長江上游特有魚類紅唇薄鰍線粒體控制區(qū)遺傳多樣性研究

申紹祎，田輝伍，汪登強(qiáng)，陳大慶，劉紹平

(1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.中國水產(chǎn)科學(xué)院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部長江中上游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，武漢 430223)

長江上游特有魚類紅唇薄鰍線粒體控制區(qū)遺傳多樣性研究

申紹祎1，田輝伍2，汪登強(qiáng)2，陳大慶2，劉紹平2

(1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.中國水產(chǎn)科學(xué)院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部長江中上游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，武漢 430223)

紅唇薄鰍(Leptobotiarubrilabris)是長江上游特有魚類，近年來資源量不斷下降。本研究利用線粒體控制區(qū)序列片段(896 bp)分析了長江上游紅唇薄鰍的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，為其資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。共采集了119尾樣本，來自長江上游江津、四川南溪、岷江下游蕨溪等。結(jié)果顯示，共檢測到58個(gè)單倍型，平均單倍型多樣性為0.967，平均核苷酸多樣性0.006 7，表明紅唇薄鰍種群具有較高的遺傳多樣性。單倍型NETWORK網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖和分析系統(tǒng)樹結(jié)果顯示紅唇薄鰍單倍型不按地理分布聚類，但是明顯分成了2個(gè)譜系，表明紅唇薄鰍群體發(fā)生了同域遺傳分化。AMOVA分析結(jié)果顯示，采樣點(diǎn)和采樣時(shí)間的群體間沒有發(fā)生遺傳分化。中性檢驗(yàn)、錯(cuò)配分析及 BSP(Bayesian skyline plot)分析表明紅唇薄鰍Lineage 1種群在距今0.007 5～0.055 Ma(百萬年)期間發(fā)生過種群選擇或擴(kuò)張事件。

紅唇薄鰍(Leptobotiarubrilabris)；長江上游；線粒體控制區(qū)；遺傳多樣性

紅唇薄鰍(Leptobotiarubrilabris)隸屬鯉形目(Cypriniformes)鰍科(Cobitidae)沙鰍亞科(Botiinae)薄鰍屬(Leptobotia)，俗稱紅魚、紅魚片兒等，體延長，較高，側(cè)扁，頭長，呈錐形，吻較長，唇厚，有許多皺褶。紅唇薄鰍為長江上游特有魚類[1]，就個(gè)體大小而言，在沙鰍亞科中僅次于長薄鰍。因肉質(zhì)細(xì)膩，味道鮮美，其深受人們歡迎而具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。紅唇薄鰍自然資源量不高，又因過度捕撈等原因，使其資源量明顯下降，一些有歷史記載的分布區(qū)，如嘉陵江、烏江、沱江等現(xiàn)今已難覓蹤跡[2-3]。

另一方面，水電梯級(jí)開發(fā)等原因使其生境不斷破碎、萎縮[4-5]，進(jìn)一步威脅紅唇薄鰍的生存。紅唇薄鰍產(chǎn)漂流性卵，其受精胚胎需要一定長度的流水完成發(fā)育過程。當(dāng)前長江上游干流、岷江和金沙江等是紅唇薄鰍主要棲息地和產(chǎn)卵場，但自2012年開始，位于金沙江下游的向家壩水電站正式蓄水，長江上游干支流其它多座水電站也在加緊前期準(zhǔn)備，梯級(jí)電站的實(shí)施開發(fā)，將會(huì)對長江上游水生生物以及珍稀土著魚類造成重大影響[6]，尤其是產(chǎn)漂流性魚卵魚類。因此研究紅唇薄鰍群體遺傳多樣性，對其資源保護(hù)及評估水電工程對其遺傳結(jié)構(gòu)的影響有重要的意義。目前對紅唇薄鰍的研究主要在于資源的調(diào)查[7]，遺傳多樣性研究上僅見微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)[8]和微衛(wèi)星遺傳多樣性分析[9]。

本研究采用線粒體(mt)DNA控制區(qū)序列分析采自長江上游紅唇薄鰍的群體遺傳多樣性，研究其遺傳結(jié)構(gòu)，以期為紅唇薄鰍種質(zhì)保護(hù)和資源恢復(fù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為評估和預(yù)測梯級(jí)電站開發(fā)對長江上游水生動(dòng)物及生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

樣本采自長江上游干流重慶江津江段(JJ)和四川宜賓南溪江段(NX)，以及岷江下游宜賓蕨溪鎮(zhèn)江段(MJ)，共采集紅唇薄鰍119尾，其中93尾采于2010-2012年，26尾采于2015-2016年，具體采樣信息見表1。所有樣本經(jīng)鑒定后剪取胸鰭條，清洗干凈后置入5 mL離心管中以100%乙醇保存密封后帶回實(shí)驗(yàn)室。

表1 紅唇薄鰍采樣點(diǎn)及采樣數(shù)Tab.1 The sample sites information of L.rubrilaris

1.2 基因組 DNA 提取

用高鹽法提取基因組DNA[10]。用瓊脂糖凝膠電泳檢測其基因組DNA的提取質(zhì)量。

1.3 PCR擴(kuò)增及測序

線粒體DNA控制區(qū)片段的引物序列如下: MitDI-F: 5′-CACCCYTRRCTCCCAAAGCYA-3′和MitDI-R: 5′-GGTGCGGRKACTTGCATGTRTAA-3′。PCR 的擴(kuò)增體系為50 μL，其中Mix酶(北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司)25 μL、上下游引物各2 μL，DNA模板2 μL,滅菌雙蒸餾水補(bǔ)至50 μL.PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性 3 min;94 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán);72 ℃ 再延伸 8 min。PCR產(chǎn)物檢測及測序：取2.5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)下觀察拍照，檢測擴(kuò)增效果，擴(kuò)增產(chǎn)物送至測序公司進(jìn)行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用 Lasergene v6軟件包對測序結(jié)果進(jìn)行拼接校對及對位排列。單倍型數(shù)(HN)、變異位點(diǎn)數(shù)(S)、簡約信息位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)(Hd)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)等參數(shù)用DnaSP v5.0[11]計(jì)算，同時(shí)進(jìn)行Tajima’D、Fu’s Fs值檢驗(yàn)、核苷酸錯(cuò)配分析。單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖在Network 4.6.1.0[12]軟件構(gòu)建，并對各個(gè)單倍型進(jìn)行群體對應(yīng)關(guān)系的分析。

序列的轉(zhuǎn)換/顛換比率、統(tǒng)計(jì)其平均堿基組成用MEGA 6.0軟件[13]分析，并構(gòu)建K2-P單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ樹)，系統(tǒng)樹中節(jié)點(diǎn)的自舉置信水平應(yīng)用自引導(dǎo)(Bootstrap) 估計(jì)，循環(huán)驗(yàn)證次數(shù)為1 000。分子變異方差(AMOVA)用Arlequin v3.1[14]軟件進(jìn)行分析，估算遺傳變異在群體間和群體內(nèi)的分布及遺傳分化指數(shù)(FST)，1 000次重復(fù)隨機(jī)抽樣重排后分析其統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。Beast 2.4.3.0進(jìn)行Bayesian Skyline Plots(BSP)分析[15]，采用魚類線粒體控制區(qū)的平均突變率每百萬年3.6%[16]，MCMC長度為15 000 000，在TRACER ver.1.4構(gòu)圖，各項(xiàng)參數(shù)的ESS均大于200。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列變異及多樣性

序列比對后獲得119條紅唇薄鰍線粒體DNA控制區(qū)序列896 bp， A、T、C、G的平均含量分別為36.07%、31.05%、19.75%和13.14%，A+T 含量(67.12%) 遠(yuǎn)大于 G + C 含量(32.88%)，呈現(xiàn)明顯的堿基偏向。共檢測到46個(gè)變異位點(diǎn)，其中10個(gè)為單一變異位點(diǎn)、36個(gè)為簡約信息位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換顛換比例為11.23。3個(gè)采樣點(diǎn)中，變異位點(diǎn)最多的是江津群體(37個(gè))，最少的是南溪群體(30個(gè))。種群平均單倍型多樣性(Hd)為0.967，平均核苷酸多樣性(Pi)0.006 7。單倍型多樣性和核苷酸多樣性指數(shù)均是岷江群體最高(表2)，119條序列共定義58個(gè)單倍型(Genebank登錄號(hào): MF072432-MF072489)，其中頻率最高的是Hap4，擁有14個(gè)個(gè)體(11.76%)，其次是Hap10，擁有10個(gè)個(gè)體(8.40%)，僅出現(xiàn)1次的單倍型有41個(gè)，擁有兩個(gè)以上個(gè)體的單倍型有17個(gè)(表3)。江津群體單倍型數(shù)最多(29個(gè))，南溪群體單倍型數(shù)最少(20個(gè))。

表2 紅唇薄鰍種群遺傳多樣性、Tajima’s D和Fu’s FsTab.2 Genetic diversity parameters and Tajima’s D and Fu’s Fs of L.Rubrilaris population S.多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)，HN.單倍型數(shù)，Hd.單倍型多樣性，Pi.核苷酸多樣性。

注：**表示差異極顯著P<0.01。

表3 紅唇薄鰍單倍型地理分布(僅列頻次為2或以上的單倍型)Tab.3 Distribution of haplotype in sampled sites of L.Rubrilaris(Only haplotypes with two or more samples were listed)

2.2 種群遺傳分化

單倍型NETWORK網(wǎng)絡(luò)連接見圖1，單倍型關(guān)系比較復(fù)雜，形成許多環(huán)形連接，并且出現(xiàn)21個(gè)缺失單倍型(mv1～mv21)。根據(jù)連接單倍型之間的突變步長，可將單倍型劃分為2個(gè)譜系(Lineage 1、Lineage 2)，譜系內(nèi)連接單倍型的突變步長為1～4，譜系間則通過兩條步長為6的路徑來連接。

圖1 紅唇薄鰍線粒體控制區(qū)單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

Fig.1 Haplotype network ofL.rubrilabrismtDNA control region

圓圈大小表示單倍型的頻率；mv代表缺失的單倍型，橙色數(shù)字代表突變步驟

以長薄鰍(L.elongata)為外類群(Genebank登錄號(hào): DQ105271.1；AY017144.1)進(jìn)一步構(gòu)建單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)顯示，紅唇薄鰍群體線粒體控制區(qū)形成兩個(gè)大的分支，支持率為100%。這兩大分支所包含的單倍型分別與NETWORK網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中所劃分兩個(gè)譜系的單倍型完全一致。兩個(gè)譜系的樣本與采樣點(diǎn)沒有明顯的對應(yīng)關(guān)系，換言之，兩個(gè)譜系均包含本研究中3個(gè)采樣點(diǎn)的樣本(表4)。

圖2 紅唇薄鰍線粒體控制區(qū)單倍型 NJ 樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of mt DNA control region in L.rubrilabris

對紅唇薄鰍3個(gè)采樣點(diǎn)群體的控制區(qū)序列作分子變異分析(AMOVA)，結(jié)果顯示，群體遺傳分化指數(shù)FST=0.002 3(P>0.1)，群體內(nèi)的變異占99.77%，變異主要來自群體內(nèi)(表5)，表明紅唇薄鰍3個(gè)采樣點(diǎn)群體間未發(fā)生遺傳分化。為了檢驗(yàn)不同采樣時(shí)間對遺傳結(jié)構(gòu)的影響，本研究對向家壩截流前后樣本進(jìn)行AMOVA分析，結(jié)果FST=-0.0068，即向家壩截流前后采集的樣本沒有發(fā)生遺傳分化。進(jìn)一步對基于NETWORK圖和系統(tǒng)發(fā)育分析劃分的2個(gè)譜系作AMOVA分析，結(jié)果FST=0.659 5(P<0.01)(表5)，兩譜系間具有顯著遺傳分化。

表4 兩個(gè)譜系個(gè)體來源數(shù)目統(tǒng)計(jì)Tab.4 Statistics of the individuals according to the sourcesfor the 2 lineages

表5 紅唇薄鰍群體分子方差分析(AMOVA)Tab.5 Analysis of molecular variance ( AMOVA) of L.rubrilaris

對2個(gè)譜系Lineage 1和Lineage 2遺傳多樣性分析見表2，2個(gè)譜系核苷酸多樣性和單倍型多樣性均低于總樣本。計(jì)算兩譜系的核苷酸變異系數(shù)顯示，Lineage 1和Lineage 2譜系內(nèi)的變異系數(shù)分別為3.795和3.407，譜系間的核苷酸差異系數(shù)為10.562，總樣本的核苷酸差異系數(shù)為6.043。

2.3 種群歷史

采用核苷酸錯(cuò)配分布[17]和中性檢驗(yàn)Tajima’s D[18]、Fu’s Fs等方法分析種群歷史，其中Tajima’s D檢驗(yàn)更傾向于檢測古老的突變和揭示古老種群發(fā)生擴(kuò)張的歷史，而Fu’s Fs檢驗(yàn)則對近期種群擴(kuò)張的檢測更為敏感[19]。基于AMOVA的結(jié)果，紅唇薄鰍采樣點(diǎn)和采集時(shí)間對群體遺傳分化無明顯影響，因此首先將總樣本作種群動(dòng)態(tài)檢驗(yàn)，再分別對基于NETWORK網(wǎng)絡(luò)圖和系統(tǒng)發(fā)育分析的2個(gè)譜系進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，總樣本和Lineage 2堿基錯(cuò)配分布呈多峰結(jié)構(gòu)，Lineage 1為單峰(圖3)；各個(gè)群體的Tajima’s D值均為不顯著負(fù)值,而Fu’s Fs除Lineage2為不顯著負(fù)值外，其余群體的Fu’s Fs均為極顯著負(fù)值(表2)。BSP結(jié)果進(jìn)一步表明，長江上游紅唇薄鰍總?cè)后w和Lineage1歷史上經(jīng)歷了種群選擇或擴(kuò)張事件，時(shí)間在距今0.007 5 ～ 0.055 Ma(百萬年)間。

圖3 紅唇薄鰍的Mis-match分布和BSP分析Fig.3 Mis-match distribution and BSP analysis of L.rubrilabris

3 討論

3.1 紅唇薄鰍種群遺傳多樣性

遺傳多樣性是衡量物種進(jìn)化潛力的重要指標(biāo)，遺傳多樣性越高，表明物種對環(huán)境改變的適應(yīng)能力更強(qiáng)，進(jìn)化潛力越大。與長江上游其它魚類線粒體控制區(qū)遺傳多樣性相比較，如長薄鰍(L.elongata)(Hd=0.916，Pi=0.004 5)[20]、圓筒吻鮈(Rhinogobiocylindricus)(Hd=0.840，Pi=0.011 4)[21]、銅魚(Coreiusheterodon) (Hd=0.849，Pi=0.003 0)[23]和圓口銅魚(C.guichenoti)(Hd=0.902，Pi=0.004 2)[22]等，除了圓筒吻鮈核苷酸多樣性外，紅唇薄鰍的遺傳多樣性均大于這幾種魚，說明紅唇薄鰍遺傳多樣性暫處于較高水平，這與微衛(wèi)星遺傳多樣性的結(jié)果是一致的[9]。

3.2 紅唇薄鰍種群分化及種群歷史

Wright[23]認(rèn)為，若種群FST在 0 ～ 0.05之間，說明種群不存在分化；若0.050.25，則表明分化程度非常高。根據(jù)AMOVA分析來看，紅唇薄鰍3個(gè)采樣點(diǎn)群體間沒有發(fā)生遺傳分化，向家壩截流前后的樣本也沒有發(fā)生遺傳分化。這可能與紅唇薄鰍分布及產(chǎn)卵漂流性卵特征有一定關(guān)系。本課題組在長江上游江津、岷江下游宜賓、赤水河以及金沙江攀枝花江段設(shè)調(diào)查點(diǎn)捕撈魚類卵苗，通過對采集的卵苗進(jìn)行分子生物學(xué)種類鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅在岷江和江津采集到了紅唇薄鰍卵苗，表明長江上游紅唇薄鰍產(chǎn)卵場分布有限、距離較近。其漂流性卵隨水流進(jìn)行擴(kuò)散和發(fā)育，成魚又進(jìn)行洄游，促進(jìn)不同采集地群體間基因交流頻繁。

但是網(wǎng)絡(luò)連接圖(圖1)和NJ樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖2)表明紅唇薄鰍群體出現(xiàn)兩個(gè)分化明顯的譜系，譜系間的核苷酸差異系數(shù)明顯大于譜系內(nèi)，且譜系間FST>0.25(表5)，表明兩個(gè)譜系間的分化程度非常高[23]。這提示紅唇薄鰍種群內(nèi)部存在一定的遺傳分化，這種分化是發(fā)生在同一區(qū)域內(nèi)，即同域遺傳分化(Sympatric Genetic Divergence)。同域遺傳分化現(xiàn)象在其他魚中也有發(fā)現(xiàn)，如進(jìn)入美國阿拉斯加州伍德河流域繁殖的紅大麻哈魚(Oncorhynchusnerka)發(fā)現(xiàn)同域遺傳分化，原因在于不同河段水溫的差異，對紅大麻哈魚的繁殖產(chǎn)生了選擇[24]；又如生活在英國溫德米爾(Windermere)湖的北極紅點(diǎn)鮭(Salvelinusalpinus)在各個(gè)湖區(qū)的群體均發(fā)生了同域遺傳分化，繁殖習(xí)性對此現(xiàn)象的發(fā)生具有重要作用[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)紅唇薄鰍群體同域遺傳分化的現(xiàn)象，是否也因存在某種繁殖習(xí)性上的差異，如產(chǎn)卵場、產(chǎn)卵時(shí)間等還有待進(jìn)一步研究。

堿基錯(cuò)配分布和中性檢驗(yàn)表明紅唇薄鰍Lineage 1發(fā)生過群體擴(kuò)張(圖3和表2)，采用BSP分析顯示Lineage 1擴(kuò)張發(fā)生在距今0.007 5 ～ 0.055 Ma，處于大理亞冰期(1萬—11萬年)[27]時(shí)期。已有研究表明長江上游一些魚類也受冰期影響，種群歷史上發(fā)生過瓶頸和擴(kuò)張現(xiàn)象，如長薄鰍[28]、中華沙鰍[29]、蛇鮈[30]等。但是紅唇薄鰍Lineage 2未檢測到群體擴(kuò)張發(fā)生，該譜系的種群大小低于Lineage 1，遺傳多樣性也相對較低(表2)，暗示Lineage 1可能更適應(yīng)長江生態(tài)環(huán)境的變遷。

3.3 保護(hù)建議

紅唇薄鰍與同屬魚類的長薄鰍相比，分布范圍更為狹窄，資源量更少，因此紅唇薄鰍更容易受到人類活動(dòng)的影響。加上紅唇薄鰍生長潛力小且拐點(diǎn)年齡低，所以應(yīng)該關(guān)注補(bǔ)充群體[3]。由于紅唇薄鰍大小與中華沙鰍相近，容易受到中華沙鰍捕撈的協(xié)同作用影響，以及近年來由于漁業(yè)資源量在不斷減少，漁民為了得到更充足的捕撈量而降低網(wǎng)具規(guī)格，致使捕撈規(guī)格不斷下降，導(dǎo)致尚未性成熟的幼魚個(gè)體被大量捕撈[31]。加上近幾年的野外調(diào)查中，我們并未在這三個(gè)點(diǎn)以外的地域采到紅唇薄鰍樣本，側(cè)面反映出漁業(yè)壓力加大，資源前景不容樂觀，因此持續(xù)對紅唇薄鰍的資源動(dòng)態(tài)進(jìn)行關(guān)注是很有必要的。

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(責(zé)任編輯：張紅林)

Genetic diversity ofLeptobotiarubrilabrisin the upper Yangtze River inferred from mitochondrial control region

SHEN Shao-yi1，TIAN Hui-wu2，WANG Deng-qiang2，CHEN Da-qing2，LIU Shao-ping2

(1.KeyLaboratoryofFreshwaterFishReproductionandDevelopment,MinistryofEducation;theKeyLaboratoryofAquaticScienceofChongqing;SchoolofLifeScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China;2.ScientificObservingandExperimentalStationofFisheryResourcesandEnvironmentintheUpperandMiddleReachesoftheYangtzeRiver,MinistryofAgriculture;YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisheryScience,Wuhan430223,China)

Leptobotiarubrilabrisis a small freshwater fish,endemic in Upper Yangtze River,and its natural resource was decreased in recent years.In this study,mitochondrial control region sequences(896 bp)were used to analysis genetic diversity and structure ofL.rubrilabrispopulation.A total of 119 individuals collected from 3 sites as Jiangjin,Nanxi,Juexi in the Upper Yangtze River were used here.The results showed that 58 haplotypes were identified among sapmles and haplotype diversity and nucleotide diversity were 0.967 and 0.006 7,respetively,indicating moderately high genetic diversity forL.rubrilabrispopulation.Network diagram and phylogenetic NJ tree of haplotype showed that haplotypes were not clustered as the geographical samples,but divided into two lineages,which indicated that there was sympatric genetic divergence in population ofL.rubrilabris.The molecular variance analysis (AMOVA ) showed that there was no genetic differentiation between populations of sampled sites and time.The neutral test ,nucleotide mismatch distribution and Bayesian skyline plot (BSP) analysis showed that historical population expansion had occurred in Lineage 1 ofL.rubrilabris,and the expansion time was deduced in 0.007 5～0.055 Ma before.

Leptobotiarubrilabris;the upper reaches of the Yangtze River;mitochondrial control region;genetic diversity

2017-03-09；

2017-05-25

中國長江三峽集團(tuán)公司資助項(xiàng)目(No.0799570，No.0799574)

申紹祎(1994- )，女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)閯?dòng)物生態(tài)學(xué)。E-mail: ssy144580@163.com。

劉紹平。E-mail: lsp@yfi.ac.cn

S917.4;Q953

A

1000-6907-(2017)04-0083-08