基于SSR標(biāo)記的父本分析研究油橄欖品種間的親和性

王楠楠，李金花*，王長海，蘇光燦，付永平

(1.林木遺傳育種國家重點實驗室，國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2.涼山州中澤新技術(shù)開發(fā)有限公司，四川 西昌 615000)

基于SSR標(biāo)記的父本分析研究油橄欖品種間的親和性

王楠楠1，李金花1*，王長海1，蘇光燦2，付永平2

(1.林木遺傳育種國家重點實驗室，國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2.涼山州中澤新技術(shù)開發(fā)有限公司，四川 西昌 615000)

[目的]利用SSR標(biāo)記對油橄欖品種自由授粉的子代進(jìn)行父本分析，研究品種間的親和性，確定品種適宜的授粉樹，為油橄欖建園品種配置提供依據(jù)。[方法]以四川涼山州油橄欖園‘豆果’、‘鄂植8號’和‘九峰4號’3個品種的自由授粉子代為材料，利用12個SSR標(biāo)記進(jìn)行父本分析。[結(jié)果]每個SSR位點的等位基因數(shù)為5～12個，平均9.08個，其中，DCA11和GAPU103A等位基因數(shù)(12個)最多。試驗群體中的平均觀測雜合度為0.732，平均期望雜合度為0.709，平均多態(tài)性信息量為0.675。12個SSR標(biāo)記在95%的置信區(qū)間檢測出父本的子代163個，占子代群體總數(shù)的79.9 %，其中，‘豆果’子代44個，‘鄂植8號’47個，‘九峰4號’72個。在36個候選父本中只檢測出20個子代，平均繁殖貢獻(xiàn)率為5 %，其中，大于5%的品種為：‘克羅萊卡’、‘佛奧’、‘城固32’、‘貝拉特’和‘巴尼亞’。3個試驗品種所有子代均未發(fā)現(xiàn)自交現(xiàn)象。[結(jié)論]‘豆果’、‘鄂植8號’和‘九峰4號’均為自交不親和品種?！肆_萊卡’和‘佛奧’與‘九峰4號’和‘鄂植8號’的親和性均較強，‘城固32’和‘貝拉特’與‘豆果’的親和性較強。在油橄欖建園時，可以選擇‘克羅萊卡’和‘佛奧’作為‘鄂植8號’和‘九峰4號’的授粉樹，選擇‘城固32’和‘貝拉特’可作為‘豆果’的授粉樹。

油橄欖；SSR標(biāo)記；父本分析；親和性

油橄欖(OleaeuropaeaL.)原產(chǎn)于地中海沿岸，為木犀科(Oleaceae)、木犀欖屬(OleaL.)植物，是著名的木本油料兼果用樹種，其果實含油率高，鮮榨油即可直接食用，并具有極高的營養(yǎng)價值。于20世紀(jì)60年代開始，我國大量引種油橄欖，并開展了栽培技術(shù)和品種選育等研究[1-2]。已有研究表明，多數(shù)油橄欖品種具有自交不親和性或部分自交不親和性，且品種間雜交親和性也有一定的差異[3-9]。‘巴尼亞’(Barnea)是以色列油橄欖密植園主栽品種，與‘科拉蒂’(Coratina)和皮瓜爾’(Picual)雜交的2年平均座果率分別高達(dá)5.3%和7.3%，而與‘豆果’(Arbequina)雜交的平均座果率僅為0.22 %[9]。因此，合理配置授粉品種可以提高產(chǎn)量[7]。傳統(tǒng)方法主要依據(jù)雜交授粉的座果率來進(jìn)行授粉樹的選配[5，10-11]，然而,在授粉過程中不可避免的花粉污染會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，而基于分子標(biāo)記的父本分析則可解決這一問題。對已知母本的種子進(jìn)行遺傳標(biāo)記分析而確定每一個子代(種子)的親本，鑒定出大多數(shù)種子的花粉來源，推算出不同父本的貢獻(xiàn)率，從而用于研究品種間親和性，確定品種授粉組合[12]。由于SSR標(biāo)記因具有多態(tài)性高和共顯性的特點，被廣泛應(yīng)用于油橄欖子代的父本分析[7-8，12-13]。

目前，國內(nèi)基于人工授粉的座果率來研究油橄欖品種間親和性，確定適宜的授粉樹[10，14-17]，而利用父本分析研究油橄欖親和性尚未見報道。在國外雖有相關(guān)報道，但研究結(jié)論存在一定差異，而且由于環(huán)境因素對研究油橄欖的親和性有一定影響，如Gharibzadeh等[7]發(fā)現(xiàn)，‘克羅萊卡’(Koroneiki)在伊朗戈勒斯坦省是自交親和的，而Mookerjee等[18]發(fā)現(xiàn)，‘克羅萊卡’在澳大利亞南部地區(qū)是自交不親和的。此外，不同地區(qū)油橄欖主栽品種亦不同。因此，本文利用SSR標(biāo)記對四川省西昌市油橄欖自由授粉子代進(jìn)行父本分析，研究油橄欖品種間親和性，確定適宜授粉品種，為涼山州油橄欖建園品種配置提供依據(jù)。

1 試驗地概況

試驗地處于四川省涼山彝族自治州西昌市中澤新技術(shù)開發(fā)有限公司北河基地(102°14′33″ E，27°44′40″N)。涼山州屬于暖溫帶濕潤氣候區(qū)，干濕分明，冬半年日照充足，少雨干暖；夏半年云雨較多，氣候涼爽。日溫差大，年溫差小，年均氣溫16～17℃。年日照時數(shù)約1 600～2 000 h，最高達(dá)2 400 h。于2007—2012年期間陸續(xù)以2年生扦插苗和嫁接苗定植建園，常規(guī)管理。園內(nèi)開花品種共36個(表1)，均視為候選父本。這些品種生長表現(xiàn)良好，均已進(jìn)入成熟期并盛花盛果。試驗園為孤立園，品種配置見圖1，周圍3 km范圍內(nèi)無開花的油橄欖樹。選取‘豆果’、‘九峰4號’、‘鄂植8號’3個品種作為母樹。

于2014年3—4月對園內(nèi)各品種花期進(jìn)行調(diào)查，以開花量1%～25%為初花期，26%～75%為盛花期，76%～100%為末花期[10]。于2014年10月，采集園內(nèi)所有品種的嫩葉，硅膠干燥保存，用于DNA提取，并采集3株母樹自由授粉種子共334個(‘豆果’117個，‘九峰4號’103個，‘鄂植8號’114個)，播種于中國林業(yè)科學(xué)研究院溫室。2015年9月，采集所有子代播種苗嫩葉(共204株，其中‘九峰4號’80株，出苗率77.67%；‘豆果’64株，出苗率54.7%；‘鄂植8號’60株，出苗率52.63%)，用于DNA提取。

2 研究方法

2.1 總DNA提取

采用改良CTAB法[19]提取親本及子代嫩葉DNA，并于-20℃冰箱保存。

2.2 SSR-PCR體系和引物篩選

注：表中“O”為油用，“T”為餐用。‘O’ is oil olive and ‘T’ is table olive.

SSR-PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含150 ng樣本DNA，1×PCR緩沖液(Tris-HCl 20 mmol·L-1pH值8.0，KCl 100 mmol·L-1，MgCl21.5 mmol·L-1)，1.5 mmol·L-1Mg2+，0.225 mmol·L-1dNTP，正反引物各0.2 μmol·L-1，Taq聚合酶1.25 U(TaKaRa)。PCR反應(yīng)程序為：94℃ 5 min，35個循環(huán)(94℃30 s，Tm30 s，72℃30 s)，72℃延伸7 min，4℃保溫，不同引物的Tm值不同。SSR-PCR產(chǎn)物在8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并銀染檢測。

共篩選出多態(tài)性高的12對引物(DCA3、DCA11、DCA18、GAPU59、GAPU89、GAPU103A、GAPU71B、UDO99-6、UDO99-11、UDO99-19、EMO90和OLEAGEN-H6)，并合成帶有FAM和HEX熒光基團(tuán)的熒光引物(上海捷瑞)，用于SSR-PCR反應(yīng)及毛細(xì)電泳檢測。試驗所用引物來自于相關(guān)文獻(xiàn)[19-23]。

2.3 毛細(xì)電泳檢測

取FAM和HEX熒光標(biāo)記擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物2 μL，混合后加入6 μL ddH2O，混勻。取1 μL混合產(chǎn)物，加入9 μL Hi-Di和0.5 μL ROX-500熒光分子量內(nèi)標(biāo)混合均勻，95℃變性5 min，上樣于ABI3730 DNA分析儀上，進(jìn)行毛細(xì)管電泳和自動熒光檢測，并收集數(shù)據(jù)[24]。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Gene MarkerV1.95軟件分析收集數(shù)據(jù)，輸出Allele和Bin數(shù)據(jù)。利用Cervus 3.0軟件對204個自由授粉子代進(jìn)行父本分析，并計算等位基因數(shù)(NA)、等位基因頻率(Pi)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態(tài)性信息量(PIC)。

3 結(jié)果與分析

3.1 花期分析

園內(nèi)36個品種花期觀測結(jié)果見表2。所有品種花期持續(xù)時間為31 d，其中,花期持續(xù)時間最長的品種是‘阿斯’、‘城固32’和‘皮削利’，均21 d；‘長葉卡林’和‘張林’的花期持續(xù)時間最短,僅11 d。本文所選3個品種‘豆果’、‘九峰4號’、‘鄂植8號’，均與園內(nèi)多個品種的花期重疊。

3.2 SSR多態(tài)性分析

由表3可知：12個SSR位點共擴(kuò)增出109個等位基因，每個SSR位點等位基因數(shù)為5～12，平均數(shù)為9.08個，其中，DCA11和GAPU103A的等位基因數(shù)最多，為12個，UDO99-19和EMO90的等位基因數(shù)最少，為5個。試驗群體中的平均觀測雜合度(Ho)為0.732，平均期望雜合度(He)為0.709，平均多態(tài)性信息量(PIC)為0.675。

3.3 自由授粉子代的父本分析

圖1 油橄欖試驗園品種配置圖
Fig.1 Field plan of the olive orchard showing the location of cultivars
品種編號見表1，圖中黑色方框內(nèi)數(shù)字為所選品種的母樹?！?+’代表2012年新引入品種區(qū)，‘**’代表2013年新引入品種區(qū)。The number of individual tree for each cultivar was presented in Table 1. Black square showed the position of the selected mother trees. ‘++’ and ‘**’ were respectively the locations of olive trees introduced in 2012 and 2013.

204個自由授粉子代的父本分析結(jié)果見表4。在95%置信區(qū)間下檢測出父本的子代163個(占子代總數(shù)的79.9%)，其余子代的可信度未達(dá)到要求，未被視為子代的真實父本。36個候選父本中只檢測出20個，其余16個未在子代中檢測出。20個候選父本的貢獻(xiàn)率為0.61%～32.52%，平均為5 %，其中,平均繁殖貢獻(xiàn)率最高的品種為‘克羅萊卡’(32.52 %)，以‘克羅萊卡’為父本的子代共有53個；其次是‘佛奧’和城固32，繁殖貢獻(xiàn)率分別為23.31%和12.88 %。平均繁殖貢獻(xiàn)率大于5%的品種為‘克羅萊卡’、‘佛奧’、‘城固32’、‘貝拉特’和‘巴尼亞’。

3.4 油橄欖品種的親和性

3.4.1 ‘豆果’ 表4表明:在‘豆果’64個子代中，在95%置信區(qū)間檢測出父本的子代有44個(占68.75%)。共檢測出父本品種11個，僅2個品種‘城固32’和‘貝拉特’的繁殖貢獻(xiàn)率高于10 %，其中以城固32為父本的子代數(shù)量最多(20個)，繁殖貢獻(xiàn)率為45.45 %，‘貝拉特’為父本的子代數(shù)量為9，繁殖貢獻(xiàn)率為20.45%。其余9個品種為父本的子代個數(shù)為1～4個，繁殖貢獻(xiàn)率均小于10 %。由此可知，與‘豆果’親和性較強的品種僅2個，為‘城固32’和‘貝拉特’，并且這3個品種的花期重疊，因此‘城固32’和‘貝拉特’可以作為‘豆果’的授粉樹。此外，‘豆果’44個子代中未發(fā)現(xiàn)自交現(xiàn)象。

3.4.2 ‘鄂植8號’ 在‘鄂植8號’60個子代中，在95%置信區(qū)間檢測出父本的子代有47個(占78.33%)。共檢測出父本品種8個，‘克羅萊卡’和‘佛奧’2個品種的繁殖貢獻(xiàn)率高于10 %，以‘克羅萊卡’為父本的子代數(shù)量最多(20個)，繁殖貢獻(xiàn)率為42.55 %，其次是‘佛奧’，子代數(shù)量為18，繁殖貢獻(xiàn)率為38.30 %。其余6個品種為父本的子代數(shù)量為1～3個，繁殖貢獻(xiàn)率均小于10%。由此可知，與‘鄂植8號’親和性較強的品種為‘克羅萊卡’和‘佛奧’。由于‘克羅萊卡’和‘佛奧’與‘鄂植8號’花期重疊，因此‘克羅萊卡’和‘佛奧’可作為‘鄂植8號’的授粉樹。此外，‘鄂植8號’47個子代中未發(fā)現(xiàn)自交現(xiàn)象。

表2 2014年油橄欖品種花期調(diào)查表

表3 油橄欖品種SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

3.4.3 ‘九峰4號’ 在‘九峰4號’80個子代中，95%置信區(qū)間檢測出父本的子代有72個(占90%)。共檢測出父本品種9個，僅2個品種(‘克羅萊卡’和‘佛奧’)的繁殖貢獻(xiàn)率高于10 %，其中，以‘克羅萊卡’為父本的子代數(shù)量最多(33個)，繁殖貢獻(xiàn)率為45.83 %，其次是‘佛奧’，其子代數(shù)量為20，繁殖貢獻(xiàn)率為27.78 %。其余7個品種繁殖貢獻(xiàn)率均小于10%，子代數(shù)6個。由此可知，與‘九峰4號’親和性較強的品種有2個,為‘克羅萊卡’和‘佛奧’。由于‘克羅萊卡’和‘佛奧’與‘九峰4號’花期重疊，因此均可作為‘九峰4號’的授粉樹。此外，‘九峰4號’72個子代中未發(fā)現(xiàn)自交現(xiàn)象。

4 討論

表4 油橄欖品種自由授粉子代父本分析

本文父本分析研究結(jié)果表明，‘克羅萊卡’和‘佛奧’與‘九峰4號’和‘鄂植8號’之間、‘城固32’和‘貝拉特’與‘豆果’之間的親和性均較強，但‘克羅萊卡’和‘佛奧’與‘豆果’之間、‘城固32’和‘貝拉特’與‘鄂植8號’之間的親和性均未被檢測出， 僅檢測出‘九峰4號’的1個子代，這與Mookerjee等[8]利用父本分析方法的研究結(jié)果相同，即油橄欖不同品種間親和性有差異。湖北省林科院[17]在湖北武昌測定了‘九峰4號’人工授粉的座果率發(fā)現(xiàn),‘中山24’與‘九峰4號’有一定親和性，這與本文研究結(jié)果相同。姜成英等[10]和史艷虎等[25]在甘肅武都測定‘鄂植8號’與‘萊星’間人工授粉座果率，發(fā)現(xiàn)‘鄂植8號’與‘萊星’之間正反交授粉座果率均較高，二者間可以互為授粉樹；而本文在四川涼山州油橄欖品種子代父本分析的研究發(fā)現(xiàn)，在‘鄂植8號’47個子代中，‘萊星’為父本的子代僅有1個，繁殖貢獻(xiàn)率僅為2.13%，表明‘萊星’與‘鄂植8號’之間有親和性，但親和性較低。由此可見，相同品種在不同地點的親和性具有一定的差異，可能是由于氣候條件或研究方法的不同。同時油橄欖園內(nèi)品種配置也會影響親和性研究結(jié)果，在本研究的園內(nèi)，‘城固32’和‘貝拉特’與‘豆果’之間定植距離較近，‘克羅萊卡’和‘佛奧’與‘九峰4號’和‘鄂植8號’之間定植距離較近，可能會對研究試驗結(jié)果有一定的影響。根據(jù)3個品種與候選父本之間的親和性，結(jié)合品種間花期重疊性的觀測結(jié)果，可為四川省涼山州油橄欖建園時的品種最適授粉樹配置提供依據(jù)。以‘鄂植8號’和‘九峰4號’為主栽品種時，可配置‘克羅萊卡’或‘佛奧’為授粉樹，以‘豆果’作為主栽品種時，‘城固32’和‘貝拉特’可作為授粉樹進(jìn)行品種配置。

本文對‘豆果’、‘鄂植8號’和‘九峰4號’自由授粉子代的父本分析，均未發(fā)現(xiàn)自交現(xiàn)象，說明這3個品種在四川涼山州油橄欖園是自交不親和。Diaz等[8]和Marchese[26]利用父本分析研究，也發(fā)現(xiàn)‘豆果’是自交不親和；然而，De la Rosa等[12]利用自花授粉和雜交授粉子代的父本分析法研究‘豆果’自交親和性，發(fā)現(xiàn)在西班牙不同地區(qū)油橄欖園，‘豆果’自花授粉20個子代中，有2個是自交產(chǎn)生的，而在其雜交授粉的30個子代中，有1個是由于‘豆果’自身花粉污染產(chǎn)生的，說明‘豆果’具有一定的自交親和性。姜成英等[10]在甘肅隴南測定了不同年份‘鄂植8號’自花授粉座果率,發(fā)現(xiàn)‘鄂植8號’坐果率均較低；湖北省林科院[17]于1987—1990年在湖北武昌測定了‘九峰4號’授粉座果率，發(fā)現(xiàn)‘九峰4號’自花授粉的座果率高于自由授粉和雜交授粉的。這些研究結(jié)果與本文研究結(jié)果有一定差異，是由于親和性研究的測定方法不同。利用測定人工授粉座果率的方法，研究油橄欖品種親和性，具有簡單、直觀、易操作等優(yōu)點，但在授粉過程中，可能會存在花粉污染、授粉袋內(nèi)外環(huán)境差異、花粉過多導(dǎo)致柱頭堵塞等問題，還有樹體營養(yǎng)競爭引起的落果，也會影響座果率。父本分析法具有準(zhǔn)確性高、不受環(huán)境影響的優(yōu)點，但只能利用子代進(jìn)行父本分析，環(huán)境、營養(yǎng)競爭及樹體自身狀況對座果的影響均被忽略，所以會對品種親和性研究結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，甚至出現(xiàn)截然不同的研究結(jié)論[7，12，27]。

5 結(jié)論

利用12個SSR標(biāo)記對四川省西昌市3個油橄欖品種自由授粉子代進(jìn)行父本分析，結(jié)果表明，‘城固32’和‘貝拉特’與‘豆果’親和性較強，‘克羅萊卡’和‘佛奧’與‘鄂植8號’和‘九峰4號’親和性均較強，且品種間花期重疊?！枪?2’或‘貝拉特’可以作為‘豆果’的最適授粉樹；‘克羅萊卡’和‘佛奧’可以作為‘鄂植8號’和‘九峰4號’的授粉樹。SSR標(biāo)記和父本分析是研究油橄欖親和性的有效工具，可以用于油橄欖品種親和性的研究，從而為油橄欖建園時的品種配置提供依據(jù)，同時也為今后油橄欖育種時親本的選擇提供了依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：詹春梅)

Paternity Analysis Using Microsatellite Markers to Identify the Pollen Donors of Olive Open-pollinated Offsprings

WANGNan-nan1,LIJin-hua1,WANGChang-hai1,SUGuang-can2,FUYong-ping2

(1. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; 2. Liangshan Zhongze New Tech Development Co. Ltd., Xichang 615000, Sichuan, China)

[Objective]To determine the optimal pollen donors by paternity analysis of open-pollinated offspring and lay a foundation for the pollination disposition of olive orchards. [Method] 12 SSR markers were used for the paternity analysis of the open-pollinated offspring of 3 cultivars from Xichang City, Sichuan Province. [Result] The amount of alleles per SSR locus was 5 to 12 with an average of 9.08, and DCA11 and GAPU103A had the maximum alleles (12). The average heterozygosity (Ho) observed was 0.732, the expected heterozygosity (He) was 0.709 and the polymorphism information content was 0.675.163 offspring were identified by 12 SSR markers at 95% confidence level, accounting for 79.9% of the total of the offspring. The amount of identified offspring of ‘Arbequina’, ‘EZhi-8’ and ‘Jiufeng-4’ was 44, 47 and 72 respectively. Only 20 cultivars were identified as pollen donors among the 36 candidate cultivars with the average productive success of 5%, while the cultivars which were more than 5% were ‘Koroneiki’, ‘Frantoio’, ‘Chenggu-32’, ‘Berat’ and ‘Barnea’. None of the offspring of the three cultivars were self-pollinated. [Conclusion] The cultivars ‘Arbequina’, ‘EZhi-8’ and ‘Jiufeng-4’ are self-incompatible. The cultivars ‘Koroneiki’ and ‘Frantoio’ are compatible with ‘EZhi-8’ and ‘Jiufeng-4’, while ‘Chenggu-32’ and ‘Berat’ are compatible with ‘Arbequina’. Thus, in a new olive orchard, ‘EZhi-8’ and ‘Jiufeng-4’ can be the optimal pollen donors for ‘Koroneiki’ and ‘Frantoio’, while ‘Chenggu-32’ and ‘Berat’ are the optimal pollen donors for ‘Arbequina’.

olive; paternity analysis; microsatellite markers; compatibility

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.04.015

2016-03-01

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資助“油橄欖主栽品種授粉習(xí)性及雜交的研究”(CAFYBB04MA001)

王楠楠(1990—)，女，河南濟(jì)源人，林木遺傳育種專業(yè)碩士研究生，從事油橄欖育種研究.

* 通訊作者·E-mail：lijinh@caf.ac.cn

S722.3

A

1001-1498(2017)04-0640-08