A型產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶Cp51的原核表達(dá)及活性檢測

呂夢(mèng)娜，龍航宇，王麗梅，唐 陶，陳冰冰，林瑞慶

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510642)

A型產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶Cp51的原核表達(dá)及活性檢測

呂夢(mèng)娜，龍航宇，王麗梅，唐 陶，陳冰冰，林瑞慶

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510642)

【目的】原核表達(dá)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶Cp51并研究其對(duì)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridium perfringens的體外抗菌活性。 【方法】合成噬菌體裂解酶Cp51基因，并構(gòu)建了pET-32a-Cp51原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌Escherichia coli BL21(DE3)，經(jīng)終濃度為0.5 mmol·L–1的IPTG誘導(dǎo)以及鎳柱純化后，獲得了可溶性的Cp51重組蛋白；用比濁法檢測Cp51重組蛋白的殺菌活性。 【結(jié)果】噬菌體裂解酶Cp51重組蛋白能夠有效降低7株A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的濁度，裂解酶質(zhì)量濃度在5 μg·mL–1以上、作用30 min對(duì)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的殺菌率可達(dá)到99.99%以上，而對(duì)其他種類細(xì)菌無殺菌效果。 【結(jié)論】A型產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶Cp51重組蛋白對(duì)

A型產(chǎn)氣莢膜梭菌有較強(qiáng)的體外殺菌活性和特異性，研究結(jié)果為后續(xù)裂解酶Cp51的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

產(chǎn)氣莢膜梭菌；噬菌體；裂解酶；蛋白表達(dá)；殺菌活性

產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridium perfringens又名魏氏梭菌C. welchii，是一種重要的人畜共患病原菌[1]。產(chǎn)氣莢膜梭菌為兩端鈍圓厭氧性菌，呈粗桿狀，單個(gè)或成對(duì)存在，是一種能產(chǎn)芽孢的革蘭陽性菌，在人和動(dòng)物的腸道內(nèi)普遍存在，也廣泛分布于污水、土壤等自然環(huán)境中。根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的4種主要外毒素，可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D和E 型，其中A型產(chǎn)氣莢膜梭菌是引發(fā)人類氣性壞疽及家禽壞死性腸炎的主要病原[2]。目前家禽壞死性腸炎的預(yù)防和治療仍以抗生素為主，但由于抗生素的長期和不規(guī)范使用引起細(xì)菌耐藥性及藥物殘留等問題廣泛出現(xiàn)，不僅使家禽的生產(chǎn)性能大大降低，而且通過雞等肉制品威脅人類健康[3-4]。人類已進(jìn)入了“后抗生素”時(shí)代，細(xì)菌耐藥性等問題已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)以及畜牧生產(chǎn)的難題[5-6]。作為預(yù)防和治療細(xì)菌疾病的一種古老的方法，噬菌體防控在這種情況下又回到了歷史舞臺(tái)。噬菌體在抗生素興起之前就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和使用，噬菌體能特異性地裂解宿主細(xì)菌，其編碼的裂解酶是在基因組復(fù)制后期合成的一種酶，作用于細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖上的酰胺鍵，使細(xì)菌破碎，釋放出子代噬菌體[7]。細(xì)菌對(duì)噬菌體裂解酶不易產(chǎn)生耐藥性，而噬菌體裂解酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域能識(shí)別宿主細(xì)胞壁受體分子，從而從體外特異性識(shí)別細(xì)菌并將其溶解，而不需噬菌體侵染細(xì)菌時(shí)的吸附、自我復(fù)制、繁殖等系列過程，因此，噬菌體裂解酶的裂解譜比噬菌體的裂解譜寬。噬菌體裂解酶作為一種潛在的抗菌制劑具有高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。目前國內(nèi)已有許多學(xué)者利用相應(yīng)的噬菌體裂解酶作用于葡萄球菌、鏈球菌等細(xì)菌均得到了較好的抗菌效果[10-13]。產(chǎn)氣莢膜梭菌病的防控及噬菌體研究在國外受到重視[14]，但國內(nèi)目前針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。

本試驗(yàn)原核表達(dá)了 A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶 Cp51，并初步研究了 A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶 Cp51 重組蛋白對(duì) A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌的體外裂解活性，以期為進(jìn)一步研究治療壞死性腸炎的新型藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 7株A型產(chǎn)氣莢膜梭菌、2株金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、2株豬鏈球菌Streptococcus suis、1株腸炎沙門氏菌Salmonella enteritidis、1株大腸埃希菌Escherichia coli和1株腐敗梭菌Clostridium septicum及表達(dá)載體pET-32a(+)為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室保存；感受態(tài)細(xì)胞DH 5α、BL 21(DE3)均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 工具酶及主要試劑 BamH I內(nèi)切酶、HindⅢ內(nèi)切酶、DNA Marker DL 2000、DL 15000、凝膠回收試劑盒均購自日本TaKaRa公司。Page Ruler Prestained Protein Ladder 10～170 kU購自Thermo公司。質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生化科技有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒、純化填料、HRP羊抗鼠IgG、EasySee Western-blot Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。LB肉湯、TSC培養(yǎng)基、咪唑購自廣州鼎國生物技術(shù)有限公司。其余常用試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶Cp51基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 通過GeneBank獲得A型產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶Cp51蛋白序列(AGH27916.1)，根據(jù)Cp51蛋白的氨基酸序列人工合成相應(yīng)的Cp51基因序列，在5′端引入BamH I位點(diǎn)，3′端引入Hind Ⅲ位點(diǎn)，并在不改變氨基酸的情況下對(duì)Cp51基因序列中810位堿基由A突變?yōu)镚，人工合成由深圳華大科技有限公司完成。合成的基因克隆于pMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)大腸埃希菌中，挑取陽性克隆，進(jìn)行PCR、酶切、測序驗(yàn)證。重組質(zhì)粒pMD-18T-Cp51經(jīng)BamH I和HindⅢ雙酶切，切膠回收Cp51基因目的片段，克隆到表達(dá)載體pET-32a(+)上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32a-Cp51，陽性克隆送到深圳華大科技有限公司測序。

1.2.2 重組蛋白pET-32a-Cp51的表達(dá)和純化 將測序正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL 21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，挑取單克隆接種到5 mL含有100 μg·mL–1的Amp+LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下150 r·min–1培養(yǎng)過夜，按1︰100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃條件下180 r·min–1震蕩培養(yǎng)至D600nm為0.4～0.6，加入IPTG使終濃度為0.5 mmol·L–1，37 ℃條件下180 r·min–1誘導(dǎo)3 h。8 000 r·min–1離心10 min，收集菌體，菌體重懸于平衡緩沖液中(10 mmol·L–1咪唑)，功率200 W，超聲3 s，間隔5 s，超聲120次。分別取上清和沉淀，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液10 μL，煮沸5 min，10 000 r·min–1離心10 min，進(jìn)行SDSPAG 電泳，檢測重組蛋白是存在于上清液中還是存在于包涵體中。

采用全式金生物技術(shù)有限公司的Ni2+–NTA蛋白質(zhì)純化柱純化目的蛋白, 選擇不同濃度的咪唑(20～200 mmol·L–1)梯度洗脫，純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，測定純化效率，確定洗脫液的最佳咪唑濃度，并用BCA法測定蛋白濃度。

1.2.3 重組蛋白pET-32a-Cp51 的 Western blot檢測 分別取150 mmol·L–1咪唑洗脫液40 μL，pET-32a-Cp51未誘導(dǎo)樣品和pET-32a(+)誘導(dǎo)菌處理后加 5×SDS-PAGE上樣緩沖液10 μL，進(jìn)行SDSPAGE電泳。電泳結(jié)束后將膠切成合適大小。安裝好轉(zhuǎn)膜裝備，放入轉(zhuǎn)膜槽，接通電源，電流150 mA，轉(zhuǎn)膜2 h，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉1 h，小鼠抗His抗體用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% 的脫脂奶粉稀釋為體積比1︰2 000，室溫條件下孵育2 h，羊抗小鼠HRPIgG用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% 的脫脂奶粉稀釋為體積比1︰2 000，室溫條件下?lián)u床孵育1～2 h。TBST洗膜3次，將ECL的2種發(fā)光液按照體積比1︰1的比例混合，發(fā)光顯色，拍照保存。

1.2.4 重組蛋白pET-32a-Cp51活性檢測及裂解譜的測定 將過夜培養(yǎng)的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌以10 000 r·min–1離心1 min，PBS清洗后，細(xì)菌重懸于4 mL的 PBS 中，加入1 mL蛋白純化液，使得最終的反應(yīng)體系為5 mL，蛋白的終質(zhì)量濃度分別為 20、10、5和 1 μg·mL–1，同時(shí)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌最終的D600nm約為0.6，細(xì)菌數(shù)約為108cfu·mL–1，設(shè)置pET-32a空載組和PBS組作為對(duì)照組，37 ℃條件下180 r·min–1震蕩培養(yǎng)，分別在0、5、10、15、20 和30 min時(shí)測量D600nm，取3次重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值。并將作用30 min的最終反應(yīng)液取100 μL涂布于TSC平板，40 ℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h。

用終質(zhì)量濃度為10 μg·mL–1重組蛋白pET-32a-Cp51分別作用于本試驗(yàn)分離和保存的7株A型產(chǎn)氣莢膜梭菌、2株葡萄球菌、2株鏈球菌、1株沙門氏菌、1株大腸埃希菌和1株腐敗梭菌，測定其在作用0、5、10、15、20和30 min時(shí)的D600nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cp51基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將陽性重組表達(dá)載體pET-32a-Cp51經(jīng)BamH I和Hind Ⅲ雙酶切后，得到2條片段，一條為載體條帶，另一條約為1 150 bp的目的基因條帶(圖1)，測序結(jié)果表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.2 pET-32a-Cp51誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將重組的質(zhì)粒pET-32a-Cp51轉(zhuǎn)化至BL 21(DE3)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示上清和沉淀中均在相對(duì)分子質(zhì)量約為63 000處有明顯蛋白條帶(圖2)。故選擇從上清中純化目的蛋白，用不同濃度的咪唑溶液洗脫收集，SDS-PAGE檢測顯示用150和200 mmol·L–1咪唑洗脫時(shí)，在相對(duì)分子質(zhì)量63 000處可獲得較多的重組蛋白，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度分別是555和450 μg·mL–1(圖3)。

圖1 重組質(zhì)粒pET-32a-Cp51酶切鑒定Fig. 1 Identification of recombinant plasmid pET-32a-Cp51 by enzyme digestion

圖2 pET-32a-CP51表達(dá)SDS-PAGE電泳Fig. 2 SDS-PAGE pattern of expressed pET-32a-CP51 protein

圖3 pET-32a-Cp51蛋白純化的SDS-PAGE電泳Fig. 3 SDS-PAGE pattern of purified pET-32a-Cp51 protein

2.3 pET-32a-Cp51的Western blot檢測結(jié)果

pET-32a-Cp51純化產(chǎn)物和pET-32a空載體表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上進(jìn)行免疫印跡，結(jié)果純化的重組目的蛋白和空載體表達(dá)產(chǎn)物均可與小鼠抗His抗體發(fā)生反應(yīng)，純化的重組目的蛋白約在相對(duì)分子質(zhì)量63 000的位置出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，pET-32a空載體表達(dá)產(chǎn)物約在相對(duì)分子質(zhì)量20 000的位置出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶(圖4)。

圖4 pET-32a-Cp51蛋白的Western blot檢測結(jié)果Fig. 4 Western blot results of pET-32a-Cp51 protein

2.4 pET-32a-Cp51活性及裂解譜檢測結(jié)果

采用比濁法，測定pET-32a-Cp51的抗菌活性。結(jié)果(圖5)顯示，與pET-32a(+)和PBS對(duì)比，30 min內(nèi)終質(zhì)量濃度為20、10和5 μg·mL–1的pET-32a-Cp51噬菌體裂解酶稀釋液能將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的濁度從0.6降至0.1，而終質(zhì)量濃度1 μg·mL–1的pET-32a-Cp51噬菌體裂解酶稀釋液能將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的濁度從0.6降至0.33。說明pET-32a-Cp51 作用于相近起始D600nm的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌液時(shí)，隨著酶液作用濃度的增加，D600nm下降速度加快。平板涂布樣品經(jīng)40 ℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察，根據(jù)平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)終質(zhì)量濃度為20、10和5 μg·mL–1酶液作用于菌液30 min后，可使A型產(chǎn)氣莢膜梭菌裂解率達(dá)99.99%、99.99%和 100%，酶液終質(zhì)量濃度為1 μg·mL–1樣品的裂解率可達(dá)99.91%，表明pET-32a-Cp51對(duì)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌具有高效裂解活性，終質(zhì)量濃度5 μg·mL–1以上有較強(qiáng)殺菌效果。利用相同方法作用于A型產(chǎn)氣莢膜梭菌不同分離株發(fā)現(xiàn)pET-32a-Cp51均有良好裂解活性(圖6)。而作用于葡萄球菌、鏈球菌、沙門氏菌、大腸埃希菌和腐敗梭菌則無裂解作用(圖7)。

圖5 不同質(zhì)量濃度pET-32a-Cp51裂解酶對(duì)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的活性Fig. 5 Activity of different concentrations of pET-32a-Cp51 lysin against type A Clostridium perfringens

圖6 pET-32a-Cp51裂解酶對(duì)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌不同分離株的活性Fig. 6 Activity of pET-32a-Cp51 lysin against different isolates of type A Clostridium perfringens

3 討論與結(jié)論

自人類使用抗生素以來，各種抗生素的濫用、亂用現(xiàn)象層出不窮，因此導(dǎo)致了大量的細(xì)菌耐藥和抗生素殘留等問題。由于抗生素的使用不當(dāng)帶來的耐藥菌株甚至成為超級(jí)耐藥菌株，不僅提高了畜禽的死亡率，而且增大了預(yù)防和治療的投入，給養(yǎng)殖業(yè)帶了巨大的損失[15]。隨著產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥性加劇，開發(fā)新型抗菌藥物治療壞死性腸炎迫在眉睫[16]。裂解酶是噬菌體在裂解末期表達(dá)的一種能降解肽聚糖的酶，在革蘭陽性菌上作用明顯[17]，還具有高效、特異性強(qiáng)、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)勢(shì)，作為新興的抗菌劑具有較高的應(yīng)用價(jià)值。本研究成功構(gòu)建A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體裂解酶Cp51 基因的重組表達(dá)載體pET-32a-Cp51，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)行蛋白純化。比濁法測定結(jié)果顯示A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體裂解酶pET-32a-Cp51 對(duì)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌殺菌活性效果明顯，終質(zhì)量濃度5 μg·mL–1以上、作用0.5 h后的殺菌率高達(dá)99.99%，殺菌效果與Gervasi 等[17]的裂解酶試驗(yàn)結(jié)果相似，且能以較低的蛋白濃度達(dá)到較強(qiáng)的殺菌效果，此外，本試驗(yàn)進(jìn)行了噬菌體裂解酶pET-32a-Cp51 對(duì)多種常見細(xì)菌的裂解譜試驗(yàn)，結(jié)果表明pET-32a-Cp51 具有較強(qiáng)特異性，只裂解A型產(chǎn)氣莢膜梭菌，對(duì)其他種類細(xì)菌無作用。

近幾年，人們應(yīng)用噬菌體及其裂解酶進(jìn)行了一系列的試驗(yàn)，顯示其具有高效殺菌、不易產(chǎn)生耐藥性和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在治療細(xì)菌感染病方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值[18-20]。綜上所述，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶Cp51原核表達(dá)純化后，其蛋白純度較高，體外裂解試驗(yàn)表明對(duì)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌具有明顯殺滅效果，為研究其替代抗生素作為新型抗菌藥物奠定了基礎(chǔ)。

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【責(zé)任編輯 李曉卉】

Prokaryotic expression and activity detection of bacteriophage lysin Cp51 against Clostridium perfringens type A

Lü Mengna, LONG Hangyu, WANG Limei, TANG Tao, CHEN Bingbing, LIN Ruiqing
(College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University/Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong Province, Guangzhou 510642, China)

【Objective】To construct a prokaryotic expression system of type A Clostridium perfringens phage lysin Cp51, and study its antibacterial activity against C. Perfringens type A in vitro. 【Method】Bacteriophage lysin Cp51 gene was synthesized. The prokaryotic expression vector pET-32a-Cp51 was constructed and transformed into Escherichia coli BL21(DE3). After induction using 0.5 mmol·L–1IPTG, the soluble recombinant protein Cp51 was successfully expressed, and was subsequently purified with Ni2+-NTA affinity chromatography. The antibacterial activity of the recombinant protein Cp51 was detected by kinetic turbidimetric assay. 【Result】The bacteria turbidities of seven strains of C. perfringens type A were effectively reduced by the recombinant protein Cp51. The bactericidal rate was above 99.99% in 30 min after treatment of recombinant protein Cp51 at the concentration of above 5 μg·mL–1. The Cp51 protein had no bactericidal effect against other types of bacteria. 【Conclusion】The recombinant protein of bacteriophage lysine Cp51 has strong bactericidal activity and specificity in vitro against type A C. perfringens, which could provide a basis for clinical application of Cp51 lysin.

Clostridium perfringens; bacteriophage; lysin; protein expression; bactericidal activity

Q939.48；S945.1

A

1001-411X(2017)05-0019-05

呂夢(mèng)娜, 龍航宇, 王麗梅, 等. A型產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶Cp51的原核表達(dá)及活性檢測[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 38(5): 19-23.

2016-11-29 優(yōu)先出版時(shí)間：2017-07-14

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呂夢(mèng)娜(1991—)，女，碩士研究生，E-mail: 793453116@qq.com； 通信作者： 林瑞慶(1973—)，男，副研究員，博士，E-mail: rqlin@scau.edu.cn

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020208099)