血皮槭葉綠體DNA非編碼區(qū)差異序列篩選和分析

葉學(xué)敏，于雪丹，付其迪，鄭勇奇，張川紅

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

血皮槭葉綠體DNA非編碼區(qū)差異序列篩選和分析

葉學(xué)敏，于雪丹，付其迪，鄭勇奇，張川紅*

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

[目的]篩選出高變異率的葉綠體DNA序列，以進(jìn)行血皮槭天然群體的譜系地理學(xué)研究。[方法]以血皮槭16個(gè)天然群體為試材，對(duì)葉綠體基因組20個(gè)非編碼區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序研究，并利用篩選出的高變異率cpDNA序列初步分析了其遺傳變異。[結(jié)果]序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示血皮槭cpDNA種內(nèi)變異非常低，9個(gè)cpDNA序列檢測(cè)到不同程度的變異位點(diǎn)，其中只有4個(gè)序列psbJ-petA、ndhF-rpl32、trnD-trnT和trnH-psbA表現(xiàn)出較高的變異水平。[結(jié)論]篩選出的4個(gè)高變異率cpDNA序列，可以在分子水平上研究血皮槭種內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育、遺傳變異和種群歷史動(dòng)態(tài)，為進(jìn)一步研究瀕危種血皮槭的分子譜系地理學(xué)奠定基礎(chǔ)。

血皮槭；cpDNA；序列篩選；序列比對(duì)；系統(tǒng)發(fā)育分析

血皮槭(Acergriseum(Franch.)Pax)為中國(guó)特有種，具有極高的觀賞價(jià)值。1993年，血皮槭獲得英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)園藝獎(jiǎng)，成為國(guó)內(nèi)外著名的景觀樹(shù)種[1]。除觀賞價(jià)值外，血皮槭的許多價(jià)值尚待開(kāi)發(fā)和利用，例如木材堅(jiān)硬，可作為良好的建筑材料；木材紋理精美可制作樂(lè)器及工藝品。但是，這個(gè)極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的樹(shù)種正瀕臨滅絕，急需保護(hù)。血皮槭的分布范圍僅限于我國(guó)中部地區(qū)海拔800～2 000 m的山地，分布區(qū)嚴(yán)重片段化，天然群體數(shù)量非常小，表現(xiàn)出瀕危物種的典型特征[2]。根據(jù)世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)的標(biāo)準(zhǔn)，血皮槭在《中國(guó)物種紅色目錄》中已被列為瀕危樹(shù)種(EN A2c)[3]。

植物葉綠體基因組DNA(Chloroplast DNA，cpDNA)的研究為珍稀瀕危物種制定合理有效的保護(hù)策略提供了重要的理論依據(jù)。通常，葉綠體非編碼區(qū)的堿基替換率較高，為中性突變，不受自然選擇等其它因素的影響，是研究植物譜系地理、分子系統(tǒng)發(fā)育和群體遺傳學(xué)重要的工具，近年來(lái)被成功用于種間或種內(nèi)變異水平的研究[4]。例如，利用cpDNA序列對(duì)瀕危植物南方紅豆杉(Taxuswallichianavar.mairei(Lemée& H.Léveillé) L. K. Fu & Nan Li)，日本紅楓(AcerpycnanthumK. Koch)，癭椒樹(shù)(TapisciasinensisOliv.)，青錢(qián)柳(Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinsk.)，珙桐(DavidiainvolucrataBaill.)，金錢(qián)槭(DipteroniasinensisOliv.)等植物[5-10]開(kāi)展了譜系地理學(xué)研究。近年來(lái)，對(duì)于瀕危植物血皮槭的研究主要集中在SSR引物開(kāi)發(fā)、天然群體遺傳變異和譜系地理學(xué)初步研究等方面[11-13]，其中王佳慧利用rps16序列對(duì)血皮槭譜系地理學(xué)進(jìn)行初步探討取得進(jìn)展。但是一個(gè)序列并不能全面反映血皮槭的譜系地理結(jié)構(gòu)，本研究利用20個(gè)通用cpDNA序列，以血皮槭16個(gè)天然群體的16株個(gè)體為材料，篩選適宜于血皮槭種內(nèi)研究的高變異率cpDNA非編碼區(qū)序列，為進(jìn)一步研究瀕危種血皮槭的分子譜系地理學(xué)奠定基礎(chǔ)，對(duì)于制定血皮槭合理的保護(hù)策略具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來(lái)源于本課題組野外調(diào)查的16個(gè)血皮槭天然群體(表1)，每個(gè)群體隨機(jī)選取1株個(gè)體為試材。新鮮葉片經(jīng)硅膠充分干燥后，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 血皮槭各采樣群體的地理位置

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測(cè) 取干燥葉片30 mg，采用DNA提取試劑盒DP305 (Tiangen Biotech Co., China) 提取血皮槭葉片總DNA。采用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，G-box凝膠成像儀(Chemi XX6，Syngene)拍照檢測(cè)DNA的質(zhì)量，酶標(biāo)儀(Spectra Max i3)檢測(cè)DNA純度和濃度。DNA濃度稀釋到50 ng·μL-1，放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cpDNA通用引物篩選及測(cè)序 從參考文獻(xiàn)[14-17]挑選了20對(duì)適合種內(nèi)水平的cpDNA非編碼通用引物，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成(表2)。為對(duì)20對(duì)通用引物進(jìn)行初步篩選，隨機(jī)挑選2個(gè)樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL，包括模板DNA 50 ng、2×Buffer Master Mix 10 μL、10 μmol·L-1F-primer 0.4 μL、10 μmol·L-1R-primer 0.4 μL、其余ddH2O補(bǔ)齊。NdhF-rpl32，psbJ-petA序列的PCR程序：80℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，50℃退火1 min，0.3℃·s-1升溫到65℃，65℃延伸4 min，30個(gè)循環(huán)；65℃延伸5 min。其他序列的PCR程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，篩選出條帶清晰單一的引物；然后利用初篩合格的引物對(duì)所有樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇條帶清晰明亮、無(wú)非特異性擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司純化，然后采用ABI 3730xl DNA analyzer進(jìn)行測(cè)序。

表2 20對(duì)cpDNA通用引物序列

1.2.3 cpDNA序列編輯和分析 根據(jù)原始峰圖，使用Contig Express軟件(Informax Inc.，North Bethesda，MD，USA)對(duì)cpDNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行峰圖檢查及拼接，手工校對(duì)。然后，采用BioEdit v7.0.5.2軟件[18]分別對(duì)cpDNA序列進(jìn)行比對(duì)和手工調(diào)整；利用MEGAv5.0[19]計(jì)算信息位點(diǎn)。cpDNA序列的變異位點(diǎn)，都是潛在的信息位點(diǎn)(PICs)，包括核苷酸的替換、倒置、插入和缺失[11]。利用MEGA v5.0進(jìn)行聚類(lèi)分析，采用鄰接法(Neighbor joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展檢驗(yàn)(bootstrap)通過(guò)1 000次重復(fù)獲得。為獲得血皮槭潛在信息位點(diǎn)(PICs)和變異率(V)，引入公式：

PICs=I+S+R

(1)

(2)

式(1)、(2)中：I表示序列插入和缺失數(shù)，S表示序列核苷酸替換數(shù)，R表示序列倒置數(shù)，A表示序列比對(duì)后長(zhǎng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取與PCR擴(kuò)增

酶標(biāo)儀檢測(cè)提取的DNA純度和濃度都較高。OD260/OD280為1.606～1.992，DNA濃度為42.8～154.2 ng·μL-1，符合PCR反應(yīng)所需的要求。電泳結(jié)果顯示DNA條帶清晰，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2 序列分析

所有20對(duì)cpDNA通用引物都能擴(kuò)增出目的片段。其中9個(gè)cpDNA序列(表2編號(hào)1-9)檢測(cè)到不同程度的變異位點(diǎn)(表3)，序列(表2編號(hào)5-9)只檢測(cè)到一個(gè)位點(diǎn)的變異(數(shù)據(jù)省略)。其余11個(gè)cpDNA序列(表2編號(hào)10-20)未能檢測(cè)到變異位點(diǎn)。

表3 4個(gè)cpDNA序列在血皮槭群體中的變異位點(diǎn)分布

注：“△”：TAACTCCGAAATACAAAAAAGAGAGAGAGATAGAAAGGTATCACAAA；“◇”： TTCTTTCACT；“☆”：TAATAAA；“-”：缺失

Note： “△”：TAACTCCGAAATACAAAAAAGAGAGAGAGATAGAAAGGTATCACAAA；“◇”： TTCTTTCACT；“☆”：TAATAAA；“-”：deletion.

圖1 血皮槭cpDNA非編碼區(qū)序列的PICs值和變異率Fig.1 PICs values and sequence variation of Non-coding cpDNA sequences in A. griseum

對(duì)9個(gè)序列的PICs值和變異率(圖1)進(jìn)行比較，篩選出4個(gè)變異豐富的cpDNA序列，按照PICs值由高到低依次為ndhF-rpl32，psbJ-petA，trnH-psbA，trnD-trnT，變異率由高到低依次為trnH-psbA，ndhF-rpl32，psbJ-petA，trnD-trnT。

血皮槭cpDNA非編碼區(qū)序列的種內(nèi)變異(PICs值)與其他木本植物相比很低(見(jiàn)表4)。rps12-rpl20和rpl32-trnL序列在血皮槭中表現(xiàn)無(wú)變異，而在傘花木[20](Eurycorymbuscavaleriei(Le′vl.) Rehd. et Hand.-Mazz.)群體和珙桐[9](D.involucrata)群體檢測(cè)到不同程度的變異；trnH-psbA，atpB-rbcL，ndhF-rpl32和psbJ-petA序列在血皮槭中的PICs值與其他木本植物如色木槭[21](AcermonoMaxim.)、紅楓[22](AcerrubrumL.)、美洲糖槭[23](AcersaccharumMarsh.)和觀光木[24](Micheliaodora)相比很低。

表4 各樹(shù)種不同cpDNA序列PICs值比較

注：括號(hào)內(nèi)的數(shù)字為核苷酸替換數(shù)

Note：The number in parentheses represents the number of nucleotide substitutions

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

基于4個(gè)序列ndhF-rpl32，psbJ-petA，trnH-psbA和trnD-trnT的比對(duì)結(jié)果，構(gòu)建了血皮槭群體的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。此系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，16個(gè)群體明顯分為兩大支，SNJ、WX、ZJJ、TPZ、TS、TBS、YL、WF、CHK、HPS、SX、XS群體聚為一支，LC、YC、HS、NX群體聚為一支。SNJ、WX群體和NX群體分別從兩大支單獨(dú)分離出來(lái)。位于大巴山脈東部的重慶巫溪(WX)和湖北神農(nóng)架(SNJ)同聚為一支，位于秦嶺山脈東部的河南欒川(LC)和內(nèi)鄉(xiāng)(NX)、山西陽(yáng)城(YC)和陜西華山(HS)群體聚為一支。

3 討論

圖2 血皮槭基于4個(gè)cpDNA片段的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(群體的代碼見(jiàn)表1)Fig.2 NJ phylogenetic tree based on 4 cpDNA seqences of A. griseum(population codes are shown in Table 1)

與其他一些木本植物相比，血皮槭種內(nèi)變異率較低。血皮槭的種內(nèi)變異率較低的原因可能與只選用了較少的16個(gè)樣品用于cpDNA序列篩選有關(guān)，在植物的譜系地理學(xué)研究中，天然群體的數(shù)量非常重要，樣本數(shù)量越多越能全面反映其遺傳變異情況；也可能與血皮槭及天然群體分布范圍窄且呈片段化分布的特點(diǎn)有關(guān)，一般來(lái)說(shuō)，廣域分布的物種比狹域分布的物種擁有更豐富的遺傳變異。例如廣域分布的槭屬植物如色木槭和糖槭的cpDNA序列變異率比狹域分布的日本紅楓和血皮槭高很多。

通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，16個(gè)群體明顯分為兩大支，而且兩個(gè)分支內(nèi)群體間地理距離較近，推測(cè)這兩個(gè)分支的群體經(jīng)歷了長(zhǎng)期的地理隔離，與其它群體之間缺乏有效的基因流。ZJJ、TPZ、TS、TBS、YL、WF、CHK、HPS、SX和XS群體位于秦嶺山脈、大巴山脈和武陵山脈，此區(qū)域位于華中地區(qū)的中心，獨(dú)特的地形和復(fù)雜的氣候是眾多動(dòng)植物的避難所，為物種的分化和地理隔離提供先決條件。此外，葉綠體基因流是通過(guò)種子進(jìn)行母系傳播，基于血皮槭翅果種子傳播距離有限、空種率高和種子難以萌發(fā)等特性，加之惡劣生境的影響，限制了種子的傳播，阻斷了基因流，從而使血皮槭在區(qū)域內(nèi)分化和地理隔離成為可能。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)20個(gè)血皮槭葉綠體DNA非編碼區(qū)差異序列進(jìn)行篩選，共篩選出4個(gè)多態(tài)性較好的序列(psbJ-petA、ndhF-rpl32、trnD-trnT和trnH-psbA)。利用篩選得到的4個(gè)cpDNA序列對(duì)血皮槭16個(gè)群體進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示16個(gè)群體應(yīng)分為兩大類(lèi)。本研究篩選獲得的4個(gè)cpDNA序列在血皮槭種群內(nèi)擁有相對(duì)豐富的變異，是研究種內(nèi)變異良好的分子標(biāo)記，可以進(jìn)一步用于血皮槭系統(tǒng)發(fā)育、遺傳變異和譜系地理學(xué)研究。

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(責(zé)任編輯：張 研)

Differential Analysis of Non-coding Chloroplast DNA Sequences inAcergriseum

YEXue-min,YUXue-dan,FUQi-di,ZHENGYong-qi,ZHANGChuan-hong

(Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry; Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, Beijing 100091, China)

[Objective]By screen highly variable cpDNA sequences to study the phylogeography ofAcergriseum. [Method] Twenty non-coding cpDNA sequences were sequenced. The genetic variation of sixteen natural populations inA.griseumwas preliminarily analyzed with the selected highly variable sequences. [Result] Sequences alignment and phylogenetic analysis showed that the intraspecific variation of cpDNA inA.griseumwas very low. Different variation were detected in some loci of nine cpDNA sequences and a relative high level of variation displayed in four sequencespsbJ-petA,ndhF-rpl32,trnD-trnT andtrnH-psbA. [Conclusion] The four selected highly variable cpDNA sequences could be used to study the phylogeny and genetic variation and clarify the history of population dynamics ofA.griseum. These sequences will lay a foundation for future phylogeographic study inA.griseum.

Acergriseum; cpDNA; sequences screening; sequences alignment; phylogenetic analysis

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.04.020

2016-11-03

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金(CAFYBB2016MA001)。

葉學(xué)敏(1991—)，男，在讀碩士，主要從事植物譜系地理研究。E-mail:330584119@qq.com。

* 通訊作者：張川紅(1970—)，女，博士，副研究員，主要從事林木種質(zhì)資源研究。E-mail: zhangch@caf.ac.cn。

S718.46

A

1001-1498(2017)04-0674-05