激光誘導(dǎo)游離色氨酸對(duì)血紅蛋白反應(yīng)動(dòng)力學(xué)影響及機(jī)理

曹洪玉 史 飛 唐 乾 鄭學(xué)仿＊,1,,3

激光誘導(dǎo)游離色氨酸對(duì)血紅蛋白反應(yīng)動(dòng)力學(xué)影響及機(jī)理

曹洪玉＊,1,3史 飛2唐 乾1,3鄭學(xué)仿＊,1,2,3

(1大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116622)
(2大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，大連 116622)
(3大連大學(xué)，遼寧省生物有機(jī)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116622)

血紅蛋白活性中心鐵卟啉具有環(huán)狀共軛結(jié)構(gòu)，類似于葉綠素，可以吸收特定波長光，光會(huì)誘導(dǎo)鐵卟啉發(fā)生氧化還原反應(yīng)。研究中發(fā)現(xiàn)，紫外區(qū)波長光照射血紅蛋白的氧化還原反應(yīng)情況優(yōu)于鐵卟啉特征吸收波長(406 nm)光照射情況。無游離色氨酸(Trp)時(shí)，266 nm激光激發(fā)后高鐵血紅蛋白(metHb)、脫氧血紅蛋白(deoxyHb)、氧合血紅蛋白(HbO2)和碳氧血紅蛋白(HbCO)均被激發(fā)至各自相應(yīng)的激發(fā)態(tài)，其Soret帶譜峰衰減至基態(tài)的時(shí)間大致相同；加入游離Trp后，激發(fā)態(tài)Trp會(huì)轉(zhuǎn)移能量到鐵卟啉，在直接和間接光能量雙重作用疊加下，激發(fā)態(tài)鐵卟啉衰減時(shí)間發(fā)生變化。metHb、deoxyHb和HbCO衰減時(shí)間明顯延長，但對(duì)HbO2影響相對(duì)較小。根據(jù)瞬態(tài)吸收光譜、動(dòng)力學(xué)曲線和紫外-可見吸收光譜綜合分析可知，在加入游離Trp前后，4種形態(tài)血紅蛋白在被入射光激發(fā)后，鐵卟啉均反應(yīng)至具有(或近似具有)一空位的鐵六配位平面卟啉結(jié)構(gòu)狀態(tài)。

血紅蛋白；鐵卟啉；激光誘導(dǎo)；色氨酸；能量轉(zhuǎn)移

0 引 言

在哺乳動(dòng)物的生命活動(dòng)過程中，金屬蛋白中的鐵卟啉蛋白有著非常重要的輸氧、儲(chǔ)氧、電子傳遞、生物催化及生物傳感等生物功能[1-2]，如肌紅蛋白(Mb)可從細(xì)胞外圍運(yùn)輸氧氣到線粒體末端[3-4]；Cyt c則是生物體中電子傳遞鏈的重要組成部分，在生物體內(nèi)進(jìn)行可逆的電子傳遞反應(yīng)[5]。血紅素蛋白中的鐵卟啉活性中心是一個(gè)環(huán)狀共軛結(jié)構(gòu)，類似于葉綠素，能夠吸收特定波長的光，光可誘導(dǎo)鐵卟啉活性中心的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而會(huì)影響血紅素蛋白生物功能的表達(dá)，因此近年來光誘導(dǎo)血紅素蛋白的研究也開始受到關(guān)注[6-15]。血紅蛋白(Hb)是血紅素蛋白的一種，它是紅細(xì)胞內(nèi)非常重要的呼吸蛋白，它的相對(duì)分子量約為64 500，分子內(nèi)有4條多肽鏈，每個(gè)多肽鏈含有一個(gè)光電活性的血紅素鐵輔基[16]。近年來研究者多關(guān)注血紅素蛋白中心鐵卟啉新功能并期望仿生利用于電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)、生物傳感技術(shù)以及電催化作用等領(lǐng)域[17]。

肉類腐敗是從表層血紅蛋白和肌紅蛋白的鐵卟啉氧化變色開始的，如果對(duì)表層進(jìn)行合適的紫外可見光光照，保持表層血紅素蛋白氧結(jié)合狀態(tài)，可以保護(hù)肉類質(zhì)量，因此這一研究有重要應(yīng)用前景[14-15]。Sakai等[7]發(fā)現(xiàn)在氬氣環(huán)境下，355 nm激光能夠誘導(dǎo)還原高鐵血紅蛋白(metHb)，添加的游離色氨酸(Trp)能夠促進(jìn)高鐵血紅蛋白的光致還原，并認(rèn)為電子可能是從卟啉環(huán)轉(zhuǎn)移至鐵。Bartocci等[18]認(rèn)為鐵卟啉軸向配體可以作為電子供體，其提供電子還原卟啉環(huán)中心鐵，還有研究者[19-20]認(rèn)為氨基酸殘基特別是色氨酸殘基是光誘導(dǎo)還原反應(yīng)的電子供體。氨基酸是生物體內(nèi)必需的內(nèi)源性小分子物質(zhì)，經(jīng)常作為小分子配體參與到生命活動(dòng)中。芳香族氨基酸(如色氨酸、酪氨酸等)吸收特定波長紫外光后，可發(fā)出波長能量低于吸收波長的光[21-23]，發(fā)出的光可被鐵卟啉吸收。我們?cè)谘芯客瑸檠t素蛋白的肌紅蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)用不同波長的氙燈光照射加入游離氨基酸的高鐵肌紅蛋白溶液時(shí)，游離氨基酸濃度的增加有利于metHb的光照還原，且在不同波長光照下對(duì)metHb的光照還原有不同的影響，含-OH或-SH基團(tuán)(Tyr、Cys)的氨基酸對(duì)光照還原metHb有較好的促進(jìn)作用，并推斷出光還原的整個(gè)過程可能是分子間電子轉(zhuǎn)移和清除自由基的過程[24]。光誘導(dǎo)蛋白內(nèi)鐵卟啉氧化還原及其引起的蛋白結(jié)構(gòu)變化方面的研究雖已有初步相關(guān)報(bào)道[7,12-15,24-25]，但至今光誘導(dǎo)還原反應(yīng)的機(jī)理尚不清楚，主要難點(diǎn)是在反應(yīng)過程中電子的傳遞和瞬態(tài)蛋白結(jié)構(gòu)的變化。因此，我們采用激光閃光光解、瞬態(tài)吸收光譜測定反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過程和中間體，結(jié)合紫外、熒光等穩(wěn)態(tài)方法進(jìn)一步研究游離Trp對(duì)光誘導(dǎo)血紅蛋白氧化還原反應(yīng)的影響及機(jī)制，對(duì)于探究光誘導(dǎo)反應(yīng)中的能量轉(zhuǎn)移和電子傳遞過程具有一定的啟示作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：V-560紫外-可見分光光度計(jì)(日本Jasco公司)，pHS-3TC酸度計(jì)(上海雷磁分析儀器廠)，LP-980激光閃光光解儀(Edinburgh Instruments，UK)，F(xiàn)A-1004電子天平(上海精科天平廠)。

試劑：人血紅蛋白 (購于美國Sigma公司)，其UV-Vis吸收光譜特征表明樣品絕大多數(shù)為高鐵血紅蛋白，使用時(shí)未經(jīng)進(jìn)一步的提純，將其溶解在pH=7.4濃度為 0.01 mol·L-1的磷酸鹽(Na2HPO4-NaH2PO4)緩沖溶液(phosphate buffer,PB)中，配成濃度為1×10-4mol·L-1的儲(chǔ)備蛋白溶液(避光4℃保存并盡快用于實(shí)驗(yàn))。實(shí)驗(yàn)中所用的蛋白溶液濃度為2.5μmol·L-1。在0.01 mol·L-1的PB中配制成濃度為0.01 mol·L-1的Trp溶液。實(shí)驗(yàn)中所用氧化劑為0.1 mol·L-1的鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])溶液，實(shí)驗(yàn)中所用還原劑為1 mol·L-1的連二亞硫酸鈉 (Na2S2O4)溶液，實(shí)驗(yàn)中用水為去離子水。分別取一定量的高鐵血紅蛋白溶液，向其中加入適量的連二亞硫酸鈉溶液將其還原為脫氧血紅蛋白(deoxyHb)；向定量脫氧血紅蛋白溶液通入高純O215 min(每秒鐘2～3個(gè)氣泡)，得氧合血紅蛋白(HbO2)；向定量脫氧血紅蛋白溶液通入高純CO 15 min(每秒鐘2～3個(gè)氣泡)，可得碳氧血紅蛋白(HbCO)[26]。

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 紫外-可見吸收光譜

移取2 mL已處理好的蛋白溶液于1 cm石英比色皿中進(jìn)行測定，測定條件為：狹縫寬度2 nm，掃描波長范圍220～700 nm，掃描速率200 nm·min-1，響應(yīng)時(shí)間中等。

1.2.2 動(dòng)力學(xué)瞬態(tài)吸收光譜

移取2 mL已處理好的蛋白溶液于1 cm石英比色皿中進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)中用266 nm的脈沖Nd∶YAG激光照射樣品；單個(gè)脈沖持續(xù)10 ns，且單個(gè)脈沖的能量1～10 mJ，氙燈作為檢測光源。激發(fā)光(266 nm)由Nd∶YAG調(diào)Q激光器產(chǎn)生的三次和四次諧波提供，探測光由150 W氙燈提供，兩束光垂直會(huì)聚在1 cm的石英比色皿上。瞬態(tài)物種信號(hào)經(jīng)陣列Czerny-Turner單色儀分光，由Hamamatsu R928光電倍增管探測。再經(jīng)由與激光閃光光解儀配套的L900軟件轉(zhuǎn)化為橫坐標(biāo)為波長，縱坐標(biāo)為ΔOD的瞬態(tài)吸收光譜，其中ΔOD的表達(dá)式如下：

其中I0是激發(fā)態(tài)產(chǎn)生前透過樣品的光強(qiáng)度，IT是激發(fā)態(tài)生成時(shí)或產(chǎn)生后短時(shí)間內(nèi)透過樣品的光強(qiáng)度。

1.2.3 動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析

動(dòng)力學(xué)瞬態(tài)吸收光譜波長范圍為250～700 nm，每5 nm采集1次，每次采集時(shí)間為1μs，為了闡明體系激發(fā)態(tài)弛豫過程的機(jī)制，對(duì)動(dòng)力學(xué)瞬態(tài)吸收的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理與分析，通過 Levenberg-Marquardt方程對(duì)所測樣品瞬態(tài)吸收強(qiáng)度的衰減曲線進(jìn)行了多指數(shù)擬合，方程表達(dá)式如下：

式中R(t)為樣品衰減過程的數(shù)學(xué)表達(dá)式，A為額外的背景常量，指前因子Bi為曲線在時(shí)間零點(diǎn)的振幅，τi為組分的特征壽命參數(shù)。最終擬合指數(shù)方程由較小的χ2值和τ值標(biāo)準(zhǔn)差SD確定。

2 結(jié)果與討論

2.1 血紅蛋白的化學(xué)氧化與還原

血紅蛋白鐵卟啉活性中心的鐵可以呈現(xiàn)出不同的價(jià)態(tài)，我們?cè)谑褂们皩?duì)樣品蛋白進(jìn)行了紫外-可見光譜的表征，發(fā)現(xiàn)其有明顯的高鐵血紅蛋白特征吸收峰，分別在406、537、577和630 nm處。向血紅蛋白樣品中加入不同濃度的鐵氰化鉀溶液，待其反應(yīng)一段時(shí)間后，進(jìn)行紫外-可見光譜表征，發(fā)現(xiàn)隨著鐵氰化鉀濃度的增加，蛋白406 nm處吸收峰逐漸升高，537和577 nm處吸收峰有所降低 (圖1A)，這表明樣品中大多數(shù)為高鐵血紅蛋白，還有少部分的為非高鐵血紅蛋白。

向血紅蛋白樣品中加入不同濃度的連二亞硫酸鈉溶液，待其反應(yīng)一段時(shí)間后，進(jìn)行紫外-可見光譜表征，發(fā)現(xiàn)隨著連二亞硫酸鈉濃度的增加，蛋白406 nm處吸收峰先逐漸降低后紅移到430 nm，537和577 nm處吸收峰先逐漸升高后又消失，在555 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，630 nm處吸收峰逐漸降低。430和555 nm處吸收峰都是脫氧血紅蛋白的特征吸收峰(圖1B)，這表明弱還原劑連二亞硫酸鈉能夠?qū)⒀t蛋白活性中心的三價(jià)鐵還原為二價(jià)鐵。

圖1 氧化劑與還原劑對(duì)Hb紫外-可見吸收光譜的影響Fig.1 Effects of oxidizing agent and reducing agent on UV-Vis absorbance spectra of Hb

2.2 血紅蛋白的光照還原

圖2 不同定波長氙燈光照metHb 2 h后對(duì)metHb紫外-可見吸收光譜的影響Fig.2 Effects on UV-Vis absorbance spectra of metHb irradiated by xenon lamp for 2 h atdifferent fixed wavelengths

本實(shí)驗(yàn)首先研究不同波長氙燈光對(duì)血紅蛋白光照還原情況的影響，實(shí)驗(yàn)選用氙燈分出的不同定波長(260、280、320、355和406 nm)的光照射血紅蛋白樣品2 h，測定其紫外-可見吸收光譜(圖2)。經(jīng)不同波長光照后，蛋白的Soret帶406 nm處特征吸收峰強(qiáng)度均降低并有輕微的紅移，在Q帶537、577和630 nm處的特征吸收峰有明顯的降低，其中260 nm波長光有最明顯的還原效果，406 nm波長光的還原作用次之。406 nm處為鐵卟啉Soret帶的特征吸收峰，因此406 nm波長光易被吸收從而使蛋白被還原；260、280、320和355 nm等波長光也可還原metHb，且260 nm光照還原效果比406 nm光照還原效果明顯，這可能與蛋白中含有的芳香族氨基酸(如Trp，Tyr)有關(guān)，還可能與誘導(dǎo)光能量的增強(qiáng)有關(guān)，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們?cè)O(shè)想加入游離Trp研究其對(duì)蛋白光照反應(yīng)的影響。另外對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，未光照的添加游離 Trp前后的血紅蛋白紫外吸收譜圖相同，說明游離Trp和血紅蛋白是沒有相互作用的。

2.3 266 nm激光照射后血紅蛋白瞬態(tài)吸收光譜

2.3.1 血紅蛋白瞬態(tài)吸收光譜

為了進(jìn)一步探究血紅蛋白的光還原過程，以及血紅蛋白鐵卟啉活性中心結(jié)構(gòu)變化的情況，用266 nm激光照射metHb、deoxyHb、HbO2和HbCO溶液，得到不同時(shí)刻的瞬態(tài)吸收光譜(圖3)。從圖3中可以看出，在266 nm激光激發(fā)后，metHb在405 nm附近有吸收峰，deoxyHb在 430 nm附近有吸收峰；HbO2在415 nm附近有吸收峰；HbCO在420 nm附近有吸收峰。405 nm附近吸收峰為三價(jià)鐵血紅素的特征吸收峰，430 nm附近吸收峰為二價(jià)鐵血紅素的特征吸收峰，415 nm附近吸收峰為二價(jià)鐵氧合態(tài)的特征吸收峰，420 nm附近吸收峰為二價(jià)鐵與CO配位的特征吸收峰，各波長處的瞬態(tài)吸收值隨時(shí)間延長吸收峰強(qiáng)度先增大后降低，metHb在598 ns時(shí)吸收峰強(qiáng)度為最大，且總體吸收峰強(qiáng)度變化幅度比其他3種形態(tài)蛋白大，deoxyHb、HbO2和HbCO分別在598、596和592 ns時(shí)吸收峰強(qiáng)度為最大。

圖3 血紅蛋白不同時(shí)間的266 nm激光閃光解瞬態(tài)吸收光譜Fig.3 Transient absorption spectra recorded at different time after 266 nm laser photolysis of Hb

圖4 加入Trp(2μL)對(duì)血紅蛋白激光閃光解瞬態(tài)吸收光譜的影響Fig.4 Effects of Trp(2μL)on the transient absorption spectra of Hb by laser photolysis

2.3.2 游離Trp對(duì)血紅蛋白瞬態(tài)吸收光譜影響

血紅蛋白本身有Trp，但因包埋在其他氨基酸中，受光影響較小，本實(shí)驗(yàn)向蛋白溶液中添加游離的Trp，由于我們的設(shè)備無法發(fā)射260 nm波長激光，因而采用也可以被Trp吸收的266 nm脈沖激光以激發(fā)含Trp的蛋白溶液體系，進(jìn)一步探究游離Trp對(duì)光誘導(dǎo)血紅蛋白還原過程的影響。

與未添加游離Trp血紅蛋白的瞬態(tài)吸收光譜相比，游離Trp對(duì)激光誘導(dǎo)血紅蛋白反應(yīng)的瞬態(tài)吸收光譜有明顯影響(圖4)。metHb在405 nm附近吸收峰的強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，deoxyHb在430 nm附近吸收峰的強(qiáng)度也明顯增強(qiáng)，HbO2在415 nm附近吸收峰的強(qiáng)度亦明顯增強(qiáng)，而HbCO在420 nm附近吸收峰的強(qiáng)度變化較??；并且加入的游離Trp也影響了蛋白吸收峰最大強(qiáng)度的出現(xiàn)時(shí)間，metHb由598 ns提前至594 ns；deoxyHb提前2 ns，HbO2時(shí)間不變，HbCO延后4 ns，此3種形態(tài)蛋白均在596 ns時(shí)吸收峰強(qiáng)度為最大。加入游離Trp后各蛋白Soret帶吸收峰位置并未發(fā)生明顯變化，但瞬時(shí)最高吸收峰強(qiáng)度明顯增加，表明激發(fā)態(tài)Trp與蛋白質(zhì)之間進(jìn)行了能量轉(zhuǎn)移，使得卟啉環(huán)吸收峰強(qiáng)度增加。

2.4 激光誘導(dǎo)血紅蛋白反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過程

為了研究激光激發(fā)后血紅蛋白的弛豫過程及結(jié)構(gòu)變化情況，我們得到了血紅蛋白的動(dòng)力學(xué)衰減曲線(圖5)，并通過Levenberg-Marquardt方程對(duì)動(dòng)力學(xué)衰減曲線進(jìn)行多指數(shù)擬合，根據(jù)χ2值和τ值標(biāo)準(zhǔn)差SD，最終選擇單指數(shù)函數(shù)，各曲線擬合參數(shù)如表1所示。根據(jù)擬合數(shù)據(jù)可知，未添加游離Trp時(shí)metHb、deoxyHb、HbO2和HbCO激發(fā)態(tài)衰減時(shí)間是不同的，metHb激發(fā)態(tài)的存在時(shí)間較短，其他3種形態(tài)蛋白光激發(fā)后中間體壽命相對(duì)較長，表明各蛋白激發(fā)中間態(tài)是不同的，其衰減時(shí)間也相應(yīng)是不同的；而加入游離Trp后，除HbO2衰減時(shí)間基本不變外，metHb、deoxyHb和HbCO激發(fā)態(tài)衰減時(shí)間明顯延長，其中HbCO激發(fā)態(tài)衰減時(shí)間延長50.3%至21.34 ns。動(dòng)力學(xué)擬合數(shù)據(jù)表明游離Trp能夠影響蛋白的鐵卟啉光照反應(yīng)，加入的游離Trp改變了激光誘導(dǎo)metHb、deoxyHb和HbCO衰減過程中的能量轉(zhuǎn)移過程，反應(yīng)機(jī)理在2.7節(jié)詳細(xì)闡述。

圖5 血紅蛋白的光激發(fā)后Soret帶峰瞬態(tài)衰減曲線Fig.5 Soret band decay curves of Hb after photo-excitation

表1 血紅蛋白光激發(fā)后Soret帶峰動(dòng)力學(xué)曲線多指數(shù)擬合參數(shù)Table 1 Multi exponential fitting parameters of the Soret band kinetic curve of Hb after photo-excitation

2.5 激光誘導(dǎo)后血紅蛋白的紫外-可見光譜

我們同時(shí)測得了激光激發(fā)前后血紅蛋白的紫外-可見吸收光譜，以確定其結(jié)構(gòu)變化情況。由圖6A可知沒有添加Trp的metHb經(jīng)266 nm激光照射后Soret帶特征吸收峰由406 nm紅移到411 nm，且吸光強(qiáng)度明顯下降，Q帶538 nm處特征峰吸收沒有明顯變化，576和630 nm處特征吸收峰幾乎消失；加入Trp的metHb經(jīng)激光照射后Soret帶特征吸收峰略有下降，Q帶538、576和630 nm處特征吸收峰明顯增強(qiáng)，與無Trp時(shí)的反應(yīng)趨勢不同。這表明加入的Trp對(duì)光誘導(dǎo)metHb結(jié)構(gòu)變化的影響較大，光誘導(dǎo)metHb的反應(yīng)中應(yīng)該存在著能量的轉(zhuǎn)移，促使蛋白中鐵卟啉受光激發(fā)后向平面型激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)變。

由紫外-可見光譜圖 6B可知未添加 Trp的deoxyHb經(jīng)266 nm激光照射后Soret帶特征吸收峰由430 nm藍(lán)移到419 nm，且吸光強(qiáng)度明顯下降，Q帶555 nm處特征吸收峰消失，在540和570 nm處形成2個(gè)新的吸收峰；加入Trp的deoxyHb經(jīng)激光照射后，Soret帶特征吸收峰由430 nm藍(lán)移到415 nm，且吸光強(qiáng)度明顯下降，Q帶555 nm處特征吸收峰消失，在540和576 nm處形成2個(gè)新的吸收峰。添加Trp前后蛋白譜峰的位置和強(qiáng)度都發(fā)生了一定的變化，這表明加入的Trp對(duì)deoxyHb的光誘導(dǎo)反應(yīng)影響較大。

HbO2的Soret帶特征吸收峰在415 nm，Q帶特征吸收峰在540和575 nm，且吸收較強(qiáng)。未添加Trp和加入Trp的HbO2經(jīng)266 nm激光照射后，Soret帶特征吸收峰都紅移到了420 nm，且吸光強(qiáng)度有所減弱；Q帶540和575 nm處吸收峰都有明顯下降，620 nm附近都有新的吸收峰出現(xiàn)，且峰強(qiáng)度和峰位置基本相同 (圖6C)。這表明游離Trp對(duì)HbO2的光照反應(yīng)影響較小，其動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)也表明游離Trp對(duì)HbO2的光照反應(yīng)影響不大。

圖6 血紅蛋白經(jīng)266 nm激光閃光解后的紫外可見光譜Fig.6 UV-Vis absorbance spectra of Hb after 266 nm laser photolysis

未添加Trp和加入Trp的HbCO經(jīng)266 nm激光照射后，Soret帶419 nm處特征吸收峰都沒有發(fā)生峰的位移，Q帶538和568 nm處吸收也都沒有發(fā)生峰的位移；但加入Trp后，Soret帶和Q帶吸收強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(圖6D)。這表明HbCO的結(jié)構(gòu)相對(duì)較為穩(wěn)定，在266 nm激光激發(fā)后，蛋白總體結(jié)構(gòu)幾乎不發(fā)生變化。這是由于與CO配位的鐵卟啉存在反饋π鍵，使蛋白鐵卟啉對(duì)Trp轉(zhuǎn)移能量吸收能力較為平穩(wěn)，因此加入Trp后其激發(fā)態(tài)衰減時(shí)間有較大延長。

2.6 光誘導(dǎo)血紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

蛋白質(zhì)的遠(yuǎn)紫外CD光譜能夠反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息[27]，如圖7所示，在192 nm附近有1個(gè)正的譜帶，在208和222 nm附近有2個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶，這是蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征CD光譜。在血紅蛋白中未加入和加入游離Trp時(shí)，光照前后蛋白192 nm附近的正吸收峰與208和 222 nm附近的2個(gè)負(fù)吸收峰的強(qiáng)度有所減弱，但峰形和肩峰的位置并未發(fā)生明顯變化。這說明光照能夠引起蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，但并未引起蛋白的變性。

圖7 血紅蛋白經(jīng)260 nm光照射前后的圓二色(CD)光譜圖Fig.7 Circular dichroism(CD)spectra of Hb before and after 260 nm light irradiation

2.7 激光誘導(dǎo)血紅蛋白結(jié)構(gòu)變化的機(jī)制

綜合以上圖譜及數(shù)據(jù)討論可知，盡管蛋白的初始形態(tài)大不相同，蛋白在光照后其鐵卟啉光譜均發(fā)生了明顯變化。光照未加入Trp的血紅蛋白，發(fā)現(xiàn)除metHb的576 nm處吸收峰以肩峰形式出現(xiàn)外，其余各峰變化趨于相同；而光照加入Trp的血紅蛋白，發(fā)現(xiàn)蛋白Soret帶和Q帶的譜峰，無論峰型、峰位置，還是峰的強(qiáng)度，其變化均趨于同一方向(圖6)，且加入Trp對(duì)光照反應(yīng)影響明顯，趨向性更強(qiáng)。光激發(fā)蛋白后，其Q帶540和575 nm附近的吸收峰出現(xiàn)或增強(qiáng)表明：4種形態(tài)血紅蛋白經(jīng)光照反應(yīng)后，均趨向于形成一個(gè)異于上述4種蛋白鐵卟啉的結(jié)構(gòu)。據(jù)此我們推測了激光誘導(dǎo) metHb、deoxyHb、HbO2和HbCO結(jié)構(gòu)變化的可能機(jī)理(圖8)。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(2.4節(jié))和紫外-可見光譜(2.5節(jié))表明游離Trp在蛋白的光照反應(yīng)中有明顯的能量轉(zhuǎn)移過程，從而改變衰減時(shí)間。

未加Trp的metHb經(jīng)激光照射，部分卟啉環(huán)π電子被激發(fā)到激發(fā)態(tài)，電子較為活躍，轉(zhuǎn)移到三價(jià)鐵中未滿的d軌道上，紫外光譜表明形成二價(jià)鐵卟啉；加入Trp，光照首先激發(fā)Trp，Trp激發(fā)態(tài)弛豫后返回基態(tài)時(shí)所釋放的能量更適合被鐵卟啉吸收，發(fā)生分子間能量轉(zhuǎn)移，鐵卟啉達(dá)到激發(fā)態(tài)，同樣π電子被激發(fā)躍遷到激發(fā)態(tài)，再轉(zhuǎn)移到三價(jià)鐵中未滿的d軌道上，形成二價(jià)鐵卟啉，促進(jìn)鐵卟啉內(nèi)部的電子傳遞過程，紫外-可見吸收譜圖和瞬態(tài)吸收譜圖表明鐵卟啉形成具有一空位的六配位平面結(jié)構(gòu)，動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和反應(yīng)時(shí)間(表1)也證實(shí)如上反應(yīng)過程，如圖8A所示。

圖8 光誘導(dǎo)血紅蛋白反應(yīng)機(jī)理Fig.8 Photo-induced reaction mechanism of different forms of Hb

deoxyHb卟啉環(huán)中的亞鐵具有五配位結(jié)構(gòu)，鐵與卟啉的4個(gè)N不在同一平面上，光照激發(fā)卟啉后，卟啉形成激發(fā)態(tài)平面型結(jié)構(gòu)，再經(jīng)弛豫返回基態(tài)，形成具有一空位的六配位平面結(jié)構(gòu) (圖8B)。HbO2的第六配位被O2所占據(jù)，光照后蛋白鐵卟啉反應(yīng)至激發(fā)態(tài)，F(xiàn)e-O的配位鍵增長，配位能力減弱，O2呈離去(或半離去)狀態(tài)，鐵卟啉轉(zhuǎn)化為近似具有一空位的六配位平面結(jié)構(gòu)(圖8C)。HbCO的第六配位被CO所占據(jù)，由于Fe與C之間存在反饋π鍵，致使二者配位結(jié)合力較強(qiáng)，CO不易離去，但光照鐵卟啉至激發(fā)態(tài)后，使Fe-C鍵增長，CO呈半離去狀態(tài)，紫外-可見吸收譜圖和瞬態(tài)吸收譜圖表明鐵卟啉轉(zhuǎn)化為近似具有一空位的六配位平面結(jié)構(gòu) (圖8D)。游離Trp存在時(shí)，均因激發(fā)態(tài)的Trp會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移過程，進(jìn)而促使各種狀態(tài)蛋白的鐵卟啉吸收與其相應(yīng)的能量，使各種狀態(tài)蛋白光照反應(yīng)至鐵卟啉具有(或近似具有)一空位的六配位平面結(jié)構(gòu)狀態(tài)(圖8)。

3 結(jié) 論

通過用紫外-可見光譜法研究在光照條件下高鐵血紅蛋白的光譜性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在260、280、320、355和406 nm紫外光照射下，都會(huì)促使高鐵血紅蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且260 nm紫外光較易激發(fā)鐵卟啉，進(jìn)而發(fā)生光照還原反應(yīng)，而鐵卟啉Soret帶最大吸收波長光被吸收后較難激發(fā)鐵卟啉。運(yùn)用266 nm激光閃光光解光譜法研究不同形態(tài)的血紅蛋白(metHb、deoxyHb、HbO2和HbCO)的動(dòng)力學(xué)過程，發(fā)現(xiàn)在未添加游離Trp時(shí)，metHb、deoxyHb、HbO2和HbCO的衰減時(shí)間都大致相同；而加入游離Trp后，除HbO2衰減時(shí)間基本不變外，metHb、deoxyHb和HbCO的衰減時(shí)間均有不同程度延長。這表明加入的游離Trp會(huì)影響metHb、deoxyHb和HbCO激發(fā)態(tài)衰減過程中的能量轉(zhuǎn)移過程。游離Trp存在時(shí)，均因激發(fā)態(tài)的Trp會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移過程，進(jìn)而促使各種狀態(tài)蛋白的鐵卟啉吸收與其相應(yīng)的能量，使各種狀態(tài)蛋白光照反應(yīng)至鐵卟啉具有(或近似具有)一空位的六配位平面結(jié)構(gòu)狀態(tài)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果將有助于深入了解光誘導(dǎo)血紅蛋白反應(yīng)的能量轉(zhuǎn)移和電子傳遞過程，為該類蛋白光照反應(yīng)的實(shí)際應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Effect and Mechanism of Laser-Induced Hemoglobin Reaction Kinetics with Free Tryptophan

CAO Hong-Yu＊,1,3SHI Fei2TANG Qian1,3ZHENG Xue-Fang＊,1,2,3
(1College of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian,Liaoning 116622,China)
(2College of Environmental and Chemical Engineering,Dalian University,Dalian,Liaoning 116622,China)
(3Liaoning Key Laboratory of Bio-Organic Chemistry,Dalian University,Dalian,Liaoning 116622,China)

With a circular conjugate structure and similar to that of chlorophyll,the iron porphyrin of hemoprotein can absorb specific wavelengths of light to induce its redox reaction and configuration changes.In our research,we found that the photo-induced redox reaction of hemoprotein with ultraviolet lights has more obvious effects than the reaction irradiated by the iron porphyrin characteristic absorption wavelength (406 nm). Irradiated by 266 nm laser,methemoglobin(metHb),deoxyhemoglobin(deoxyHb),oxygenated hemoglobin(HbO2) and carboxyhemoglobin (HbCO)with the absence of free tryptophan(Trp)can be inspired to their corresponding excited states and the decay processes to the ground state indicated with their corresponding Soret band peak have almost the same time.After adding free Trp,the energy of excited state Trp transfers to iron porphyrin. With dual energy superposition of direct light irradiation and indirect energy transfer,the decay time of excited state iron porphyrin varied in different hemoproteins.The significant prolongations of decay time are observed on the photo-irradiated metHb,deoxyHb and HbCO,while slight influences are detected on the photo-irradiated deoxyHb and HbO2.According to transient absorption,kinetics curve and UV-Vis absorption spectra,the iron-porphyrin of four forms of hemoglobin could be excited by incident light or by the energy transfer from excited state Trp,then decay to the state ofplane porphyrin structure and six-coordinated Fe with one ligand vacancy.

hemoglobin;iron porphyrin;laser-induced;tryptophan;energy transfer

O614.81；O644.12

A

1001-4861(2017)08-1339-10

10.11862/CJIC.2017.159

2017-02-23。收修改稿日期：2017-05-11。

國家自然科學(xué)基金(No.21571025，21601025，21271036，21601024)和遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.L2013471)資助。

＊通信聯(lián)系人。E-mail：dlxfzheng@126.com，caohongyu@foxmail.com，Tel：+86-411-87403720