羅非魚源蠟樣芽孢桿菌分離、鑒定及藥敏特性研究

楊移斌，余琳雪，劉永濤，楊秋紅，蘇志俊，宋 懌，艾曉輝

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所 武漢 430223；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京100141；3.上海海洋大學(xué)，上海 201306)

羅非魚源蠟樣芽孢桿菌分離、鑒定及藥敏特性研究

楊移斌1，余琳雪3，劉永濤1，楊秋紅1，蘇志俊3，宋 懌2，艾曉輝1

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所 武漢 430223；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京100141；3.上海海洋大學(xué)，上海 201306)

從福建漳州某養(yǎng)殖場患出血病死亡的羅非魚肝臟、腎臟及脾臟分離到一株致病性菌株FJLF。對該菌進(jìn)行了形態(tài)特征觀察、理化特性測定及16S rRNA序列分子鑒定。生理生化特征和16S rRNA基因序列分析結(jié)果顯示，分離到的FJLF株為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。人工感染該菌后發(fā)病魚出現(xiàn)與自然發(fā)病類似癥狀，且從病灶中分離到與原感染菌一致菌株。腹腔注射后該菌株對羅非魚的半致死劑量LD50=2.30×106CFU/g。FJLF株對諾氟沙星、頭孢噻肟、新霉素及卡那霉素等8種抗生素高度敏感；對環(huán)丙沙星、痢特靈、紅霉素及鏈霉素中度敏感；對苯唑西林、青霉素、頭孢拉定及阿莫西林等10種抗生素耐藥。

羅非魚(Oreochromismossambicus)；蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)；分離；鑒定；藥敏特性

羅非魚為鱸形目(Perciformes)鱸形亞目(Percoidei)麗魚科(Cichlaidae)羅非魚屬(Tilapia)，俗稱非洲鯽[1]。目前全世界已有85個國家和地區(qū)在養(yǎng)殖羅非魚[2]，羅非魚已經(jīng)成為世界性養(yǎng)殖品種。在中國羅非魚養(yǎng)殖已經(jīng)成為最重要的漁業(yè)經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)之一，產(chǎn)量連續(xù)多年穩(wěn)居世界第一，主養(yǎng)區(qū)包括廣東、廣西、海南及福建等。羅非魚食性較雜、生長速度快、抗病力及繁殖能力強[3]，深受廣大養(yǎng)殖戶追捧。隨著養(yǎng)殖規(guī)模及密度不斷增加，羅非魚養(yǎng)殖環(huán)境逐漸惡化，導(dǎo)致羅非魚病害尤其是細(xì)菌性病害頻發(fā)，給羅非魚產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。目前已報道的羅非魚細(xì)菌性病害有無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)[4]及海豚鏈球菌(S.iniae)[5]引起的鏈球菌病；類志賀鄰單胞菌(Plesimonasshigelloides)[6]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[7]、溫和氣單胞菌(A.sobria)[8]、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)[9]、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)[10]及綠色氣球菌(Aerococcusviridans)[11]等引起的出血充血類疾??；創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)[12]及維氏氣單胞菌(A.veronii)[13]引起的腸道疾病等。

2016年7月中旬福建漳州某養(yǎng)殖場羅非魚突然出現(xiàn)大量死亡，發(fā)病率在30%左右，死亡率接近50%，發(fā)病水溫為28～32 ℃，養(yǎng)殖水體氨氮0.3 mg/L。亞硝酸鹽0.08 mg/L，pH 7.5。主要臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)病羅非魚離群獨游，反應(yīng)很慢，嘴部、腹部及鰭條基部有充血，肛門紅腫有紅色液體流出，鰓絲鮮紅，無明顯病變；解剖可見肝淡黃色，脂變嚴(yán)重，腎充血發(fā)黑，脾鮮紅，腸道無食物，有大量粘液，有些有腹水。本研究從患病瀕死羅非魚體內(nèi)分離到一株致病菌株，對分離菌株進(jìn)行了鑒定、感染實驗，并測定了其對多種抗生素的敏感性，以期為羅非魚病害防控提供科學(xué)依據(jù)，同時為蠟樣芽孢桿菌的安全使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發(fā)病瀕死羅非魚采自福建漳州某養(yǎng)殖場；健康羅非魚與發(fā)病羅非魚為同一品系，規(guī)格(50±2.0)g，購自廣東臺山羅非魚苗種場，暫養(yǎng)7 d無異常后用于實驗；普通營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、水解酪蛋白瓊脂購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片及細(xì)菌生化微量鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購自上海生工，PCR反應(yīng)體系產(chǎn)品購自Takara 公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離

無菌操作取患病瀕死羅非魚肝臟、腎臟及脾臟用于細(xì)菌分離，用接種環(huán)蘸取樣品在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，置于28 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取形態(tài)特征一致的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。純化好的菌株與25%甘油均勻混合后置于-80 ℃保存。

1.2.2 人工感染及LD50測定

(1)人工感染：將分離菌株接種于營養(yǎng)瓊脂平板，參照麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ蒙睇}水調(diào)整菌濃度為5.2×109CFU/mL。取健康羅非魚分成實驗組和對照組，每組10尾，均設(shè)置2個重復(fù)。實驗組腹腔注射菌液0.1 mL/尾，對照組在相同部位注射等劑量生理鹽水。實驗期間保持水質(zhì)良好，水溫29～30 ℃，溶氧充足。連續(xù)觀察羅非魚活動情況，及時對發(fā)病死亡羅非魚進(jìn)行記錄及解剖觀察，同時進(jìn)行細(xì)菌再分離。

(2)細(xì)菌LD50測定：將分離菌株配制濃度分別為8.0×1010、8.0×109、8.0×108、8.0×107、8.0×106CFU/mL的菌懸液，采取腹腔注射進(jìn)行攻毒研究。實驗組羅非魚分別注射以上濃度菌液，注射劑量為0.1 mL/尾，即每組羅非魚每尾注射劑量為8.0×109、8.0×108、8.0×107、8.0×106、8.0×105CFU，對照組羅非魚腹腔注射等劑量的生理鹽水。連續(xù)觀察并及時記錄羅非魚發(fā)病死亡數(shù)量，用概率單位圖解法[14]計算半致死劑量(LD50)。

1.2.3 形態(tài)學(xué)及生理生化特性測定

將分離菌株劃線于營養(yǎng)瓊脂平板上，觀察菌落形態(tài)特征，并對分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]采用細(xì)菌生化微量反應(yīng)管對分離菌株生化特征進(jìn)行測定。

1.2.4 分離菌株16S rRNA基因序列分析

參照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書，提取DNA作為模板，以通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′擴增細(xì)菌的16S rRNA 基因片段。PCR反應(yīng)條件參照譚愛萍等[16]，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送武漢擎科生物公司純化和測序。將測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行blast比對分析，取同源性較高菌株及水產(chǎn)常見病原菌的16S rRNA 基因序列，通過Clustal x 軟件進(jìn)行多重比對，用Mega5.1軟件中N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 藥敏特性分析

依據(jù)美國NCCLS實驗標(biāo)準(zhǔn)方法[17]，通過K-B法測定分離菌株對22種抗生素的敏感特性。將菌株接種于營養(yǎng)肉湯中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中24 h，調(diào)整菌液濃度為3.0×107CFU/mL。取150 μL菌液均勻涂布于MH瓊脂上，貼上不同的藥敏紙片，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑大小，參照藥敏紙片說明書，判斷菌株的藥物敏感特性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

從發(fā)病瀕死羅非魚的肝臟、腎臟及脾臟分離到同一株高致病菌FJLF。經(jīng)人工感染實驗，實驗組羅非魚出現(xiàn)嘴部、腹部及鰭條基部有充血，肛門處紅腫有大量紅色液體流出，解剖可見腎充血發(fā)黑，脾鮮紅，有大量粘液等癥狀，與自然發(fā)病癥狀類似，感染發(fā)病死亡率為60%，而對照組未出現(xiàn)異常。從感染致死羅非魚肝、腎、脾分離到與菌株FJLF理化特性一致的菌落，故確定分離菌株FJLF為羅非魚病原菌。根據(jù)建立的實驗魚死亡率(%)與分離菌株注射劑量對數(shù)[lg(CFU)]的關(guān)系曲線：y=0.25x-1.515(表1、圖1)，F(xiàn)JLF株對羅非魚的半數(shù)致死劑量LD50=1.15×108CFU/50 g，即LD50=2.30×106CFU/g。

圖1 羅非魚死亡率(%)與細(xì)菌劑量對數(shù) [lg (CFU)]的關(guān)系曲線Fig.1 The relation curve of tilapia mortality with logarithm of bacteria dose

2.2 細(xì)菌鑒定

經(jīng)革蘭氏染色確定菌株FJLF為陽性菌株，詳細(xì)理化特性如表2所述，營養(yǎng)瓊脂上28 ℃培養(yǎng)24 h，出現(xiàn)不光滑、邊緣不規(guī)則的乳白色菌落。具體FJLF菌株理化特性與蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)基本一致。將FJLF株的16S rRNA基因序列測序結(jié)果與NCBI中已有序列進(jìn)行blast比對，結(jié)果顯示FJLF株與芽孢桿菌種類同源性最高，與蠟樣芽孢桿菌相似度為99%。選取同源性高的芽孢桿菌及水產(chǎn)重要病原菌的16S rRNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析(圖2)，菌株FJLF在發(fā)育樹上與蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus聚為一支。綜合判定分離菌株FJLF為蠟樣芽孢桿菌。

表2 菌株FJLF的生理生化試驗結(jié)果Tab.2 Results of biochemical characteristics of strain FJLF

注: “+”- 陽性； “-”-陰性

圖2 FJLF株 16S rRNA 基因序列與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.2 Phylogenetic tree of FJLF 16S rRNA gene sequence and its relatives

2.3 藥敏特性

分離菌株FJLF對22種抗生素的敏感性具體結(jié)果見表3。FJLF株對諾氟沙星、頭孢噻肟、新霉素、卡那霉素、左氧氟沙星、妥布霉素、慶大霉素及丁胺卡那霉素中度敏感；對環(huán)丙沙星、痢特靈、紅霉素及鏈霉素高度敏感；對苯唑西林、青霉素、頭孢拉定、阿莫西林、磺胺異噁唑、氯霉素、氟苯尼考、克林霉素、利福平及多西環(huán)素耐藥。

表3 FJLF株藥敏試驗結(jié)果Tab.3 Antibiotic sensitivity test of strain FJLF

續(xù)表3

注：S-高度敏感；I-中度敏感；R-不敏感

3 討論

3.1 蠟樣芽孢桿菌的分離和鑒定

本研究從患病瀕死羅非魚肝臟、腎臟及脾臟分離到同一株致病菌FJLF，經(jīng)回歸感染實驗，實驗魚感染死亡率達(dá)到60%，并出現(xiàn)與自然發(fā)病相似癥狀，且從感染發(fā)病羅非魚肝腎脾等器官再分離到與FJLF株形態(tài)及理化特征一致的菌株，表明分離菌株FJLF為羅非魚病原菌。通過革蘭氏染色、形態(tài)特征及理化特性測定，菌株FJLF是革蘭氏陽性菌，能產(chǎn)生芽孢，理化特性與蠟樣芽孢桿菌基本一致。細(xì)菌的16S rRNA基因具備高度保守性，但在不同屬細(xì)菌之間具備一定的變異[18]，目前被認(rèn)為是細(xì)菌鑒定的良好工具[19-20]。對分離菌株FJLF 16S rRNA序列測定及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示FJLF株與蠟樣芽孢桿菌同源性最高，并在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一類。綜合細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征、理化特性及16S rRNA基因分析結(jié)果，F(xiàn)JLF株鑒定為蠟樣芽孢桿菌。

3.2 蠟樣芽孢桿菌的危害性

蠟樣芽孢桿菌為芽孢桿菌科芽孢桿菌屬，養(yǎng)殖水體、底泥及空氣等廣泛存在[21]，是革蘭氏陽性菌，兼性好氧，能產(chǎn)生芽孢[22，23]。蠟樣芽孢桿菌常作為病原菌拮抗菌等益生菌[24]，而其又能分泌多種酶類、抗生素及氨基酸等[25]，因此在動保、食品及其他行業(yè)有著極其廣泛的作用。

但隨著對蠟樣芽孢桿菌的研究進(jìn)一步深入，其作為條件致病菌引發(fā)病害的報道逐步增多。蠟樣芽

孢桿菌引發(fā)人及動物多種疾病，包括腹瀉和嘔吐[26]、出血病[27]、角膜炎[28]、急性眼內(nèi)炎[29]、奶牛子宮內(nèi)膜炎與乳房炎[30]及仔豬腹瀉[31]等。針對水產(chǎn)動物，陳紅蓮等[32]報道蠟樣芽孢桿菌引起斑點叉尾鮰暴發(fā)性出血死亡；譚愛萍等[16]報道蠟樣芽孢桿菌引起中華鱉死亡病例；駱?biāo)囄牡萚33]認(rèn)為蠟樣芽孢桿菌是刺參腐皮病的病原；同時也有蠟樣芽孢桿菌引發(fā)鯉鰓弓壞死的報道[34]。本實驗從患病羅非魚體內(nèi)分離到一株蠟樣芽孢桿菌，其對羅非魚的半致死劑量LD50=2.30×106CFU/g，對羅非魚具備較強毒力。鑒于蠟樣芽孢桿菌具備有益菌及致病菌株，在高效利用時應(yīng)當(dāng)明確其安全特性，避免毒株危害食品及生物安全。

3.3 蠟樣芽孢桿菌病的防治

目前，抗生素仍是防控魚類細(xì)菌病害的主要手段。本實驗對分離菌株FJLF的藥敏特性進(jìn)行測定，結(jié)果表明分離菌株對8種抗生素高度敏感，而對14種抗生素中度敏感或耐藥。從實驗結(jié)果得出分離菌株FJLF對慶大霉素、新霉素高度敏感，與陳紅蓮等[32]從斑點叉尾鮰體內(nèi)分離到的蠟樣芽孢桿菌藥敏結(jié)果一致；藥敏實驗結(jié)果與譚愛萍等[16]研究有差異。藥敏實驗結(jié)果存在差異的可能在于菌株來源、地理環(huán)境及用藥情況等不同，導(dǎo)致不同的耐藥結(jié)果。根據(jù)藥敏實驗結(jié)果，參照商品藥硫酸新霉素說明書伴餌投喂，3 d后停止死亡，連續(xù)投喂7 d后，羅非魚恢復(fù)正常攝食，因此使用高度敏感抗生素如新霉素等可以有效防控羅非魚蠟樣芽孢桿菌病，減少經(jīng)濟損失。

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(責(zé)任編輯：鄧 薇)

Isolation,identification and antibiotic sensitivity ofBacilluscereusfrom tilapia

YANG Yi-bin1,YU Lin-xue3,LIU Yong-tao1,YANG Qiu-hong1,SU Zhi-jun3,SONG Yi2,AI Xiao-hui1

(1.YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuhan430223,China;2.ChineseAcademyofFisheryScience,Beijing100141,China;3.ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Bacterial strain FJLF was isolated from diseased tilapia suffered from serious hemorrhage disease at a fish farm in Zhangzhou,Fujian Province,and it was identified asBacilluscereusbased on biochemical reaction characters and 16S rRNA gene sequence analyses.Artificial affected fish by intraperitoneal FJLF-injection showed the same clinic signs as the diseased fish in ponds.Therefore,the isolatedB.cereuswas proved as the main pathogen,and its LD50to tilapia was determined as 2.30×106CFU/g using the probabilistic graphical method.The antibiotic sensitivity test showed that the isolated was very sensitive to norfloxacin,cefotaxime,neomycin,kanamycin,etc.,less sensitive to ciflox,furazolidone,erythrocin,streptomycin1,and not sensitive to oxacillin,penicillin,cefadroxil,amoxicillin etc.

tilapia (Oreochromismossambicus);Bacilluscereus;isolation;identification;antibiotic sensitivity

2016-11-16；

2017-03-06

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-49)；中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(2016ZD1202)

楊移斌( 1988-) ，男，助理研究員，碩士，研究方向為水生動物醫(yī)學(xué)。E-mail：yangyb1988@126.com

艾曉輝，E-mail：aixh@ yfi.ac.cn；宋 懌，E-mail：songyi@cafs.ac.cn

S941.42

A

1000-6907-(2017)04-0051-06