高靈敏小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA檢測(cè)方法的構(gòu)建

宋秀春，湯迎春，楊 夏

(1.內(nèi)蒙古呼倫貝爾市人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 海拉爾 021008；2.內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

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高靈敏小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA檢測(cè)方法的構(gòu)建

宋秀春1,2，湯迎春1，楊 夏2

(1.內(nèi)蒙古呼倫貝爾市人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 海拉爾 021008；2.內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

目的 為從天然化合物中高效篩選具有體液免疫抑制活性的先導(dǎo)化合物，本研究將構(gòu)建高靈敏且價(jià)格低廉的小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA檢測(cè)方法。方法 利用山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體、生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2段抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素構(gòu)建小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA檢測(cè)方法；通過(guò)對(duì)包被抗體濃度、檢測(cè)抗體濃度和鏈霉親和素濃度的優(yōu)化，使檢測(cè)方法靈敏度達(dá)到最高；再利用該檢測(cè)方法檢測(cè)體外培養(yǎng)小鼠B細(xì)胞上清中IgG濃度驗(yàn)證方法的有效性。結(jié)果 在山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體濃度達(dá)到5 μg·mL-1，生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2段抗體濃度達(dá)到0.25 μg·mL-1，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素濃度達(dá)到0.5 μg·mL-1，小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA檢測(cè)方法靈敏度達(dá)到最高(0.05 ng·mL-1)，線性范圍在0.1～10 ng·mL-1；該檢測(cè)方法可以高靈敏檢測(cè)體外培養(yǎng)LPS刺激小鼠B細(xì)胞分泌的IgG抗體。結(jié)論 本研究成功構(gòu)建高靈敏且價(jià)格低廉的小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA檢測(cè)方法。

小鼠免疫球蛋白；IgG；ELISA；靈敏度

自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病和器官移植排斥是嚴(yán)重危害人類健康的免疫失調(diào)性疾病，目前臨床主要應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢素、他克莫司等免疫抑制劑對(duì)其進(jìn)行治療。由于這些常用免疫抑制劑缺乏特異性，可導(dǎo)致代謝紊亂、血液毒性和肝腎毒性等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響了上述疾病的治療[1-3]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中已發(fā)現(xiàn)很多中藥或方劑具有祛風(fēng)除濕、清熱燥濕、溫經(jīng)散寒、通絡(luò)止痛之功效，對(duì)自身免疫性疾病和過(guò)敏性疾病具有治療作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明這種作用可能來(lái)自中藥的免疫抑制活性[4-7]。因此，從中藥中發(fā)現(xiàn)具有全新作用機(jī)制的高效低毒免疫抑制劑先導(dǎo)化合物具有重要研究意義。

根據(jù)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中中藥及其方劑的藥效導(dǎo)向，利用現(xiàn)代分離和結(jié)構(gòu)鑒定方法，可獲得大量全新結(jié)構(gòu)的具有潛在生物活性的化合物。利用傳統(tǒng)的動(dòng)物模型對(duì)種類繁多的微量化合物進(jìn)行活性篩選已難以滿足實(shí)際需要。近年來(lái)，體外細(xì)胞藥效篩選已逐漸成為天然化合物活性篩選的主要模式[8-11]。免疫抑制劑體外篩選需要測(cè)定多種指標(biāo)，其中B細(xì)胞分泌的IgG是篩選該類抑制劑的核心指標(biāo)。然而，由于已有的小鼠IgG的ELISA測(cè)定試劑盒靈敏度低且價(jià)格昂貴，極大地限制了免疫抑制劑的篩選。為充分發(fā)掘中藥資源，高效篩選免疫抑制劑先導(dǎo)化合物，本研究將構(gòu)建靈敏度高且價(jià)格低廉的小鼠IgG的ELISA檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

8周齡雄性Balb/c小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2 試劑

RPMI1640培養(yǎng)基(貨號(hào)：10-010-CVR)、胎牛血清(貨號(hào)：35-076-CV)、0.25%胰酶(貨號(hào)：25-253-CI)、氨芐青霉素和鏈霉素(貨號(hào)：30-002-CI)，購(gòu)自美國(guó)Corning公司；紅細(xì)胞裂解液(貨號(hào)：CC051)，購(gòu)自北京邁晨科技有限公司；脂多糖(貨號(hào)：L2880)、牛血清白蛋白(貨號(hào)：V900933)、吐溫20(貨號(hào)：P1379)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體(貨號(hào)：SA0102)、生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2段抗體(貨號(hào)：SA0103B)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶親和素(貨號(hào)：BR0001)，購(gòu)自北京佰瑞達(dá)生物科技有限公司；單組份TMB顯色液(貨號(hào)：PR1200)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)范圍的初步評(píng)估

將山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體(10 μg·mL-1)加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜；利用清洗液(含0.1%吐溫20的PBS)清洗酶標(biāo)板3次后，將封閉液(含1%BSA的PBS)加入酶標(biāo)板中，37 ℃封閉2 h；倒去封閉液，加入封閉液稀釋的系列濃度小鼠IgG(0.001～1 000 ng·mL-1)，37 ℃反應(yīng)1 h；利用清洗液清洗酶標(biāo)板3次后，加入抗體稀釋液(含0.1%吐溫20和1%BSA的PBS)稀釋的生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(1 μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)1 h；利用清洗液清洗酶標(biāo)板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(HRP-SA，2 μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)0.5 h；利用清洗液清洗酶標(biāo)板5次后，加入TMB底物進(jìn)行顯色；加入終止液(含10%濃鹽酸的蒸餾水)后，450 nm測(cè)定吸光度。

1.2.2 包被抗體濃度優(yōu)化

將0.1～100 μg·mL-1山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜；利用清洗液清洗酶標(biāo)板3次后，將封閉液加入酶標(biāo)板中，37 ℃封閉2 h；倒去封閉液，加入利用封閉液稀釋的小鼠IgG(5 ng·mL-1)，37 ℃反應(yīng)1 h；利用清洗液清洗酶標(biāo)板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(1 μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)1 h；利用清洗液清洗酶標(biāo)板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的HRP-SA(2 μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)0.5 h；利用清洗液清洗酶標(biāo)板5次后，加入TMB底物進(jìn)行顯色；加入終止液后，450 nm測(cè)定吸光度。1.2.3 檢測(cè)抗體濃度優(yōu)化

將山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體(5 μg·mL-1)加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜；利用清洗液清洗酶標(biāo)板3次后，將封閉液加入酶標(biāo)板中，37 ℃封閉2 h；倒去封閉液，加入封閉液稀釋的小鼠IgG(5 ng·mL-1)，37 ℃反應(yīng)1 h；利用清洗液清洗酶標(biāo)板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(0.01～10 μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)1 h；利用清洗液清洗酶標(biāo)板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的HRP-SA(2 μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)0.5 h；利用清洗液清洗酶標(biāo)板5次后，加入TMB底物進(jìn)行顯色；加入終止液后，450 nm測(cè)定吸光度。1.2.4 HRP-SA濃度的優(yōu)化

將山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體(5 μg·mL-1)加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜；利用清洗液清洗酶標(biāo)板3次后，將封閉液加入酶標(biāo)板中，37 ℃封閉2 h；倒去封閉液，加入封閉液稀釋的小鼠IgG(5 ng·mL-1)，37 ℃反應(yīng)1 h；利用清洗液清洗酶標(biāo)板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(0.25 μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)1 h；利用清洗液清洗酶標(biāo)板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的HRP-SA(0.01～10 μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)0.5 h；利用清洗液清洗酶標(biāo)板5次后，加入TMB底物進(jìn)行顯色；加入終止液后，450 nm測(cè)定吸光度。1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

將山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體(5 μg·mL-1)加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜；利用清洗液清洗酶標(biāo)板3次后，將封閉液加入酶標(biāo)板中，37 ℃封閉2 h；倒去封閉液，加入封閉液稀釋的系列濃度小鼠IgG(0.01～10 ng)，37 ℃反應(yīng)1 h；利用清洗液清洗酶標(biāo)板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(0.25 μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)1 h；利用清洗液清洗酶標(biāo)板3次后，加入抗體稀釋液稀釋的HRP-SA(0.5 μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)0.5 h；利用清洗液清洗酶標(biāo)板5次后，加入TMB底物進(jìn)行顯色；加入終止液后，450 nm測(cè)定吸光度。

1.2.6 B細(xì)胞分泌抗體的濃度測(cè)定

頸椎脫臼處死Balb/c小鼠，利用75%乙醇浸泡5 min，無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)取小鼠脾臟；將小鼠脾臟放入70 μM無(wú)菌濾網(wǎng)中，5 mL注射器內(nèi)芯研磨，并用20 mL PBS沖洗，獲得小鼠脾臟細(xì)胞懸液；300 g離心5 min，棄上清，加入10 mL紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，再加入20 mL RPMI1640培養(yǎng)基終止裂解，300 g離心5 min，棄上清；再利用10 mL的含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，300 g離心5 min，棄上清；最后利用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞(含氨芐青霉素和鏈霉素)，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。將細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中(2×105個(gè)/孔)，加入LPS(10 μg·mL-1)，0～72 h內(nèi)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞上清，利用上述ELISA方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的小鼠IgG。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 小鼠IgG的檢測(cè)范圍

為確定適合的小鼠IgG濃度用于后續(xù)測(cè)定條件優(yōu)化，首先需要在常規(guī)檢測(cè)條件下確定小鼠IgG的檢測(cè)范圍。經(jīng)初步研究，確定小鼠IgG的檢測(cè)范圍為0.1～100 ng·mL-1(圖1)。

圖1 小鼠IgG的定量范圍

注：利用山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體(10 μg·mL-1)包被96孔酶標(biāo)板；經(jīng)清洗和封閉后，加入封閉液稀釋的系列濃度小鼠IgG(0.001～1 000 ng·mL-1)，37 ℃反應(yīng)1 h；經(jīng)清洗酶標(biāo)板后，加入生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(1μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)1 h；清洗酶標(biāo)板后，加入HRP-SA(2 μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)0.5 h；再經(jīng)清洗酶標(biāo)板后，加入TMB底物進(jìn)行顯色10 min；最后加入終止液，450 nm測(cè)定吸光度。

2.2 包被抗體濃度對(duì)測(cè)定的影響

初步評(píng)估小鼠IgG檢測(cè)范圍后，選擇5 ng·mL-1的小鼠IgG進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)條件優(yōu)化。通過(guò)對(duì)不同濃度包被抗體的研究，發(fā)現(xiàn)包被抗體濃度≥5 μg·mL-1時(shí)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到最大(圖2)。

圖2 包被抗體濃度對(duì)測(cè)定的影響

注：利用山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體(0.1～100 μg·mL-1)包被96孔酶標(biāo)板中；經(jīng)清洗和封閉后，加入5 ng·mL-1小鼠IgG，37 ℃反應(yīng)1 h；經(jīng)清洗酶標(biāo)板后，加入生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(1μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)1 h；清洗酶標(biāo)板后，加入HRP-SA(2 μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)0.5 h；再經(jīng)清洗酶標(biāo)板后，加入TMB底物進(jìn)行顯色10 min；最后加入終止液，450 nm測(cè)定吸光度。*P<0.05與包被抗體濃度為100 μg·mL-1的A450比較。

2.3 檢測(cè)抗體濃度對(duì)測(cè)定的影響

經(jīng)過(guò)初步的小鼠IgG檢測(cè)范圍的評(píng)估和包被抗體濃度的優(yōu)化，選取5 ng·mL-1的小鼠IgG、5 μg·mL-1的包被抗體濃度進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。通過(guò)對(duì)不同濃度檢測(cè)抗體的研究，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)抗體濃度≥0.25 μg·mL-1時(shí)，可使檢測(cè)靈敏度達(dá)到最大(與最高檢測(cè)抗體濃度相比)(圖3)。

圖3 檢測(cè)抗體濃度對(duì)測(cè)定的影響

注：利用5 μg·mL-1山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體包被96孔酶標(biāo)板中；經(jīng)清洗和封閉后，加入5 ng·mL-1小鼠IgG，37 ℃反應(yīng)1 h；經(jīng)清洗酶標(biāo)板后，加入系列濃度生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體(0.01～10 μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)1 h；清洗酶標(biāo)板后，加入HRP-SA(2 μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)0.5 h；再經(jīng)清洗酶標(biāo)板后，加入TMB底物進(jìn)行顯色10 min；最后加入終止液，450 nm測(cè)定吸光度。*P<0.05與檢測(cè)抗體濃度為10 μg·mL-1的A450比較。

2.4 HRP-SA濃度對(duì)測(cè)定的影響

在確定了合適的包被抗體和檢測(cè)抗體濃度后，本研究進(jìn)一步對(duì)HRP-SP濃度進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)HRP-SP濃度≥0.5μg·mL-1時(shí)，能使檢測(cè)靈敏度達(dá)到最大值(圖4)。

圖4 HRP-SA濃度對(duì)測(cè)定的影響

注：利用5 μg·mL-1山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體包被96孔酶標(biāo)板中；經(jīng)清洗和封閉后，加入5 ng·mL-1小鼠IgG，37 ℃反應(yīng)1 h；經(jīng)清洗酶標(biāo)板后，加入0.25 μg·mL-1生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體，37 ℃反應(yīng)1 h；清洗酶標(biāo)板后，加入系列濃度HRP-SA(0.01～10μg·mL-1)，37 ℃反應(yīng)0.5 h；再經(jīng)清洗酶標(biāo)板后，加入TMB底物進(jìn)行顯色10 min；最后加入終止液，450 nm測(cè)定吸光度。*P<0.05與HRP-SA濃度為10 μg·mL-1時(shí)的A450比較。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

利用優(yōu)化的測(cè)定條件對(duì)小鼠IgG進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定，以確定測(cè)定靈敏度和線性范圍。結(jié)果顯示該檢測(cè)方法靈敏度可達(dá)0.05 ng·mL-1，線性范圍為0.1～10 ng·mL-1(圖5)。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

注：利用5 μg·mL-1山羊抗小鼠IgG的Fc段抗體包被96孔酶標(biāo)板；經(jīng)清洗和封閉后，加入0.01～100 ng·mL-1小鼠IgG，37 ℃反應(yīng)1 h；經(jīng)清洗酶標(biāo)板后，加入0.25 μg·mL-1生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗體，37 ℃反應(yīng)1 h；清洗酶標(biāo)板后，加入0.5 μg·mL-1的HRP-SA，37 ℃反應(yīng)0.5 h；再經(jīng)清洗酶標(biāo)板后，加入TMB底物進(jìn)行顯色10 min；最后加入終止液，450 nm測(cè)定吸光度。

2.6 B細(xì)胞分泌IgG的測(cè)定

在經(jīng)過(guò)測(cè)定條件優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定后，本研究對(duì)體外培養(yǎng)小鼠B細(xì)胞分泌的IgG進(jìn)行測(cè)定，以驗(yàn)證測(cè)定方法的有效性。結(jié)果顯示該檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確檢測(cè)出B細(xì)胞在不同刺激時(shí)間后分泌的IgG(圖6)。

3 討 論

傳統(tǒng)的小鼠IgG檢測(cè)主要采用免疫沉淀法和免疫比濁法。這2類方法雖然比較廉價(jià)，但其靈敏度、定量能力較差，測(cè)定通量過(guò)低。近年來(lái)，通過(guò)

圖6 B細(xì)胞分泌IgG的測(cè)定

注：體外培養(yǎng)小鼠脾臟B細(xì)胞；利用10 μg·mL-1濃度的LPS刺激B細(xì)胞分泌抗體；在0～72 h的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，利用上述優(yōu)化后的檢測(cè)條件測(cè)定IgG濃度。

ELISA方法檢測(cè)小鼠IgG已經(jīng)成為廣泛應(yīng)用的定量方法，其定量準(zhǔn)確和高通量特性非常適合藥物先導(dǎo)化合物的篩選。但由于抗抗體與IgG的同源性，它們的結(jié)合能力具有效價(jià)低的天然特性。因此，目前市售的檢測(cè)小鼠IgG的ELISA試劑盒普遍靈敏度偏低(例如ebioscience公司檢測(cè)小鼠IgG的ELISA試劑盒靈敏度為1.56 ng，武漢華美生物工程有限公司檢測(cè)小鼠IgG的ELISA試劑盒靈敏度為29 ng)，僅能用于體內(nèi)IgG檢測(cè)和含高濃度IgG的體外細(xì)胞上清檢測(cè)。在藥物先導(dǎo)化合物的篩選和機(jī)制研究中，經(jīng)常要對(duì)少量B細(xì)胞在不同刺激劑和刺激時(shí)間下分泌的微量IgG進(jìn)行檢測(cè)，而已有的試劑盒靈敏度難以滿足實(shí)驗(yàn)需要。

本研究主要利用雙抗夾心法檢測(cè)小鼠IgG，相對(duì)競(jìng)爭(zhēng)法能夠顯著提高靈敏度，改善定量準(zhǔn)確性。通過(guò)分別針對(duì)小鼠IgG的Fc段和F(ab’)2段二抗的雙抗夾心法可以避免包被抗體和檢測(cè)抗體的交叉反應(yīng)，降低生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體濃度，從而降低檢測(cè)背景，提高檢測(cè)靈敏度。另外生物素和親和素結(jié)合反應(yīng)可以進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。

在改進(jìn)檢測(cè)方法設(shè)計(jì)后，本研究通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化包被抗體濃度、檢測(cè)抗體濃度、HRP-SA濃度，將檢測(cè)方法的靈敏度提高到0.05 ng·mL-1，線性范圍達(dá)到0.1～10 ng。相對(duì)于國(guó)內(nèi)外市售試劑盒，本檢測(cè)方法顯著提高了小鼠IgG的檢測(cè)靈敏度和定量特性，并且檢測(cè)方法成本僅相當(dāng)于市售試劑盒的1/10～1/50。

本研究成功構(gòu)建了高靈敏且價(jià)格低廉的小鼠IgG的ELISA檢測(cè)方法，非常適用于免疫抑制劑先導(dǎo)化合物的篩選及其作用機(jī)制研究。

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[責(zé)任編輯：李薊龍 英文編輯：劉彥哲]

Construction of High Sensitivity Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Mouse IgG

SONG Xiu-chun1,2，TANG Ying-chun1，YANG Xia2

(1.Hulunbeier People’s Hospital,Hailaer,Inner Mongolia 021008,China; 2.Baogang Hospital,Baotou,Inner Mongolia 100050,China)

Objective To efficiently and reliably screen natural compounds for lead compounds with immunosuppressive activity,high sensitivity and low-cost enzyme-linked immunosorbent assay for mouse IgG was constructed.Methods Goat antibody specific to Fc fragment of mouse IgG,goat antibody specific to F(ab’)2 fragment of mouse IgG,and horseradish peroxidase-labeled streptavidin(HRP-SA)were used to construct ELISA for mouse IgG.The concentration of capture antibody,detection antibody and HRP-SA were optimized to improve the sensitivity of this assay.Then to validate this method,the assay was used to determine the level of mouse IgG secreted by B cells culturedinvitro.Results While the concentration of capture antibody reached 5 μg/ml,the concentration of detection antibody reached 0.25 μg/ml,and HRP-SA reached 0.5 μg/ml,the highest sensitivity was achieved(0.05 ng/ml)and the linear range was from 0.1 to 10 ng/ml.This assay could be used to determine the level of mouse IgG secreted by B cells cultured in vitro with high sensitivity.Conclusion This study successfully constructed high sensitivity and low-cost ELISA for mouse IgG.

mouse immunoglobulin;IgG;ELISA;sensitivity

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究基金項(xiàng)目(NO.2014-24)

宋秀春(1980-)，女，護(hù)士長(zhǎng)，主管護(hù)師。

楊夏(1984-)，女，碩士，主管藥師，研究方向：藥品質(zhì)量控制方法學(xué)。

R 730.45

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2017.08.003

來(lái)稿日期：2016-12-19