種商業(yè)混合植物精油(1和2 g/d)40 d，結(jié)果表明CH4產(chǎn)量沒有下降。未來的研究需要進(jìn)一步系統(tǒng)地評價植物精油在體內(nèi)試驗中的效果，包括使用劑量以及不同植物精油間的組合，以便能更好地應(yīng)用于生產(chǎn)。

由于目前大多數(shù)試驗研究的結(jié)果表明，植物精油在降低CH4產(chǎn)量的同時抑制了瘤胃發(fā)酵，影響了飼料消化，所以很少有養(yǎng)殖者對使用植物精油來降低CH4產(chǎn)量感興趣。因此，未來主要的挑戰(zhàn)仍然是如何找到能夠減少CH4產(chǎn)量且不降低飼料消化或瘤胃發(fā)酵的植物精油。

4 結(jié) 論

不同植物精油對體外瘤胃發(fā)酵和CH4產(chǎn)量的影響結(jié)果不同，且與添加劑量有關(guān)。在本試驗中，低劑量的百里香酚和香芹酚在數(shù)值上提高體外發(fā)酵液總VFA濃度，而高劑量(400 mg/L)的百里香酚和香芹酚顯著降低體外發(fā)酵液總VFA、NH3-N濃度及24 h產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量。

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Author, LI Yanling, associate professor, E-mail: yanl_li@163.com

(責(zé)任編輯 菅景穎)

A Comparative Study: Effects of Different Plant Essential Oils on Rumen Fermentation and Methane ProductioninVitro

LI Yanling JIA Miao LU Lin

(BeijingKeyLaboratoryofDairyCowNutrition,CollegeofAnimalScienceandTechnology,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China)

In this experiment, the cultivation substrate was consisted of concentrate to forage ratio with 60∶40, and adding different doses [0 (control), 50, 100, 100 and 200 mg/L fermentation liquid concentration, respectively] of plant essential oils (EOs) including eugenol,D-limonene, anethole, cinnamaldehyde, thyme and carvacrol, to study the effects of EOs on rumen fermentation and methane (CH4) productioninvitrobyinvitrogas production technique. Each dose of each EOs had 3 replicates. The gas production, CH4content in gas, and pH, volatile fatty acid (VFA) and ammonia nitrogen (NH3-N) concentrations in fermentation fluid after 24 h simulating rumen fermentation cultivation were measured. The results showed as follows: 1) adding different EOs had no significant effect on pH of fermentation fluidinvitro(P>0.05) except for thyme. 2) Adding eugenol,D-limonene, anethole and cinnamaldehyde had no significant effect on total VFA concentration in fermentation fluidinvitro(P> 0.05), but the total VFA concentration had a quadratic curve change with thyme or carvacrol concentrations increasing (PQ<0.01). Compared with control group, adding 400 mg/L thyme and carvacrol significantly decreased total VFA concentration (P<0.01). AddingD-limonene, anethole, thyme and carvacrol changed the molar ratio of individual VFA in total VFA. Compared with control group, adding 50 mg/LD-limonene and anethole significantly increased acetate ratio (P<0.05), and significantly decreased propionate ratio (P<0.05), however, adding 400 mg/LD-limonene and anethole significantly decreased acetate ratio (P<0.05), and significantly increased propionate and butyrate ratios (P<0.05). Adding thyme and carvacrol had no effect on acetate ratio (P>0.05), but adding 400 mg/L thyme and carvacrol significantly decreased propionate ratio compared with control group (P<0.05). 3) Adding anethole, thyme and carvacrol significant affected NH3-N concentration in fermentation liquidinvitro(P<0.05), and adding 400 mg/L thyme phenol and carvacrol significantly decreased NH3-N concentration compared with control group (P<0.05). 4) AddingD-limonene, anethole and cinnamaldehyde had no effect on 24 h fermentationinvitrogas production (P>0.05). Compared with control group, adding thyme and carvacrol with different concentrations all significantly decreased 24 h fermentationinvitrogas production (P<0.01), and showed a quadratic curve change with thyme or carvacrol concentration increasing (PQ<0.01). 5) AddingD-limonene, anethole and cinnamaldehyde had no effect on 24 h fermentationinvitroCH4production (P>0.05). Compared with control group, adding 50 and 100 mg/L eugenol significantly increased 24 h fermentationinvitroCH4production (P<0.05), and adding 400 mg/L thyme and carvacrol decreased methane production with 84.7% (P<0.05) and 73.9% (P<0.05), respectively. The above results indicate that different EOs had different effects on rumen fermentation and methane productioninvitro, which relates to the dose of EOs. In this experiment, the low dose of thyme and carvacrol can promote rumen fermentation, and the high dose of them inhibite rumen fermentation and significantly decrease methane production.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(7)：2448-2459]

plant essential oils; rumen fermentation; methane production

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.07.029

2016-12-19

國家自然科學(xué)基金項目(31302000)；北京市教育委員會科技計劃面上項目(KM201510020006)

李艷玲(1973—)，女，寧夏平羅人，副教授，博士后，研究方向為反芻動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail: yanl_li@163.com

S816

A

1006-267X(2017)07-2448-12